环孢霉素A免疫原、抗环孢霉素A特异性抗体和环孢霉素A检测试剂

摘要

本发明公开了一种环孢霉素A免疫原及其合成方法，以及由该免疫原获得的抗环孢霉素A抗体、检测试剂及其制备方法。本发明制备的环孢霉素A免疫原，免疫原性高，可以诱导得到高效价的抗环孢霉素A特异性抗体，并且与常见的62种药物无任何交叉反应；由该抗体制备得到的环孢霉素A检测试剂，可以精确快速地确定样品中的环孢霉素A含量。与市场上现有的检测试剂比较，本发明检测试剂具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，还能有效降低环孢霉素A检测成本，有利于临床大规模推广使用。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及环孢霉素A免疫原、抗环孢霉素A特异性抗体和环孢霉 素A检测试剂。

背景技术

环孢霉素A(Cyclosporin A)，其结构式如式(Ⅲ)所示：

环孢霉素A是一种真菌源性的高脂溶性环肽类小分子药物，它是一种强有力的免疫抑制 剂，通过对免疫应答过程中多环节的作用，选择性抑制辅助性T淋巴细胞(Th)的增殖及功能， 产生免疫调节作用，是器官移植后起免疫抑制作用的主要药物之一。使用环孢霉素A治疗可 以显著提高皮肤、心脏、肾脏、肝脏、胰腺、骨髓、肺、小肠等器官移植的存活率。此外， 环孢霉素A还可用于多种自身免疫疾病的治疗。环孢霉素A的治疗作用、毒性反应与血药浓 度密切相关，其安全范围窄，服药个体化差异大，低于其有效血药浓度无法起到治疗作用， 过量使用则会引起严重的毒副作用，主要是肾毒性和肝毒性，其它的可逆性反应还包括腹泻、 牙龈增生、恶心、呕吐、多毛症、震颤和高血压等。由于环孢霉素A大多供长期预防性用药， 而肾、肝毒性在肾、肝移植时难以和排异反应相区别。因此，环孢霉素A血药浓度的监测对 于指导器官移植及自身免疫疾病患者的临床安全合理用药有着重要的意义。

目前国内外检测环孢霉素A的方法主要包括：高效液相色谱法、化学发光法、免疫法、 荧光偏振法、电化学发光法、非均相免疫法等，但这些方法在临床应用上都具有一定的缺陷 性。目前市场上缺乏稳定性好、灵敏度高、特异性强的环孢霉素A检测试剂，尤其是质量好 的自动化检验试剂。因此，研发生产质量达到临床要求、实用性强、性价比高，可应用于全 自动生化分析仪的环孢霉素A测定试剂已成为国内外体外诊断试剂行业的热点。

发明内容

本发明为了克服现有技术存在的缺陷，采用全新的环孢霉素A衍生物制备免疫原性强的 环孢霉素A免疫原及其抗体，用该抗体制备的环孢霉素A均相酶免疫检测试剂可以实现在全自 动生化分析仪上对环孢霉素A高通量、快速化的检测。该检测试剂具有操作简便、灵敏度高、 特异性强、结果准确等优点，还能有效降低环孢霉素A检测成本，有利于临床推广使用。

本发明的一个目的在于提供一种环孢霉素A衍生物。

本发明的另一个目的在于提供一种免疫原性强的环孢霉素A免疫原。

本发明的另一个目的在于提供一种环孢霉素A免疫原的制备方法。

本发明的又一个目的在于提供使用本发明环孢霉素A免疫原制备得到的特异性强的抗环 孢霉素A特异性抗体。

本发明的再一个目的在于提供一种环孢霉素A检测试剂。

免疫原性与所合成的环孢霉素A衍生物分子结构及所选载体种类有关，现有技术中环孢 霉素A免疫原的免疫原性较弱，所得到抗体的特异性、与环孢霉素A的结合力，敏感度都不 如本发明。本发明的环孢霉素A免疫原，免疫原性高，可以诱导得到高效价的抗环孢霉素A 特异性抗体。该抗体特异性高，与环孢霉素A的结合力强。由该抗体制备得到的环孢霉素A 检测试剂，可以快速、准确地确定样品中的环孢霉素A含量。本发明是通过以下技术方案实 现的：

一种环孢霉素A免疫原，其结构式如式(Ⅰ)所示：

式中，R为连接基团n是1至20之间的整数，优选R为

载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽，优选为血清蛋白、血蓝蛋白和甲状腺球蛋白，更 优选为血清白蛋白，进一步优选为牛血清白蛋白。

当R为时，该环孢霉素A免疫原的合成途径和方法如下：

1.环孢霉素A衍生物的制备方法：

(1)称取0.08～0.32mmol环孢霉素A和0.08～0.32mmol化合物A，共同溶解于3～6mL  DCM中；称取28～112mg苄基三乙基氯化铵，溶解于3～6mL40％的KOH水溶液中；将 上述两种溶液混合成反应混合溶液。

(2)将上述反应混合溶液在室温下搅拌过夜；将反应后的溶液用HCl调节pH值至 pH＝5.0～7.0，然后将有机层分离。

(3)将有机相浓缩，然后用制备博层色谱法进行纯化，得到4.5～18mg白色固体状的 最终产物，产率50％。

(4)利用核磁共振技术和色谱/质谱技术对得到的最终产物进行分析鉴定，可以确定该 最终所得化合物为环孢霉素A衍生物，其结构式如式(Ⅱ)所示：

式中，R为连接基团n是1至20之间的整数。

本发明中，环孢霉素A衍生物的制备过程的步骤(1)中的化合物A选用了2-(溴甲基) 丙烯酸甲酯为合成原料，故所得的最终产物环孢霉素A衍生物的链接基团R为 当n取其他数值时，选用其他2-(溴甲基)丙烯酸甲酯类似物，例如4-溴-2- 亚甲基丁酸甲酯(n为2)，5-溴-2-亚甲基戊酸甲酯(n为3)，6-溴-2-亚甲基己酸甲酯(n为4) 等进行实验，合成方法完全一致。

2.环孢霉素A免疫原的制备步骤：

(1)将载体蛋白100～300mg溶解于25～75ml0.2M，pH8.5的磷酸缓冲液中；

(2)将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解：100～300mg本发明合成的环孢霉素A衍 生物、1.75～5.25ml二甲基甲酰胺、1.75～5.25ml乙醇、3.5～10.5ml10mM，pH5.0的磷 酸钾缓冲液、100～300mg1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、25～75mg N-羟基硫代琥珀酰 亚胺，将这些化学品在室温下搅拌溶解反应30～60min；

(3)将溶解好的溶液滴加至载体蛋白溶液中，并在2～8℃下搅拌过夜，得到抗原；将 合成好的抗原经过透析进行纯化，得到环孢霉素A免疫原。

本发明中当n取1～20范围内的其他整数时，用上述方法可以制备出如式(Ⅰ)所示的 环孢霉素A免疫原。载体仍为具有免疫原性的蛋白质，可以是血清蛋白，血蓝蛋白和甲状腺 球蛋白。优选的，载体为血清蛋白。更优选的，载体为牛血清白蛋白。

由于连接基团主要起小分子衍生物与载体的连接作用，免疫原性强弱与所合成的环孢霉 素A衍生物分子结构及所选载体种类有关，因此理论上n取1至20之间的任意整数时，环 孢霉素A衍生物制备的环孢霉素A免疫原无显著差异，均具备强免疫原性，都能制备高效价 的特异性抗体。

一种抗环孢霉素A特异性抗体，由上述的环孢霉素A免疫原免疫动物后生产得到。

所述的抗环孢霉素A特异性抗体由上述制得的环孢霉素A免疫原采用常规方法接种实验 动物，加强免疫后取抗血清，具体步骤如下：

(1)用PBS将上述合成的BSA-环孢霉素A免疫原稀释至1.0mg/ml，得到抗原溶液，然 后用1.0ml抗原溶液与弗氏完全佐剂混合，对实验动物进行注射；

(2)2～3周后，再用1.0ml相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂对上述实验动物注射一次， 之后每隔四周注射一次，共计注射4次；

(3)对上述实验动物取血，分离纯化得到效价为1:30000-1:50000的抗环孢霉素A特异性 抗体。

本发明的抗环孢霉素A特异性抗体为完整的抗体分子，也包括保留与环孢霉素A特异性 结合能力的抗体片段或抗体衍生物。

本发明的抗体为采用单一的环孢霉素A免疫原对动物加强免疫所获得的多克隆抗体，或 者为免疫后经体细胞杂交获得的单克隆抗体；所述的实验动物为兔、山羊、小鼠、绵羊、豚 鼠或马的一种，优选为兔。

本发明提供一种环孢霉素A检测试剂，含有上述抗环孢霉素A特异性抗体和指示试剂。

本发明指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂、发光试剂。优选的，指示 试剂为酶试剂，由环孢霉素A酶标偶联物和酶的底物所组成。

上述酶标偶联物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物；上述酶的底物为葡萄糖-6- 磷酸。

环孢霉素A均相酶免疫检测试剂在使用之前，为了避免指示试剂中的酶标偶联物和酶的 底物发生反应，酶标偶联物和酶的底物是不混合的且分开放置，所以将酶的底物与上述抗环 孢霉素A特异性抗体混合在一起。因此，环孢霉素A均相酶免疫检测试剂包括两类试剂：

(1)试剂A由抗环孢霉素A特异性抗体和均相酶底物混合而成，具体制备步骤如下：

1)将2.018～8.072g(5.625～22.50mM)氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、 0.856～3.422g(5.625～22.50mM)葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)用0.5～2L 55mM、pH＝8.0的 Tris缓冲液溶解制成均相酶底物；

2)将制备的抗环孢霉素A特异性抗体加到上述均相酶底物中，抗体与均相酶底物的体 积比为1:100～1:10000，优选为1：400；

(2)试剂B由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物与Tris缓冲液混合而成，制备方法如 下：

1)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)溶液的制备：

a.称取7.5～22.5mg规格为100KU的G6PDH，室温溶解于6～18mL含有72.6mg(0.05 M)Tris、8mg MgCl₂(3.3mM)和100mg NaCl的溶液中，该溶液pH＝9.0；

b.加入112.5～337.5mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，67.5～202.5mg葡 萄糖-6-磷酸(G-6-P)以及0.375～1.125mL卡必醇；

c.逐滴加入1～3mL二甲基亚砜；

2)环孢霉素A衍生物的激活：

a.在无水状态下称取5～15mg环孢霉素A衍生物，溶解于300～900μL DMF中；

b.使上述溶液温度降到-2～-8℃；

c.加入1.5～4.5μL三丁胺；

d.加入0.75～2.25μL氯甲酸异丁酯；

e.-2～-8℃搅拌30～60分钟；

3)G6PDH与环孢霉素A衍生物的连接：

a.将上述激活的环孢霉素A衍生物溶液逐滴加入到上述溶解的G6PDH溶液中；

b.2-8℃搅拌过夜；

4)纯化产物：

通过G-25凝胶层析柱纯化连接产物，获得的最终产物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶 联物，于2-8℃下储存。

5)将制备的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物加到120mM、pH＝8.2的Tris缓冲液中， 上述偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:100～1:10000，优选为1：1500。

本发明的环孢霉素A免疫原特异性强、免疫原性高，制备出的抗环孢霉素A特异性抗体 特异性强、效价高，并且与常见的62种药物无任何交叉反应；含有上述抗环孢霉素A特异 性抗体的均相酶免疫检测试剂可以方便、快速、准确地确定样品中的环孢霉素A含量，并且 可以在全自动生化分析仪上同时测定多个样品，实现环孢霉素A的高通量快速化测定，准确 度高，特异性强，精确度和检测效率相比之前都有了较大的提高，同时实现了检测过程的全 自动化，对检测人员的要求不高，易于实现和推广使用。

附图说明

图1环孢霉素A衍生物的分析鉴定谱图；

图2是环孢霉素A的ELISA检测反应曲线；

图3是环孢霉素A的均相酶免疫反应曲线。

具体实施方式

实施例一 环孢霉素A衍生物的合成及其分析鉴定

环孢霉素A衍生物的化学结构如式(Ⅳ)所示：

上述环孢霉素A衍生物的合成路线及制备步骤如下：

1.称取200mg(0.16mmol)环孢霉素A和29.2mg(0.16mmol)2-(溴甲基)丙烯酸甲酯， 共同溶解于3mL DCM中；称取56mg(0.24mmol)苄基三乙基氯化铵，溶解于3mL40％的 KOH水溶液中；将上述两种溶液混合成反应混合溶液。

2.将上述反应混合溶液在室温下搅拌过夜；将反应后的溶液用HCl调节PH值至PH＝6， 然后将有机层分离。

3.将有机相浓缩，然后用制备博层色谱法(prep-TLC)进行纯化，得到9mg白色固体 状的最终产物，产率50％。

4.利用高效液相色谱(HPLC)和质谱(MSD)技术对得到的最终产物进行分析鉴定， 结果如附图1所示，可以确定该最终所得化合物为式(Ⅳ)所示的环孢霉素A衍生物。

本实施例中，环孢霉素A衍生物的制备过程的步骤1中选用了2-(溴甲基)丙烯酸甲酯为 合成原料，故所得的最终产物环孢霉素A衍生物的链接基团R为当选用 其他2-(溴甲基)丙烯酸甲酯类似物，如4-溴-2-亚甲基丁酸甲酯、5-溴-2-亚甲基戊酸甲酯、6- 溴-2-亚甲基己酸甲酯等进行实验，合成方法完全一致，连接基团R中n为2-20中的任意整 数。

实施例二 环孢霉素A免疫原的合成

环孢霉素A免疫原由牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)与式(Ⅱ)所示的 环孢霉素A衍生物的基团连接而成，在本实施例中，以n＝1为例详细说 明该免疫原的合成方法，具体步骤如下：

1.将牛血清白蛋白200mg溶解于50ml0.2M，pH8.5的磷酸缓冲液中；

2.将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解：200mg合成的环孢霉素A衍生物、3.5ml二 甲基甲酰胺、3.5ml乙醇、7.0ml10mM，pH5.0的磷酸钾缓冲液、200mg1-乙基-3-(-3-二 甲氨丙基)碳二亚胺、50mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，将这些化学品在室温下搅拌溶解反应30 min；

3.将溶解好的溶液滴加至BSA溶液中，并在2～8℃下搅拌过夜，得到抗原；将合成好 的抗原经过透析进行纯化，得到环孢霉素A免疫原。

实施例三：抗环孢霉素A特异性抗体的制备

将实施例二制备得到的环孢霉素A免疫原采用常规方法接种实验动物兔，加强免疫后取 抗血清，具体步骤如下：

1.用PBS将上述合成的环孢霉素A免疫原稀释至1.0mg/ml，得到抗原溶液，然后用1.0 ml抗原溶液与弗氏完全佐剂混合，对实验动物兔进行注射。

2.2～3周后，再用1.0ml相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂对上述实验动物兔注射一 次，之后每隔四周注射一次，共计注射4次。

3.对步骤2的实验动物兔取血，分离纯化得到效价为1:30000-1:50000的抗环孢霉素A 特异性抗体。

实施例四：环孢霉素A的ELISA检验

1.环孢霉素A的ELISA检测标准曲线的建立

(1)标准品的制备

将环孢霉素A粉末(购于Sigma公司)溶解于甲醇溶液，制备成1mg/ml的储存液。用 ELISA缓冲液将储存液依次稀释为400.00ng/mL、150.00ng/mL、50.00ng/mL、15.00ng/mL、 5.00ng/mL和0.00ng/mL的标准溶液。其中，ELISA缓冲液含有50.0mM Tris，145mM NaCl 和0.25％的BSA。

(2)利用环孢霉素A的ELISA检验方法制备标准曲线

用PBS将实施例三中所制备的抗环孢霉素A抗体稀释成1:8000的终浓度溶液，100μ L/孔包被在96孔酶联板上，4℃放置12-24h；用PBS将上述包被有抗环孢霉素A抗体的96 孔酶联板洗涤3次后，加入200μL/孔的0.5％的BSA溶液，4℃封闭放置8-16h。然后用 PBS洗涤3次，加入20μL/孔的标准品。再加入100μL/孔工作浓度的HRP-环孢霉素A偶 联物；室温下孵育30min后PBS洗板5次；然后每孔加入100μL TMB底物，室温孵育30min。 再每孔加入100μL终止液(2M硫酸)。测定450nm的吸光值。根据各标准品所对应的450 nm的吸光值定标，制作标准曲线，结果如附图2所示。

2.待测样品中环孢霉素A含量的检测

(1)制作待测样品

制备方法：将环孢霉素A粉末(购于Sigma公司)溶解于甲醇溶液制成1μg/mL的储存 液，并将此储存液稀释于空白全血中，至终浓度分别为0.00，5.00，50.00，400.00ng/mL， 形成空白、低、中、高浓度的全血样本。该空白全血为不含环孢霉素A的健康人血液。

(2)测试方法

利用上述环孢霉素A的ELISA检验方法，将上述空白、低、中、高浓度的全血样本代替 标准品，测试上述空白、低、中、高浓度的全血样本在450nm的吸光值。

(3)测试结果

对照图1中所示的环孢霉素A的ELISA检验的标准曲线，计算每个样本中环孢霉素A含 量，并对每个样本进行3个复孔测定，根据上述样本中环孢霉素A的实际含量计算回收率， 结果如表1所示。

表1 环孢霉素A的ELISA检测回收实验

由表1中结果可知：采用本发明环孢霉素A的ELISA检测试剂测定不同浓度样品中的环 孢霉素A回收率都较高，均＞90％，说明本发明所述的抗环孢霉素A特异性抗体可以用于样 本中环孢霉素A的检测，并且结果准确度高。

实施例五：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物的制备

1.葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)溶液的制备：

(1)准确称取15mg规格为100KU的G6PDH，室温溶解于12mL含有72.6mg(0.05 M)Tris、8mg MgCl₂(3.3mM)和100mg NaCl的溶液中，该溶液pH＝9.0，本步骤在烧杯C 中进行。

(2)在上述烧杯C中加入225mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，135mg 葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)以及0.75mL卡必醇(Carbitol)。

(3)在上述烧杯C中再逐滴加入2mL二甲基亚砜(dimethy sulfoxide，DMSO)。

2.环孢霉素A衍生物的激活：

(1)在无水状态下称取10mg上述环孢霉素A衍生物，溶解于600μL DMF中。

(2)使上述溶液温度降到-2～-8℃。

(3)加入3μL三丁胺(tributylamine)。

(4)加入1.5μL氯甲酸异丁酯(isobutylchloroformate)。

(5)-2～-8℃搅拌30分钟。

3.G6PDH与环孢霉素A衍生物的连接：

(1)将上述激活的环孢霉素A衍生物溶液逐滴加入到上述溶解的G6PDH溶液中。

(2)2-8℃搅拌过夜。

4.纯化产物：

通过G-25凝胶层析柱纯化步骤3中的溶液，获得的最终产物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半 抗原偶联物，于2-8℃下储存。

实施例六：环孢霉素A均相酶免疫检测试剂的制备

1.试剂A的制备：将4.036g(11.25mM)氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、 1.711g(11.25mM)葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)置于烧杯D中，用1L 55mM、pH＝8.0的Tris 缓冲液溶解制成均相酶底物；将上述制备的抗环孢霉素A特异性抗体加到上述均相酶底物中， 抗体与均相酶底物的体积比为1:400。

2.试剂B的制备：将实施例五制备的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物加到120mM、 pH＝8.2的Tris缓冲液中，上述偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:1500。

实施例七：环孢霉素A均相酶免疫检验及结果

1.获得标准曲线：

(1)设置迈瑞BS-480全自动生化分析仪反应参数(见表2)。

(2)操作步骤为：先加试剂A，再加入标准品，最后加入试剂B。加入试剂B后，测定 不同时间点的OD₃₄₀吸光值，算出不同标准品浓度时的反应速率，实际操作过程中需不断调 整试剂A和试剂B的体积比例，同时调整测光点，最后得出较理想的反应标准曲线图，如图 3所示。

表2 迈瑞BS-480全自动生化分析仪反应参数

2.样本检测：通过本发明的均相酶免疫检测试剂得到的标准曲线，重复测定低、中、高 浓度质控样本10次，上述质控样本为：将环孢霉素A标准品溶解于人全血中，至浓度分别 为20.0，200.0，800.0ng/ml。检测数据及数据分析见表3。

表3 样品测定及精密度和回收率评估

血液样品 低 中 高 样品浓度(ng/ml) 20.0 200.0 800.0 1 20.2 201.4 805.2 2 19.3 203.5 793.1 3 20.7 198.0 811.9 4 20.9 203.6 795.2 5 19.8 202.7 805.7 6 20.7 199.4 808.5 7 20.3 197.5 792.0 8 19.9 204.2 810.1 9 19.0 201.8 789.9 10 20.5 203.6 800.6 平均值(ng/ml) 20.13 201.57 802.48 标准差(SD) 0.6273 2.4554 8.1482 精密度(CV％) 3.12 1.22 1.02 回收率％ 100.7 100.8 100.3

检测结果：本发明的均相酶免疫检测试剂测定的准确度高，回收率达到95％-105％，精 密度高，CV均低于5％。

实施例八：药物干扰试验

选取62种常见药物进行干扰检测，调整浓度至1.00μg/ml，采用实施例七的均相酶免疫 方法进行测定：

1.将待测干扰药物与实施例六制备的试剂A接触反应，再加入试剂B；

2.检测上述混合溶液的OD₃₄₀吸光值，根据实施例七的标准曲线得到相应物质的浓度。

常见的62种药物名称以及测定结果具体参见表4。

表4 常见干扰药物测定结果

测定结果显示：上述62种常见药物等价于环孢霉素A的浓度均小于0.01μg/ml。由此可 见，本发明的抗体是抗环孢霉素A的特异性抗体，与其它药物无交叉反应。