改变细胞命运的方法及其应用

摘要

本发明公开了改变细胞命运的方法。该方法包括使所述细胞过表达具有选自下列氨基酸序列的蛋白质：(a)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的一部分；(c)与(a)和(b)中所示氨基酸序列具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，进一步优选至少99％序列同一性的氨基酸序列。利用该方法能够使细胞过表达Srebp-1家族蛋白，进而能够有效促进c-Myc结合到Oct4等多能性基因启动子上，提高多能性基因的表达，从而能够有效地改变细胞命运尤其是促进体细胞的重编程。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的，本发明涉及改变细胞命运的方法，及其由该方法 获得的构建体以及细胞。

背景技术

随着干细胞研究的深入，科学家们发现终末分化的哺乳动物细胞也是具有全能性的，成 体细胞可以被重编程，改变基因表达谱从而改变它的命运，重新拥有多能性或者直接转分化 变成另一种细胞。早期体细胞重编程的方法主要有两种：核移植和细胞融合，但是这两种方 法仍然需要涉及到胚胎，在伦理方面受到极大的限制。2006年，日本Yamanaka实验室在重 编程领域获得了突破性的研究成果，发现通过外源表达四个转录因子Sox2,Oct4,Klf4和 c-Myc可以使小鼠成纤维细胞重编程为多能干细胞(iPSC)，为干细胞研究开拓了一个新的 方向，并因此获得诺贝尔奖。随后的短短几年间，体细胞重编程领域的进展异常迅猛。虽然 诱导多能干细胞研究初期遇到许多问题，包括外源癌基因插入，效率低下，甚至还有自体免 疫反应等问题，但是各种改进方法的提出大大促进了重编程技术的机制及应用研究。通过方 法改进使重编程的体细胞不仅仅是小鼠成纤维细胞，重编程技术被应用到各种物种及细胞 中。科学家们还筛选出各种重编程因子组合，不仅提高了重编程效率与质量，而且还避免了 癌基因的插入，并且还发展了蛋白诱导，小分子化合物诱导等方法。

重编程技术的目标就是在临床上解决病人特异的多能细胞的大量获得难题。科学家已经 在实验室成功用重编程技术和基因修复技术治疗了镰刀型贫血的小鼠。虽然这个技术离临床 还很遥远，但是科学家们已经成功诱导出许多单基因突变疾病的病人iPS细胞，用作药物筛 选和基因修复。重编程和发育分化一样是细胞命运的改变。但是在细胞向其他细胞转变的过 程中发生了什么，也是人们迫切想知道的。

然而，目前如何改变细胞命运尤其是促进体细胞的重编程，仍有待进一步研究。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。 为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效改变细胞命运尤其是促进体细胞的重编程的 方法。

首先，需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

细胞中存在复杂的信号通路来调控脂代谢，涉及到许多转录因子，蛋白酶及受体。许多 与脂肪酸，甘油三酯及胆固醇合成相关的酶都受到固醇调节元件结合蛋白(SREBPs)的调控。 Srebps属于膜结合的碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链(bHLH-zip)转录因子家族。Srebp家族主要 由两个基因编码，分别是Srebp-1与Srebp-2。Srebp-1基因位于11号染色体而Srebp-2基因 位于15号染色体。Srebp-1由第一个外显子的选择性剪切产生两个异构体为Srebp-1a与 Srebp-1c。与其他bHLH-zip转录因子不同的是Srebps除了可以结合该家族转录因子结合的 E-box序列(CANNTG，N代表任意碱基)，还有结合到固醇调控序列(SRE,TCACNCCAC)的 能力，而这种结合能力主要由结构域中的一个酪氨酸控制。与大多数转录因子不同的是 SREBPs合成后首先是由大约1150个氨基酸组成的无活性的前体结合在内质网膜上，主要由 三个功能域组成：(1)大约480个氨基酸组成的转录激活域，包括氨基端的激活域及DNA 结合区；(2)两个疏水的跨膜部分；(3)约590个氨基酸的羧基端调节域。当受到激活信号 后，锚定在内质网的前体会通过包含两个步骤的分裂过程释放氨基端的转录激活结构域进入 细胞核，即产生有活性的核内形式。一旦激活入核，Srebps蛋白激活许多下游脂代谢相关基 因表达，从而促进许多脂肪酸，甘油三酯及胆固醇合成。Srebps蛋白的入核受到许多信号调 控，主要是胞质胆固醇，胰岛素及非饱和脂肪酸浓度。进入细胞核后Srebps蛋白活性也受 到许多翻译后修饰的调控，包括乙酰化，磷酸化及泛素化。Srebps除了调控脂代谢稳态外， 还与许多其他转录因子或者蛋白相互协作，激活其他的信号通路，甚至可以参与到表观遗传 调控中。同时，越来越多的数据说明Srebps还与许多生理活动和疾病有关，包括免疫反应， 自噬，癌症和糖尿病，并且Srebp-1对某些癌细胞的生成及增值是必须的。尽管Srebp家族 蛋白已经被研究得比较清楚了，但是它们还有许多重要功能或作用机理需要我们继续探索。

在对体细胞重编程的机理研究中，发现了重编程各个时期发生的标志性事件，包括重编 程早期的间充质到上皮样细胞的转换(MET)及MET之前的EMT，依赖氧化磷酸化的代谢 方式到依赖糖酵解的厌氧代谢的转化，部分重编程细胞(Pre-iPS)及后期组蛋白H3K9甲基 化的变化等表观遗传学变化。同时还逐渐阐明了各个重编程因子的作用机制，例如Oct4在 整个重编程过程中都有重要作用，最初被认为是不可替代的因子。Klf4主要是通过TGFβ 信号通路影响MET，Sox2主要在重编程晚期作用，c-Myc主要在前期作用不仅下调了体细 胞相关基因表达，促进增殖与代谢转化，还有助于其他三个因子对下游靶点的结合。体细胞 重编程是细胞命运转变的过程，涉及到许多复杂的机制，虽然目前已经对其机制有了部分了 解，但是距离完全阐明还有很长的路要走。

而本发明的发明人，发现并鉴定出Srebp-1蛋白的过表达可以促进体细胞重编程的效率。 因而，发明人认为，Srebp-1蛋白的这个新功能可以用来研究细胞命运变化。进而，发明人 发现，Srebp-1蛋白的过表达能够有效改变细胞命运尤其是促进体细胞的重编程。

由此，本发明有效地提出了一种能够改变细胞命运尤其是促进体细胞的重编程的方法。

需要说明的是，在本文中所使用的术语“细胞命运”是指从一种细胞类型向另一种细胞 类型的转变，包括体细胞的重编程、转分化以及干细胞的分化。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种改变细胞命运的方法。根据本发明的实施例， 该方法包括使所述细胞过表达具有选自下列氨基酸序列的蛋白质：(a)SEQ ID NO：1所示 的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的一部分；(c)与(a)和(b)中所 示氨基酸序列具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，进一步优选至少99％序列 同一性的氨基酸序列。

其中，SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列为Srebp-1蛋白的氨基酸序列，具体为： MDELAFGEAALEQTLAEMCELDTAVLNDIEDMLQLINNQDSDFPGLFDAPYAGGETG DTGPSSPGANSPESFSSASLASSLEAFLGGPKVTPAPLSPPPSAPAALKMYPSVSPFSPGP GIKEEPVPLTILQPAAPQPSPGTLLPPSFPAPPVQLSPAPVLGYSSLPSGFSGTLPGNTQQ PPSSLPLAPAPGVLPTPALHTQVQSLASQQPLPASAAPRTNTVTSQVQQVPVVLQPHFI KADSLLLTAVKTDAGATVKTAGISTLAPGTAVQAGPLQTLVSGGTILATVPLVVDTDK LPIHRLAAGSKALGSAQSRGEKRTAHNAIEKRYRSSINDKIVELKDLVVGTEAKLNKS AVLRKAIDYIRFLQHSNQKLKQENLTLRSAHKSKSLKDLVSACGSGGGTDVSMEGMK PEVVETLTPPPSDAGSPSQSSPLSFGSRASSSGGSDSEPDSPAFEDSQVKAQRLPSHSRG MLDRSRLALCVLAFLCLTCNPLASLFGWGILTPSDATGTHRSSGRSMLEAESRDGSNW TQWLLPPLVWLANGLLVLACLALLFVYGEPVTRPHSGPAVHFWRHRKQADLDLARG DFPQAAQQLWLALQALGRPLPTSNLDLACSLLWNLIRHLLQRLWVGRWLAGQAGGL LRDRGLRKDARASARDAAVVYHKLHQLHAMGKYTGGHLAASNLALSALNLAECAG DAISMATLAEIYVAAALRVKTSLPRALHFLTRFFLSSARQACLAQSGSVPLAMQWLCH PVGHRFFVDGDWAVHGAPPESLYSVAGNPVDPLAQVTRLFREHLLERALNCIAQPSPG AADGDREFSDALGYLQLLNSCSDAAGAPACSFSVSSSMAATTGPDPVAKWWASLTA VVIHWLRRDEEAAERLYPLVEHIPQVLQDTERPLPRAALYSFKAARALLDHRKVESSP ASLAICEKASGYLRDSLASTPTGSSIDKAMQLLLCDLLLVARTSLWQRQQSPASVQVA HGTSNGPQASALELRGFQHDLSSLRRLAQSFRPAMRRVFLHEATARLMAGASPARTH QLLDRSLRRRAGSSGKGGTTAELEPRPTWREHTEALLLASCYLPPAFLSAPGQRMSML AEAARTVEKLGDHRLLLDCQQMLLRLGGGTTVTSS(SEQ ID NO：1)

发明人惊奇地发现，利用本发明的改变细胞命运的方法，使细胞过表达Srebp-1蛋白， 能够有效促进c-Myc结合到Oct4等多能性基因启动子上，提高多能性基因的表达，从而能 够方便有效地改变细胞命运尤其是促进体细胞的重编程。此外，根据本发明的实施例，该方 法简单易行，效率高，可重复性好。

根据本发明的实施例，所述细胞为体细胞或干细胞。由此，能够显著有效地改变体细胞 或干细胞的细胞命运。

根据本发明的实施例，进一步包括使所述细胞表达Sox、Klf4、Oct4和c-Myc的至少一 种。由此，能够有效促进c-Myc结合到Oct4等多能性基因启动子上，提高多能性基因的表 达，从而能够有效地改变细胞命运尤其是促进体细胞的重编程。

根据本发明的实施例，所述细胞表达Sox、Klf4、Oct4和c-Myc。由此，能够有效促进 c-Myc结合到Oct4等多能性基因启动子上，提高多能性基因的表达，从而能够有效地改变 细胞命运尤其是促进体细胞的重编程。

根据本发明的实施例，所述细胞进一步表达c-Myc。由此，能够有效促进c-Myc结合到 Oct4等多能性基因启动子上，提高多能性基因的表达，从而能够有效地改变细胞命运尤其 是促进体细胞的重编程。

根据本发明的实施例，使细胞过表达Srebp-1蛋白的方法不受特别限制，例如可以向细 胞中引入能够表达Srebp-1蛋白的基因即可。根据本发明的一些具体示例，向细胞中引入具 有选自下列之一核苷酸序列的核苷酸分子：(a)SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；(b)SEQ  ID NO：2所示的核苷酸序列的一部分；(c)与(a)和(b)中所示核苷酸序列具有至少80％， 优选至少90％，更优选至少95％，进一步优选至少99％序列同一性的核苷酸序列；(d)在 严谨条件下，能够与(a)或(b)中所示核苷酸序列的至少之一或其互补序列杂交的核苷酸 序列。

其中，SEQ ID NO：2所示核苷酸序列为Srebp-1蛋白的编码基因的序列，具体为： ATGGACGAGCTGGCCTTCGGTGAGGCGGCTCTGGAACAGACACTGGCCGAGATGT GCGAACTGGACACAGCGGTTTTGAACGACATCGAAGACATGCTCCAGCTCATCAA CAACCAAGACAGTGACTTCCCGGGCCTGTTTGACGCCCCCTATGCTGGGGGTGAGA CAGGGGACACAGGCCCCAGCAGCCCAGGTGCCAACTCTCCTGAGAGCTTCTCTTCT GCTTCTCTGGCCTCCTCTCTGGAAGCCTTCCTGGGAGGACCCAAGGTGACACCTGC ACCCTTGTCCCCTCCACCATCGGCACCCGCTGCTTTAAAGATGTACCCGTCCGTGT CCCCCTTTTCCCCTGGGCCTGGGATCAAAGAGGAGCCAGTGCCACTCACCATCCTA CAGCCTGCAGCGCCACAGCCGTCACCGGGGACCCTCCTGCCTCCGAGCTTCCCCGC ACCACCCGTACAGCTCAGCCCTGCGCCCGTGCTGGGTTACTCGAGCCTGCCTTCAG GCTTCTCAGGGACCCTTCCAGGAAACACTCAGCAGCCACCATCTAGCCTGCCGCTG GCCCCTGCACCAGGAGTCTTGCCCACCCCTGCCCTGCACACCCAGGTCCAAAGCTT GGCCTCCCAGCAGCCGCTGCCAGCCTCAGCAGCCCCTAGAACAAACACTGTGACC TCACAGGTCCAGCAGGTCCCAGTTGTACTGCAGCCACACTTCATCAAGGCAGACTC ACTGCTGCTGACAGCTGTGAAGACAGATGCAGGAGCCACCGTGAAGACTGCAGGC ATCAGCACCCTGGCTCCTGGCACAGCCGTGCAGGCAGGTCCCCTGCAGACCCTGGT GAGTGGAGGGACCATCTTGGCCACAGTACCTTTGGTTGTGGACACAGACAAACTG CCCATCCACCGACTCGCAGCTGGCAGCAAGGCCCTAGGCTCAGCTCAGAGCCGTG GTGAGAAGCGCACAGCCCACAATGCCATTGAGAAGCGCTACCGGTCTTCTATCAA TGACAAGATTGTGGAGCTCAAAGACCTGGTGGTGGGCACTGAAGCAAAGCTGAAT AAATCTGCTGTCTTGCGCAAGGCCATCGACTACATCCGCTTCTTGCAGCACAGCAA CCAGAAGCTCAAGCAGGAGAACCTGACCCTACGAAGTGCACACAAAAGCAAATCA CTGAAGGACCTGGTGTCAGCTTGTGGCAGTGGAGGAGGCACAGATGTGTCTATGG AGGGCATGAAACCCGAAGTGGTGGAGACGCTTACCCCTCCACCCTCAGACGCCGG CTCACCCTCCCAGAGTAGCCCCTTGTCTTTTGGCAGCAGAGCTAGCAGCAGTGGTG GTAGTGACTCTGAGCCCGACAGTCCAGCCTTTGAGGATAGCCAGGTCAAAGCCCA GCGGCTGCCTTCACACAGCCGAGGCATGCTGGACCGCTCCCGCCTGGCCCTGTGTG TACTGGCCTTTCTGTGTCTGACCTGCAATCCTTTGGCCTCGCTTTTCGGCTGGGGCA TTCTCACTCCCTCTGATGCTACGGGTACACACCGTAGTTCTGGGCGCAGCATGCTG GAGGCAGAGAGCAGAGATGGCTCTAATTGGACCCAGTGGTTGCTGCCACCCCTAG TCTGGCTGGCCAATGGACTACTAGTGTTGGCCTGCTTGGCTCTTCTCTTTGTCTATG GGGAACCTGTGACTAGGCCACACTCTGGCCCGGCTGTACACTTCTGGAGACATCGC AAACAAGCTGACCTGGATTTGGCCCGGGGAGATTTCCCCCAGGCTGCTCAACAGCT GTGGCTGGCCCTGCAAGCGCTGGGCCGGCCCCTGCCCACCTCAAACCTGGATCTGG CCTGCAGTCTGCTTTGGAACCTCATCCGCCACCTGCTCCAGCGTCTCTGGGTGGGC CGCTGGCTGGCAGGCCAGGCCGGGGGCCTGCTGAGGGACCGTGGGCTGAGGAAGG ATGCCCGTGCCAGTGCCCGGGATGCGGCTGTTGTCTACCATAAGCTGCACCAGCTG CATGCCATGGGCAAGTACACAGGAGGACATCTTGCTGCTTCTAACCTGGCACTAAG TGCCCTCAACCTGGCTGAGTGCGCAGGAGATGCTATCTCCATGGCAACACTGGCAG AGATCTATGTGGCAGCGGCCCTGAGGGTCAAAACCAGCCTCCCAAGAGCCCTGCA CTTCTTGACACGTTTCTTCCTGAGCAGCGCCCGCCAGGCCTGCCTAGCACAGAGCG GCTCGGTGCCTCTTGCCATGCAGTGGCTCTGCCACCCTGTAGGTCACCGTTTCTTTG TGGACGGGGACTGGGCCGTGCACGGTGCCCCCCCGGAGAGCCTGTACAGCGTGGC TGGGAACCCAGTGGATCCGCTGGCCCAGGTGACCCGGCTATTCCGTGAACATCTCC TAGAGCGAGCGTTGAACTGTATTGCTCAGCCCAGCCCAGGGGCAGCTGACGGAGA CAGGGAGTTCTCAGATGCCCTTGGATATCTGCAGTTGCTAAATAGCTGTTCTGATG CTGCCGGGGCTCCTGCTTGCAGTTTCTCTGTCAGCTCCAGCATGGCTGCCACCACT GGCCCAGACCCAGTGGCCAAGTGGTGGGCCTCACTGACAGCTGTGGTGATCCACT GGCTGAGGCGGGATGAAGAGGCAGCTGAGCGCTTGTACCCACTGGTAGAGCATAT CCCCCAGGTGCTGCAGGACACTGAGAGACCCCTGCCCAGGGCAGCTCTGTACTCCT TCAAGGCTGCCCGGGCTCTGCTGGACCACAGAAAGGTGGAATCTAGCCCAGCCAG CCTGGCCATCTGTGAGAAGGCCAGTGGGTACCTGCGGGACAGCTTAGCCTCTACAC CAACTGGCAGTTCCATTGACAAGGCCATGCAGCTGCTCCTGTGTGATCTACTTCTT GTGGCCCGTACCAGTCTGTGGCAGCGGCAGCAGTCACCAGCTTCAGTCCAGGTAG CTCACGGTACCAGCAATGGACCCCAGGCCTCTGCTCTGGAGCTGCGTGGTTTCCAA CATGACCTGAGCAGCCTGCGGCGGTTGGCACAGAGCTTCCGGCCTGCTATGAGGA GGGTATTCCTACATGAGGCCACAGCTCGGCTGATGGCAGGAGCAAGTCCTGCCCG GACACACCAGCTCCTGGATCGCAGTCTGAGGAGGAGGGCAGGTTCCAGTGGCAAA GGAGGCACTACAGCTGAGCTGGAGCCACGGCCCACATGGCGGGAGCACACCGAG GCCCTGCTGTTGGCATCCTGCTATCTGCCCCCTGCCTTCCTGTCGGCTCCTGGGCAG CGAATGAGCATGCTGGCCGAGGCGGCACGCACCGTAGAGAAGCTTGGCGATCACC GGCTACTGCTGGACTGCCAGCAGATGCTCCTGCGCCTGGGCGGCGGAACCACCGT CACTTCCAGCTAG(SEQ ID NO：2)

由此，能够使细胞高效地过表达Srebp-1家族蛋白，进而能够有效促进c-Myc结合到 Oct4等多能性基因启动子上，提高多能性基因的表达，从而能够有效地改变细胞命运尤其 是促进体细胞的重编程。

根据本发明的又一方面，本发明提供了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包 括第一核酸分子，所述第一核酸分子编码具有选自下列之一氨基酸序列的蛋白质：(a)SEQ  ID NO：1所示的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的一部分；(c)(a) 与(b)中所示氨基酸序列具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，进一步优选至 少99％序列同一性的氨基酸序列。

发明人惊奇地发现，利用本发明的构建体能够有效地将上述编码Srebp-1蛋白的相关基 因引入受体细胞，并使受体细胞成功过表达Srebp-1蛋白，进而能够有效促进c-Myc结合到 Oct4等多能性启动子上，提高多能性基因的表达，从而能够有效地改变细胞命运尤其是促 进体细胞的重编程。

根据本发明的实施例，所述第一核酸分子的序列不受特别限制，只要能够使被引入的受 体细胞能够有效过表达Srebp-1蛋白即可。根据本发明的实施例，所述第一核酸分子包括具 有选自下列之一核苷酸序列的核苷酸分子：(a)SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；(b)SEQ  ID NO：2所示的核苷酸序列的一部分；(c)与(a)和(b)中所示核苷酸序列具有至少80％， 优选至少90％，更优选至少95％，进一步优选至少99％序列同一性的核苷酸序列；(d)在 严谨条件下，能够与(a)或(b)中所示核苷酸序列的至少之一或其互补序列杂交的核苷酸 序列。由此，利用该构建体能够有效地将上述编码Srebp-1蛋白的相关基因引入受体细胞， 并使受体细胞高效地过表达Srebp-1蛋白，进而能够有效改变细胞命运尤其是促进体细胞的 重编程。

在本发明中所使用的术语“构建体”是指这样的一种遗传载体，其包含特定核酸序列， 并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中，使目的核酸序列整合到宿主细胞的基因组上，以 获得重组细胞。根据本发明的实施例，构建体的形式不受特别限制。根据本发明的实施例， 所述构建体呈选自质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒以及病毒的至少一种的形式。根据本发 明的具体示例，构建体呈质粒的形式。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片 段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线 性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。在本 发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包 括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。对于用于 构建重组细胞的构建体，优选所述核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定， 并且易于操作。

根据本发明的再一方面，本发明提供了一种用于调节细胞中c-Myc结合到Oct4、Nanog 和Rex1多能性基因启动子的水平的方法。其中，需要说明的是，多能性基因启动子的种类 不受特别的限制，只要是能与c-Myc结合的多能性基因启动子即可。根据本发明的实施例， 该方法包括向细胞中引入前面所述的构建体，以便在所述细胞中过表达具有选自下列之一氨 基酸序列的蛋白质：(a)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO：1所示的氨 基酸序列的一部分；(c)与(a)和(b)中所示氨基酸序列具有至少80％，优选至少90％， 更优选至少95％，进一步优选至少99％序列同一性的氨基酸序列。根据本发明的实施例，利 用本发明的方法，能够使细胞过表达Srebp-1蛋白，进而能够有效用于改变细胞中c-Myc结 合到Oct4等多能性基因启动子的能力。

根据本发明的又一方面，本发明提供了一种改变细胞多能性基因Oct4、Nanog和Rex1 表达水平的方法。其中，需要说明的是，本发明的多能性基因的种类不受限制，只要能通过 本发明的下述方法改变多能性基因的表达水平即可，例如Oct4、Nanog和Rex1基因。根据 本发明的实施例，该方法包括向细胞中引入前面所述的构建体，以便在所述细胞中过表达具 有选自下列之一氨基酸序列的蛋白质：(a)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；(b)SEQ ID  NO：1所示的氨基酸序列的一部分；(c)与(a)和(b)中所示氨基酸序列具有至少80％， 优选至少90％，更优选至少95％，进一步优选至少99％序列同一性的氨基酸序列。

发明人惊奇地发现，利用本发明的方法，能够使细胞过表达Srebp-1蛋白，进而能够有 效用于提高细胞多能性基因表达。

根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种重组细胞。根据本发明的实施例，与野生 型细胞相比，该细胞过表达具有选自下列之一氨基酸序列的蛋白质：(a)SEQ ID NO：1所 示的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的一部分；(c)(a)与(b)中所示 氨基酸序列具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，进一步优选至少99％序列同 一性的氨基酸序列。根据本发明的实施例，本发明的细胞能够过表达Srebp-1蛋白，重编程 效率高，从而能够有效用作研究细胞命运变化的模型。

需要说明的是，在本文中所使用的术语“严谨条件”是指形成特异性杂交体而不形成非 特异性杂交体的条件。典型的严谨条件例如可以举出在钾浓度约25mmol/L～约50mmol/L 以及镁浓度约1.0mmol/L～约5.0mmol/L中，进行杂交的条件。作为本发明的条件的示例， 可以举出在Tris-HCl(pH8.6)、25mmol/L的KCl以及1.5mmol/L的MgCl₂下进行杂交的条件， 但是不限于此。此外，严谨条件被记载在Molecular Cloning 3rd(J.Sambrook et al.，Cold Spring  Harbor Lab.Press，2001)中。该文献通过参照并入本说明书。本领域技术人员可以通过改变 杂交反应、杂交反应液的盐浓度等，来容易地选择上述条件。)(说明书中描述：“同一性” 是本领域所熟知的，是指两个或多个核酸序列之间经序列比较后决定的关系；在本领域中， “同一性”也指核酸分子序列之间的序列相关程度，由这些序列的碱基匹配程度决定；“同 一性”可以根据已知的方法容易地计算出，这些方法包括，但不限于，描述于Computer  Molecular Biology，Lesk编辑，牛津大学出版，纽约1993；Biocomputing：Infornatics and Genome  Projects，Smith编辑，Academic出版，纽约1988；Computer Analysis of Sequence Data，第 一部分，Griffin和Griffin编辑，Humana出版，新泽西，1994；Sequence Analysis in Molecular  Biology，von Heinje，Academic出版1987；Sequence Analysis Primer，Gribskov和Devereux 编辑，Stockton出版，纽约1991；和Carillo和Lipman，SIAM J，应用数学，48：1073，1988。)。

需要说明的是，本发明的改变细胞命运尤其是促进体细胞的重编程的方法是本申请的发 明人经过艰苦的创造性劳动和不断的优化工作才完成的。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明 显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和 容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例，在四因子SKOM基础上单独过表达Srebp-1蛋白的 Srebp-1蛋白促进重编程实验的结果示意图；

图2显示了根据本发明一个实施例，Srebp-1蛋白对MEF细胞c-Myc结合到Oct4启动 子能力的影响实验的结果示意图；

图3显示了根据本发明一个实施例，Srebp-1蛋白对MEF细胞中Oct4、Nanog和Rex1 多能性基因的表达情况影响的示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或 类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的 实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含 指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地 包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非 另有明确具体的限定。

为了克隆Srebp-1基因，本发明人首先制备了cDNA，即提取出细胞的RNA，然后用寡 聚d(T)为引物反转录信使RNA，就得到cDNA。接着，设计引物，直接从cDNA中扩增 得到Srebp-1基因序列，连接到合适的真核表达载体上。

一方面可以直接将Srebp-1基因导入到常用的小鼠或人细胞中进行功能实验检测；另一 方面可以将Srebp-1基因导入到真菌中进行蛋白纯化，以作细胞外功能检测和抗体制备。

本文中使用的术语“合适的真核表达载体”包括可以表达蛋白质的任何载体，在以下的 实施例中，选择逆转录病毒包装载体pMXs；蛋白纯化载体选择pGEX-4T-2。本文中所述的 “细胞”为任何可以获得的细胞，在以下的实时例中，选择小鼠胚胎成纤维细胞(mouse  embryo fibroblast cell，MEF细胞)；真菌选择酵母。

可以通过本领域已知的任何手段转染或感染细胞，在以下的实施例中，选择慢病毒包装 后感染细胞。可以使用本领域已知的各种方法检测蛋白质对细胞命运转换的影响。

将Srebp-1蛋白引入到体细胞重编程体系中，可以检测Srebp-1蛋白对体细胞多能性获 得的影响。体细胞重编程是指将重编程因子Sox2，Klf4，Oct4和c-Myc导入到体细胞中如 小鼠胚胎成纤维细胞，经过一段时间的培养，细胞会变成小鼠胚胎干细胞类似的细胞，能自 我更新和有多能性。当在重编程因子基础上，过表达Srebp-1蛋白后，重编程效率会大大提 高。在不同的培养体系中，Srebp-1的这个功能会一直保持。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例 仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按 照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子 克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明 生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。

在以下的实施例中，Srebp-1蛋白对染色质结构的影响主要是集中研究了Srebp-1蛋白的 功能。染色质免疫沉淀技术可用来研究Srebp-1对c-Myc结合到Oct4启动子水平的影响； 荧光定量PCR技术科用来研究Srebp-1对Oct4等多能性基因表达水平的影响。

实施例1：Srebp-1蛋白的克隆

以小鼠胚胎成纤维(MEF)细胞的cDNA为模板，利用表1所示的引物扩增Srebp-1 片断，然后用琼脂糖凝胶电泳回收。通过在pMXs载体的多克隆位点PmeI酶切后插入 PCR片段，连接，转化，挑菌，测序，最后得到Srebp-1的逆转录病毒包装质粒。

表1克隆Srep-1蛋白片断的引物

引物名称 引物序列(5’—3’) Srebp-1正向 ATGGACGAGCTGGCCTTCGGTGAG(SEQ ID NO：3) Srebp-1反向 CTAGCTGGAAGTGACGGTGGTTCCGC(SEQ ID NO：4)

实施例2：Srebp-1蛋白促进重编程实验

用单嗜性(Plat-E)逆转录病毒包装细胞系包装出重编程因子Sox2，Klf4，Oct4和 c-Myc以及Srebp-1的逆转录病毒，具体过程如下：将Plat-E细胞接种到培养皿中12小 时或过夜即可转染，转染前观察细胞密度，在70％-90％即可。转染时，先将DNA和 OPTI-MEM加好，混匀，接着加入PEI，混匀，剧烈颠倒混匀，然后静置13-15分钟， 然后将混合液加入到已换液的Plat-E细胞中，将细胞放入培养箱中。8-10小时后，给细 胞换MEF培养基。用注射器收集病毒，用0.45微米的滤器过滤到离心管中，补加适量 的新鲜培养基(直径10厘米的细胞培养盘大概12毫升)，加入polybrene(聚凝胺)混 匀，用作感染(也可以保存在4℃，备用)。再24小时后，按同样方法收集病毒，为二 次感染。每次感染24小时。

二次感染后的小鼠胚胎成纤维(MEF)细胞换用mESC诱导培养基进行培养。之后， 每天更换新鲜培养基，直到12-15天后出现克隆形态的细胞实验结束。

采用OG2-MEF细胞(来自中国科学院广州生物医药与健康研究院)(内源Oct4 启动子上偶联有GFP蛋白)，计量上述实验中获得的诱导细胞的iPS(多能分化)的效 率。当iPS克隆有GFP荧光时，表明内源Oct4启动子得到表达，是成功重编程的标志。 利用显微镜下数出GFP荧光阳性的克隆，即为iPS的诱导效率。在四因子SKOM基础上 单独过表达Srebp-1蛋白的Srebp-1蛋白促进重编程实验的结果如图1所示。其中，Flag组 为感染了空载体对照MEF细胞，Srebp-1组为上述感染了Srebp-1病毒的MEF细胞，然 后统计GFP阳性克隆数量，Srebp-1组的GFP阳性克隆数约为Flag组的2.5倍，表明当在 Sox2，Klf4，Oct4和c-Myc四个因子的基础上，感染Srebp-1可以大大增加GFP阳性克 隆数量及重编程效率。

实施例3：Srebp-1对c-Myc结合到Oct4启动子水平的影响实验

在分析Srebp-1对c-Myc结合到Oct4启动子水平的影响时，首先要包装出Srebp-1 的逆转录病毒来，感染小鼠胚胎成纤维(MEF)细胞，其中，需要说明的是，任何MEF 均可病毒感染的受体细胞。收集感染了空载体的MEF细胞作为对照和表达Srebp-1病毒 的MEF细胞，用终浓度1％的甲醛固定后，再用终浓度0.125M的甘氨酸终止。PBS洗 两遍后，用适量PBS重悬细胞，按每管1000万细胞分装。离心去上清。将细胞沉淀置 于冰上，加入1毫升裂解缓冲液A，其中，裂解缓冲液A的成份如下：50mM HEPES-KOH  pH7.3；140mM NaCl；1mM EDTA pH8.0；10％glycerol；0.5％NP-40；0.25％Triton-100；protease  inhibitor cocktail，冰上裂解10分钟后，1400g 4℃离心5分钟。去上清后加入200微升裂 解缓冲液B，其中，裂解缓冲液B的成份如下：1％SDS；50mM Tris-HCl pH8.0；10mM EDTA； protease inhibitor cocktail，冰上裂解10分钟。超声，将基因组破碎成片断400-500bp左右。

取适当体积的protein A和protein G磁珠(Lifetechnologies，26162)混合，取出保 存液后，用200微升PBST重悬，加入c-Myc抗体和IgG各2μg，4℃旋转结合3小时。 用PBST洗磁珠。将超声样品用IP(免疫沉淀)缓冲液稀释10倍，取10微升做Input 对照，取400微升加入到磁珠，4℃旋转结合过夜。第二天用低盐清洗液，高盐清洗液， LiCl清洗液和TE溶液洗磁珠。最后加入200微升的Chelex-100溶液和1微升蛋白酶， 56℃1100转反应半小时，沸水浴10分钟，离心取上清，即可作QPCR模板。最后用荧 光定量PCR(QPCR)方法检测c-Myc结合到Oct4启动子的情况。Srebp-1蛋白对MEF 细胞c-Myc结合到Oct4启动子水平的影响实验的结果，如图2所示，Flag组中，即在感 染了空载体对照的MEF细胞中，c-Myc结合到Oct4启动子上的量不高，富集倍数仅为 0.7；而Srebp-1中，即Srebp-1感染的MEF中，结合到Oct4启动子上的量大大提高了， 富集倍数为4.4，为Flag组的6倍多。结果表明Srebp-1能显著影响c-Myc结合到Oct4 启动子的能力。

实施例4：Srebp-1对Oct4等多能性基因表达水平的影响实验

收集感染了空载体对照和Srebp-1病毒的MEF细胞，分别做为SKOM+Flag组和 SKOM+Srebp-1组，加入Trizol试剂裂解细胞，六孔板每孔1毫升。小心吹打，直至所 用细胞被裂解，吸出到EP管中，可置于-80℃保存。RNA提取时，将其取出置冰上融 化。加入200微升氯仿抽提，颠倒混匀，13000转4℃离心15分钟。将上清转移到新的 EP管中，加入400微升异丙醇，颠倒混匀。室温静置10分钟，13000转4℃离心15分 钟，去上清。沉淀用70％乙醇洗一次。空气干燥10-20分钟，加入适量的RNAse-Free 水，55℃溶解20分钟，测定浓度。反转录体系取适量质量的RNA为模板，以Oligo-dT 为引物进行反转录。将反转录得到的cDNA样品用双蒸水稀释50-200倍。将QPCR的 上下游引物稀释到一起，终浓度为2.5μM，其中，引物序列如下：

上游引物：CTGTAAGGACAGGCCGAGAG(SEQ ID NO：5)

下游引物：CAGGAGGCCTTCATTTTCAA(SEQ ID NO：6)

按照QPCR试剂盒(Bio-rad,SsoAdvanced^TM UniversalGreen Supermix- 172-5272)的说明操作。SKOM+Flag组和SKOM+Srebp-1组MEF细胞中Oct4、Nanog 和Rex1多能性基因的表达水平如图3所示，Srebp-1能显著提高Oct4、Nanog和Rex1多 能性基因的表达水平。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、 或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包 含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指 的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个 或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的， 不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下 在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。