一种巴戟天耐斯糖含量测定方法

摘要

本发明提供一种利用软件扫描薄层图像测定巴戟天耐斯糖薄层定量检测方法，利用梯形积分法对色谱峰进行积分，根据峰面积和样品浓度的关系进行定量分析。该方法操作简单，可以代替传统薄层扫描仪。

说明书

技术领域

本发明涉及医药领域，尤其是涉及一种巴戟天耐斯糖薄层定量检测方法。

背景技术

中药巴戟天为双子叶植物茜草科巴戟天Morinda officinalis How的干燥根。巴戟天药食 同源，《神农本草经》将其归为上品，也是中国著名的“四大南药”之一。性甘、辛、微温， 归肾、肝经，具有补肾阳，强筋骨，祛风湿的功能，用于阳痿遗精，宫冷不孕，月经不调， 少腹冷痛，风湿痹痛，筋骨痿软等。

近年来对巴戟天的化学研究表明其中含有蒽醌、环烯醚萜及其苷类、有机酸、糖类等成 分。其中占有绝对含量优势的寡糖是其主要的活性成分，其它成分含量较少。研究报导巴戟 天中分离的寡糖具有抗氧化、抗应激、抗抑郁、抑制凋亡等药理活性。因此，寡糖含量成为 药材质量优劣的一个重要指标。由于寡糖类成分没有强紫外吸收，常规的紫外检测器不适合 测定分析。对于寡糖类的检测多采用示差折光、蒸发光散射、脉冲安培、荷电气溶胶、质谱 等方法，除此之外，采取柱后衍生化检测荧光的方法也可用于其测定分析。目前测定方法多 需要昂贵精密的仪器及复杂的样品处理过程。

薄层色谱技术以其快速、低成本、高信息量、低技术门槛在现代分析如医药、食品、化 工领域仍居于重要地位。本发明的目的在于提供一种基于薄层色谱的含量测定方法，新方法 利用软件扫描薄层图像而代替传统薄层扫描仪。

发明内容

本发明提供一种利用软件扫描薄层图像测定巴戟天耐斯糖薄层定量检测方法。该方法操 作简单，可以代理传统薄层扫描仪。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种巴戟天耐斯糖薄层定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)溶液制备：包括巴戟天供试品溶液和耐斯糖对照品溶液；

(2)展开及显色：将所得供试品溶液和对照品溶液条带状点样至高效薄层预制板上，以 乙酸乙酯-甲醇-水-冰醋酸为展开剂进行展开并晾干，将薄层板浸入含有浓硫酸的乙酸乙酯石 油醚的混合溶液的显色剂中数秒，取出晾干，置于薄层加热板上至斑点清晰；

(3)成像及图像处理：将经步骤2显色的薄层板置于紫外灯下拍照，将照片导入图像处 理软件，软件对样品条带进行扫描，分离RGB值并进行逐行累加，然后利用梯形积分法对色 谱峰进行积分，根据峰面积和样品浓度的关系进行定量分析。

步骤(1)中所述的供试品溶液制备方法：将巴戟天细粉用含水甲醇或水超声提取15-30 分钟，滤过，滤液并定容即得。所述的含水甲醇为50-80％甲醇，优选60％甲醇。

优选将巴戟天药材干燥粉碎成细粉，用水或60％甲醇超声提取20分钟，滤过，滤渣用水 洗涤，合并滤液定容即可。

优选取巴戟天药材使用前置于60℃干燥箱内过夜，粉碎并过20目筛，精密称定，置于 锥形瓶中，加水超声80kHz提取20min，滤过，滤渣以少许水洗涤，合并滤液并定容，摇匀， 通过0.45μm微孔滤膜，取续滤液制得供试品溶液20mg/ml。

所述对照品制备：取耐斯糖对照品，精密称定，加水溶解并稀释至刻度，摇匀制得每含 1.586mg/mL耐斯糖的对照品储备液。精密吸取适量加水稀释制得系列浓度对照品溶液。所 述的系列浓度分别为1.190、0.893、0.670和0.446mg/mL

本发明步骤(2)中所述的展开剂乙酸乙酯-甲醇-水-冰醋酸＝8:3：(2-2.5)：3，优选乙酸乙 酯-甲醇-水-冰醋酸＝8:3:2.3:3。展开剂中水的比例对耐斯糖的R_f值影响较大，但是过低的有 机相比例会引起条带的过度扩散而影响分离度。

显色剂的均匀程度直接影响到定量结果的分析及准确性，因为显色剂的选择及配比对于 薄层色谱来说是非常重要的，为了保证显色剂的均匀与不引起斑点的扩散，本发明步骤(2) 中优选显色剂：含有1-2.5％浓硫酸的乙酸乙酯石油醚5-7:5-3的混合溶液，加热显色5-12min。 进一步优选显色剂为2％浓硫酸的乙酸乙酯石油醚7:3的混合溶液，并采用浸板的方式，加热 10分钟显色。显色剂中的浓硫酸的浓度对色谱峰信号有影响，浓度为2％时色谱峰信号较强， 且不会引起斑点糊化。

本发明所述的薄层板是预制硅胶板GF254，优选预制SIL G-25UV₂₅₄薄层板。

本发明步骤(2)的所述的点样方法，条带状点样，条带宽度：4mm；条带间距：10mm； 距底边距离：8mm；点样量：2μL。

本发明步骤(2)优选点样后的薄层板，在展开前需要干燥4h以上。

本发明步骤(3)中所述的拍照是指在紫外灯下拍照参数：曝光时间2000-6000ms，增益 1.0，累积关闭。优选曝光5000ms。

本发明步骤(3)中所述的薄层图像导入至图形处理软件中对各条带进行数码扫描，分离 RGB值并进行逐行累加利用梯形积分法获得相应色谱峰的积分值。

所述的图形处理软件是指，优选TLC Image Processor软件，更优选TLC Image Processor3.0 版软件

所述的RGB值是指构成图像像素的红、绿、蓝三原色的值，三种值相互叠加可得到各式 各样的颜色。

所述的梯形积分法是指：将色谱峰按照一定的步长划分为尽可能多的区间，每个区间的 面积可以近似的用梯形面积计算公式求得，色谱峰的面积等于各区间面积之和。划分的区间 数越多，误差越小，公式为：在区间[a,b]上，

本发明的有益效果

1、由于显色的均匀程度直接影响到定量结果的分析，为了保证显色剂的均匀与不引起斑 点的扩散，本发明的第一个重要附加技术特征在于用1-2.5％浓硫酸的乙酸乙酯石油醚 5-7:5-3的混合溶液浸板的方式进行显色。

2、为了降低检测的成本，不依赖于精密昂贵的检测器，本发明的第二个重要附加技术特 征在于利用软件扫描薄层图像的方式代替传统的薄层扫描仪：图像导入软件后，对选取条带 进行逐行像素扫描，分别累加各自的RGB值及总值，输出包含色谱峰的曲线至窗口中，然后 利用梯形积分法对色谱峰进行积分获取峰面积。

3、为了降低薄层板背景的干扰，本发明的第三个重要附加技术特征在于利用分离出的红 色通道(R)数值进行积分计算，这是由于薄层板背景偏蓝色，使用分离出的红色值可避免背 景干扰，有效避免了基线的漂移。

为了更好的体现上述有益效果，通过下述试验例说明

本发明建立了一种不依赖于薄层扫描仪的薄层定量方法，以软件代替实体扫描仪，对巴 戟天中耐斯糖含量进行了测定，方法学验证显示该法具有良好的专属性、精密度、稳定性及 准确度，可作为一种快速、低成本、低门槛的定量检测方法，可用于巴戟天药材质量控制。 2010版中国药典规定，巴戟天药材的耐斯糖含量不得低于2％。实际收集的样品中，只有批号 为130501的一批药材不符合规定。经与其他药材外形比对分析发现，该药材比较细，推测原 因为生长年份较短，次生代谢产物积累不够。

试验例一、方法学考察

1.材料、试剂与仪器

1.1.标准品

耐斯糖(批号：AWG0714，纯度99.0％)，日本和光纯药工业株式会社

蔗糖(批号111507-201303：，纯度99.8％)，中国食品药品检定研究院

葡萄糖(批号110833-201303：，纯度100％)，中国食品药品检定研究院

果糖(批号100231-201305：，纯度99.4％)，中国食品药品检定研究院

1.2.试剂

乙酸乙酯、甲醇、冰醋酸分析纯均购自广州化学试剂厂，水由三重蒸馏水系统制得。

1.3.样品收集

巴戟天药材收集自广东省德庆市药材市场，品种经广州万正药业有限公司谢培山教授鉴 定为Morinda officinalis How。批号分别为100201,100401,100701,110401,120201, 130501,130801,130901,131101,140401。

1.4.主要仪器

BT25S型电子天平(十万分之一)，德国赛多利斯集团

SZ-97A型自动三重纯水蒸馏器，上海亚荣生化仪器厂

KQ-500TDE型高频数控超声仪，昆山市超声仪器有限公司

ATS-4薄层自动点样器，瑞士CAMAG公司

TLC薄层板加热器III，瑞士CAMAG公司

TLC观察仪，瑞士CAMAG公司

2.试验方法

2.1.工作溶液的配制

2.1.1.系列浓度对照品溶液的配制

取耐斯糖对照品约15mg，精密称定，置于10mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度， 摇匀制得每mL含1.586mg耐斯糖的对照品储备液。精密吸取适量加水稀释制得系列浓度对 照品溶液。

2.1.2.供试品溶液的配制

巴戟天药材使用前置于60℃干燥箱内过夜，粉碎并过20目筛，取约0.5g，精密称定， 置于锥形瓶中，加20mL水，超声(80kHz)提取20min，滤过，滤渣以少许水洗涤，合并 滤液并定容至25mL，摇匀，通过0.45μm微孔滤膜，取续滤液制得供试品溶液。

2.2.分析方法

2.2.1.薄层色谱条件

薄层板：预制SIL G-25UV₂₅₄薄层板，10×15cm；条带宽度：4mm；条带间距：10mm； 距底边距离：8mm；点样量：2μL；预饱和时间：15min；展开剂：乙酸乙酯-甲醇-水-冰醋 酸(8:3:2.3:3,v/v/v/v)；展距：展至上边缘处；显色剂：含有2％浓硫酸的乙酸乙酯石油 醚混合液(7:3，v/v)，浸染式；显色加热时间：10min；观察仪拍照参数：曝光时间-5000ms， 增益-1.0，累积-关闭。

2.2.2.图像处理

像素为715×1087的BMP薄层图像导入至自编TLC Image Processor 3.0版软件中对各 条带进行数码扫描，获得相应色谱峰的积分值。

2.3.方法学考察

2.3.1.专属性试验

将供试品溶液线状点样于薄层板上展开，对薄层板进行部分显色，刮取与耐斯糖具有相 同R_f值的未显色部分，用水溶解，过滤，点样，以正丁醇-异丙醇-水-冰醋酸(7:5:2:1)为 展开剂进行二次展开，第一次展开至70mm处，第二次至100mm处，验证斑点是否单一。

另取对照品储备液适量，加硫酸至0.1M，水解4h，检测水解产物是否干扰测定。

2.3.2.检测限、定量限和标准曲线的绘制

取耐斯糖对照品溶液适度稀释，按照上述分析方法测定，扫描信号的峰高相当于噪音的 3倍时的溶质量为方法的检测限，10倍时为方法的定量限。

取适量母液加水逐级稀释制得系列浓度分别为1.190、0.893、0.670和0.446mg/mL的 另外4个浓度点。以耐斯糖的浓度为横坐标(x)，耐斯糖斑点像素红色通道曲线积分面积为 纵坐标(y)绘制标准曲线并考察相关系数。

2.3.3.精密度试验

取浓度为0.446、0.893和1.586mg/mL的对照品溶液，分别于同一薄层板上连续点样6 次，以积分峰面积为指标考察板内精密度。板间精密度为将三个浓度对照品溶液分别点于5 块不同薄层板上，同样以峰面积为考察指标。精密度用对照品溶液的板内和板间的相对标准 偏差(RSD)表示，相对标准偏差要求不大于5％。

2.3.4.重复性试验

取同一批巴戟天样品6份，按照供试品溶液制备方法平行操作，并按上述分析方法测定 分析，根据随行标准曲线计算含量结果和RSD值。

2.3.5.稳定性试验

取上述供试品溶液，在室温下(25℃)下放置0，8，16，24，32，40，48h后按上述分 析方法测定分析，根据随行标准曲线计算含量结果和RSD值。放置时间应该超过单个批次样 品等待分析所需要的时间。

2.3.6.加样回收试验

取已知耐斯糖含量的巴戟天药材9份，分别精密加入相当于药材含量的50％，100％，150％ 的耐斯糖对照品，每个浓度点3份，按照供试品溶液制备方法制备，并按上述测定分析方法 测定计算回收率和RSD值。

3.试验结果

3.1.专属性试验

以正丁醇-异丙醇-水-冰醋酸(7:5:2:1)为展开剂展开后，刮板得到的样品仍为单一的 规则的斑点，R_f约为0.45。耐斯糖在0.1M硫酸溶液中水解4h，得到最终水解产物单糖， 结果见附图2，分子结构中相差1个糖分子对R_f值的影响较大，如单糖和双糖的R_f值相差近 0.1。因此，方法采用展开剂能够对耐斯糖起到较好的分离效果，且其水解产物并不会对测定 产生干扰，方法专属性良好。

3.2.检测限、定量限及标准曲线

信噪比(Signal to noise ratio，S/N)为3时，条带上的溶质量，即检测限为224ng， S/N为10时，条带上的溶质量，即定量限为747ng。取5个梯度浓度的耐斯糖对照品溶液， 按照上述分析方法进行测定，以数码扫描红色通道曲线的峰面积为纵坐标(y)，以耐斯糖对 照品溶液的浓度(mg/mL)为横坐标(x)，通过线性回归得到的标准曲线方程为：y＝16455.6 *x–1095，R²＝0.9945。耐斯糖在0.446-1.586mg/mL浓度浓度范围内，线性关系良好。

3.3.精密度试验

板内精密度和板间精密度的结果如表1所示，低中高三个浓度的耐斯糖对照品溶液的RSD 均在5％范围之内，方法精密度良好。

Table 1.耐斯糖精密度试验结果

3.4.重复性试验

取批号为100201的巴戟天样品6份，按照供试品溶液制备方法平行制备样品溶液，并依 上述分析方法分析测定耐斯糖的含量，6个结果的RSD为2.98％，方法重复性良好。

3.5.稳定性试验

取批号为100201的巴戟天样品，按照供试品溶液制备方法制备样品溶液，于制备后0-48 h之间每隔8h测定一次，7个测定结果的RSD为2.66％，样品在48小时内稳定性良好。

3.6.加样回收试验

取批号为130501的巴戟天药材0.5g，分别加入相当于药材耐斯糖含量的50％，100％和 150％量的耐斯糖对照品，按照上述方法制备溶液并分析测定，低中高三个加样水平试验所得 加样回收率均在95％-105％之间，如表2所示，RSD为2.77％，方法的准确度良好。

Table 2.加样回收率试验

3.7.多批次样品测定分析

将10批巴戟天药材按照供试品溶液制备方法制备，按照上述分析方法测定分析，耐斯糖 含量结果见表3，数码扫描图如图4所示。

Table 3.多批次药材定量分析结果

本发明建立了一种不依赖于薄层扫描仪的薄层定量方法，以软件代替实体扫描仪，对巴 戟天中耐斯糖含量进行了测定，方法学验证显示该法具有良好的专属性、精密度、稳定性及 准确度，可作为一种快速、低成本、低门槛的定量检测方法，可用于巴戟天药材质量控制。 试验例二、试验条件的优选

本发明以耐斯糖的扫描峰面积为优化指标采取单因素法对试验条件包括样品的制备，显 色剂浓度，图片采集参数均作了筛选和优化，数据见表4。实验比较了60％乙醇和纯水的提取 效果，结果显示纯水的提取效率较高。提取方式考察了超声提取与热回流，超声提取方便快 捷且不会降低提取率。提取时间实验显示，提取20分钟含量已达峰值，且第二次提取液的耐 斯糖含量已低于方法的检测限度。展开剂中水的比例对耐斯糖的R_f值影响较大，但是过低的 有机相比例会引起条带的过度扩散二影响分离度。实验对显色剂中硫酸浓度进行了考察，浓 度为2％时色谱峰信号较强，且不会引起斑点糊化。图像采集的曝光时间为5000ms时，色谱 峰信号较强，且峰形较好。

表4实验条件优化结果

附图说明

图1为本发明原理及检测流程图：低聚糖水解为单糖，在硫酸作用下脱水形成共轭系统而获 得紫外吸收，利用激发后产生的荧光强度进行测定分析。

图2为耐斯糖水解产物鉴别结果：1.葡萄糖，2.果糖，3.蔗糖，4.耐斯糖，S.巴戟天对 照药材，5.耐斯糖水解产物。

图3为软件分离像素RGB代码：前半段代码用于分析荧光的图像，后半段代码用于分析可见 光下采集的图像。

图4为基于薄层图像的软件扫描图：耐斯糖与前后色谱峰均可达到基线分离，R_f为0.35。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明，但不对本发明的权利要求范围进行限制。

实施例1

(1)对照品溶液制备：取耐斯糖对照品约15mg，精密称定，置于10mL容量瓶中，加60％ 乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀制得每mL含1.586mg耐斯糖的对照品储备液。精密吸取适量 加60％乙醇稀释制得其它浓度点对照品溶液。

供试品溶液制备：取巴戟天药材(批号：100201)置于60℃干燥箱内过夜，粉碎并过 20目筛，取约0.5g，精密称定，置于锥形瓶中，加20mL 60％乙醇，超声(80kHz)提取20 min，滤过，滤渣以少许60％乙醇洗涤，合并滤液并定容至25mL，摇匀，通过0.45μm微孔 滤膜，取续滤液制得供试品溶液。

(2)将2μL工作溶液条带状点样于预制SIL G-25UV₂₅₄薄层板上(10×15cm)，底边距8mm， 条带宽度4mm，条带间距10mm。放入盛有五氧化二磷的减压干燥器内干燥4h以上，取出， 置于双槽展开缸中，加展开剂(乙酸乙酯:甲醇:水:冰醋酸＝8:3:2.3:3,v/v/v/v)预报和15 min，展开至板上边缘，取出，冷空气吹干，将板浸入含有2％浓硫酸的乙酸乙酯石油醚混合 液(7:3，v/v)中约3秒钟，取出晾干，置于薄层加热板上105℃加热10min。

(3)将薄层板置于TLC观察仪中，于366nm紫外灯下采集图像，曝光时间5000ms， 增益：1.0，累积：关闭。将采集的像素为715×1087的BMP薄层图像导入至自编TLC Image  Processor 3.0版软件中对各条带进行数码扫描，获得相应色谱峰的积分值。

根据峰面积与耐斯糖浓度的线性关系进行定量分析，测得批号为100201的巴戟天药材中 耐斯糖的含量为4.09％。

实施例2

(1)对照品溶液制备：取耐斯糖对照品约15mg，精密称定，置于10mL容量瓶中，加水溶 解并稀释至刻度，摇匀制得每mL含1.586mg耐斯糖的对照品储备液。精密吸取适量加水稀 释制得其它浓度点对照品溶液。

供试品溶液制备：取巴戟天药材(批号：100201)置于60℃干燥箱内过夜，粉碎并过 20目筛，取约0.5g，精密称定，置于锥形瓶中，加20mL水，超声(80kHz)提取20min， 滤过，滤渣以少许水洗涤，合并滤液并定容至25mL，摇匀，通过0.45μm微孔滤膜，取续 滤液制得供试品溶液。

(2)将2μL工作溶液条带状点样于预制SIL G-25UV₂₅₄薄层板上(10×15cm)，底边距8mm， 条带宽度4mm，条带间距10mm。放入盛有五氧化二磷的减压干燥器内干燥4h以上，取出， 置于双槽展开缸中，加展开剂(乙酸乙酯:甲醇:水:冰醋酸＝8:3:2:3,v/v/v/v)预报和15min， 展开至板上边缘，取出，冷空气吹干，将板浸入含有1％浓硫酸的乙酸乙酯石油醚混合液(5:5， v/v)中约3秒钟，取出晾干，置于薄层加热板上105℃加热5min。

(3)将薄层板置于TLC观察仪中，于366nm紫外灯下采集图像，曝光时间2000ms， 增益：1.0，累积：关闭。将采集的像素为715×1087的BMP薄层图像导入至自编TLC Image  Processor 3.0版软件中对各条带进行数码扫描，获得相应色谱峰的积分值。

根据峰面积与耐斯糖浓度的线性关系进行定量分析，测得批号为100201的巴戟天药材中 耐斯糖的含量为4.17％。

实施例3

(1)对照品溶液制备：取耐斯糖对照品约15mg，精密称定，置于10mL容量瓶中，加水溶 解并稀释至刻度，摇匀制得每mL含1.586mg耐斯糖的对照品储备液。精密吸取适量加水稀 释制得其它浓度点对照品溶液。

供试品溶液制备：取巴戟天药材(批号：100201)置于60℃干燥箱内过夜，粉碎并过 20目筛，取约0.5g，精密称定，置于锥形瓶中，加20mL水，超声(80kHz)提取20min， 滤过，滤渣以少许水洗涤，合并滤液并定容至25mL，摇匀，通过0.45μm微孔滤膜，取续 滤液制得供试品溶液。

(2)将2μL工作溶液条带状点样于预制SIL G-25UV₂₅₄薄层板上(10×15cm)，底边距8mm， 条带宽度4mm，条带间距10mm。放入盛有五氧化二磷的减压干燥器内干燥4h以上，取出， 置于双槽展开缸中，加展开剂(乙酸乙酯:甲醇:水:冰醋酸＝8:3:2.5:3,v/v/v/v)预报和15 min，展开至板上边缘，取出，冷空气吹干，将板浸入含有2.5％浓硫酸的乙酸乙酯石油醚混 合液(6:4，v/v)中约3秒钟，取出晾干，置于薄层加热板上105℃加热8min。

(3)将薄层板置于TLC观察仪中，于366nm紫外灯下采集图像，曝光时间6000ms， 增益：1.0，累积：关闭。将采集的像素为715×1087的BMP薄层图像导入至自编TLC Image  Processor 3.0版软件中对各条带进行数码扫描，获得相应色谱峰的积分值。

根据峰面积与耐斯糖浓度的线性关系进行定量分析，测得批号为100201的巴戟天药材中 耐斯糖的含量为4.23％。

实施例4

(1)对照品溶液制备：取耐斯糖对照品约15mg，精密称定，置于10mL容量瓶中，加水溶 解并稀释至刻度，摇匀制得每mL含1.586mg耐斯糖的对照品储备液。精密吸取适量加水稀 释制得其它浓度点对照品溶液。

供试品溶液制备：取巴戟天药材(批号：100201)置于60℃干燥箱内过夜，粉碎并过 20目筛，取约0.5g，精密称定，置于锥形瓶中，加20mL水，超声(80kHz)提取20min， 滤过，滤渣以少许水洗涤，合并滤液并定容至25mL，摇匀，通过0.45μm微孔滤膜，取续 滤液制得供试品溶液。

(2)将2μL工作溶液条带状点样于预制SIL G-25UV₂₅₄薄层板上(10×15cm)，底边距8mm， 条带宽度4mm，条带间距10mm。放入盛有五氧化二磷的减压干燥器内干燥4h以上，取出， 置于双槽展开缸中，加展开剂(乙酸乙酯:甲醇:水:冰醋酸＝8:3:2.5:3,v/v/v/v)预报和15 min，展开至板上边缘，取出，冷空气吹干，将板浸入含有2.5％浓硫酸的乙酸乙酯石油醚混 合液(6:4，v/v)中约3秒钟，取出晾干，置于薄层加热板上105℃加热8min。

(3)将薄层板置于TLC观察仪中，于366nm紫外灯下采集图像，曝光时间6000ms， 增益：1.0，累积：关闭。将采集的像素为715×1087的BMP薄层图像导入至自编TLC Image  Processor 3.0版软件中对各条带进行数码扫描，获得相应色谱峰的积分值。

根据峰面积与耐斯糖浓度的线性关系进行定量分析，测得批号为100201的巴戟天药材中 耐斯糖的含量为4.27％。

实施例5

(1)对照品溶液制备：取耐斯糖对照品约15mg，精密称定，置于10mL容量瓶中，加水溶 解并稀释至刻度，摇匀制得每mL含1.586mg耐斯糖的对照品储备液。精密吸取适量加水稀 释制得其它浓度点对照品溶液。

供试品溶液制备：取巴戟天药材(批号：100201)置于60℃干燥箱内过夜，粉碎并过 20目筛，取约0.5g，精密称定，置于锥形瓶中，加20mL水，超声(80kHz)提取20min， 滤过，滤渣以少许水洗涤，合并滤液并定容至25mL，摇匀，通过0.45μm微孔滤膜，取续 滤液制得供试品溶液。

(2)将2μL工作溶液条带状点样于预制SIL G-25UV₂₅₄薄层板上(10×20cm)，底边距8mm， 条带宽度4mm，条带间距10mm。放入盛有五氧化二磷的减压干燥器内干燥4h以上，取出， 置于双槽展开缸中，加展开剂(乙酸乙酯:甲醇:水:冰醋酸＝8:3:2.5:3,v/v/v/v)预报和15 min，展开至板上边缘，取出，冷空气吹干，将板浸入含有2％浓硫酸的乙酸乙酯石油醚混合 液(7:3，v/v)中约3秒钟，取出晾干，置于薄层加热板上105℃加热12min。

(3)将薄层板置于TLC观察仪中，于366nm紫外灯下采集图像，曝光时间4000ms， 增益：1.0，累积：关闭。将采集的像素为715×1087的BMP薄层图像导入至自编TLC Image  Processor 3.0版软件中对各条带进行数码扫描，获得相应色谱峰的积分值。

根据峰面积与耐斯糖浓度的线性关系进行定量分析，测得批号为100201的巴戟天药材中 耐斯糖的含量为4.33％。