一种用于辅助预测食管鳞癌患者术后生存时间的试剂盒

摘要

本发明公开了一种用于辅助预测食管鳞癌患者术后生存时间的试剂盒。本发明提供了一种辅助预测食管鳞癌患者术后生存时间的试剂盒，包括用于检测lncRNA1的表达量的物质、用于检测lncRNA2的表达量的物质和用于检测lncRNA3的表达量的物质；所述lncRNA1如序列表的序列1所示；所述lncRNA2如序列表的序列2所示；所述lncRNA3如序列表的序列3所示。本发明中纳入了多个ESCC病人，分析lncRNA在癌和癌旁正常组织中的表达特点，发现若干lncRNA在癌组织中的表达谱明显不同于癌旁正常组织，进一步基于3个lncRNA的相对表达量建立了模型，该模型可用于辅助预测食管鳞癌患者术后生存时间。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于辅助预测食管鳞癌患者术后生存时间的试剂盒。 

背景技术

食管癌是常见的恶性肿瘤，是全球第六大癌症死因。食管癌有两个主要的病理类型：腺癌（Esophagus Adenocarcinoma,EAC）和鳞癌（ESCC）。世界上不同地区的病理类型不尽相同。食管癌在西方国家主要以腺癌为主。在我国，90%的食管癌是鳞癌，占据我国癌症死因第四位。ESCC具有高度侵袭性，预后不良，更深入的了解它的基因和分子异常机制对于疾病的早期诊断、治疗及改善预后有重要意义。 

在肿瘤的发生、发展和转移中，基因的异常表达起了很重要的作用。很多蛋白在肿瘤细胞中有异常表达，影响了某些关键的细胞通路，进而使肿瘤细胞获得持续生长的能力。因而在过去几十年，人们将大多数注意力集中到编码蛋白的基因上。但编码蛋白的基因仅占基因组序列的2%，在基因组中还有大量的非编码序列，它们转录后形成非编码RNA（non-coding RNA），如小分子干扰RNA（small inference RNA，siRNA）、微RNA（microRNA，miRNA）、PIWI互作用RNA（PIWI-interacting RNA，piRNA）以及长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）等。siRNA和miRNA在最近几年研究非常火热，人们逐渐认识到它们在肿瘤中具有非常重要的调节作用。 

对于lncRNA而言，我们对其结构、功能以及在肿瘤中的作用所知不多。长链非编码RNA（lncRNA）是一类长度大于200个核苷酸、不翻译成蛋白质的RNA。近些年来，科学家对于lncRNA的研究兴趣渐渐增加，最近两年，pubmed上每年lncRNA的文章数目增长都在50%左右。人们已发现了一大批lncRNA分子，但对于它们的特点和功能却所知不多。 

研究表明，lncRNA可以通过促进转录、抑制转录、调控mRNA翻译等多种方式参与生物过程。lncRNA可以影响很多基因的表达，调控机制多样复杂，有些lncRNA顺式调节其临近基因的转录，有些则是反式调节，有些则是通过表观遗传学方式调节，而另外一些则是通过直接与RNA聚合酶或者转录因子结合的作用方式调节。这些lncRNA可以调节关键通路上的蛋白，从而在肿瘤的发展中起到重要作用。 

目前，对于包括ESCC在内的大多数实体肿瘤而言，癌症的临床分期仍是一个预测术后病人生存时间的主要依据。但临床分期预测的并不足够精确。癌症在分子和基因层面有很大异质性，期别相同、接受治疗也相同的病人可能有不同的预后。这给医生在制定治疗方案时带来了很大的困扰。随着时代的发展，需要更好的方法来预测患者的预后，为主治医生提供尽可能准确的生存信息，从而达到指导治疗的目的。 

发明内容

本发明的目的是提供一种用于辅助预测食管鳞癌患者术后生存时间的试剂盒。 

本发明提供了一种辅助预测食管鳞癌患者术后生存时间的试剂盒，包括用于检测lncRNA1（ENST00000435885·1）的表达量的物质、用于检测lncRNA2（XLOC_013014）的表达量的物质和用于检测lncRNA3（ENST00000547963·1）的表达量的物质；所述lncRNA1如序列表的序列1所示；所述lncRNA2如序列表的序列2所示；所述lncRNA3如序列表的序列3所示。 

所述试剂盒还可包括记载有如下模型和评判方法的载体： 

$d_{\mathrm{ig}}=\sqrt{{(E_1^i+2.11)}^2+{(E_2^i+1.35)}^2+{(E_3^i-3.38)}^2},$$d_{\mathrm{ip}}=\sqrt{{(E_1^i+0.57)}^2+{(E_2^i+2.5)}^2+{(E_3^i-2.38)}^2},$其中，依次表示所述lncRNA1的相对表达量、所述lncRNA2的相对表达量和所述lncRNA3的相对表达量； 

某一lncRNA（lncRNA1、lncRNA2或lncRNA3）的相对表达量=待测食管鳞癌患者的肿瘤组织中该lncRNA的表达量-该待测食管鳞癌患者的癌旁组织中该lncRNA的表达量。 

如果d_ig<d_ip，该待测食管鳞癌患者被预测为“低危患者”，预期生存期为60个月以上；如果d_ig≥d_ip，该待测食管鳞癌患者被预测为“高危患者”，预期生存期小于60个月。 

如果d_ig<d_ip，该待测食管鳞癌患者被预测为“低危患者”，预期术后生存时间为60个月以上的可能性大；如果d_ig≥d_ip，该待测食管鳞癌患者被预测为“高危患者”，预期术后生存时间为60个月以上的可能性小。 

所述用于检测lncRNA1的表达量的物质具体可为核苷酸如序列表的序列4所示的探针。所述用于检测lncRNA2的表达量的物质具体可为核苷酸如序列表的序列5所示的探针。所述用于检测lncRNA3的表达量的物质具体可为核苷酸如序列表的序列6所示的探针。 

所述试剂盒还可包括如下组分： 

CapitalBio BioMixerTM II杂交站杂交仪（Hybridization Oven G2545A，Agilent，G2545A）； 

Agilent人类lncRNA+mRNA阵列v2.0平台； 

晶生物芯片通用标记试剂盒（购自Capitalbio，试剂盒编号360069）； 

PCR NucleoSpin Extract II试剂盒（Extract II，购自MACHEREY-NAGEL公司，产品编号740.609.250）； 

RNA Clean-up试剂盒（RNA clean-up，购自MACHEREY-NAGEL公司，产品编号740.948.250）； 

Cy5-dCTP/Cy3-dCTP（购自GE Healthcare，货号PA55031/PA53031）； 

杂交液（购自Agilent，货号5190-0403）。 

本发明还保护用于检测lncRNA1（ENST00000435885·1）的表达量的物质、用于检测lncRNA2(XLOC_013014）的表达量的物质和用于检测lncRNA3（ENST00000547963·1）的表达量的物质在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为辅助预测食管鳞癌患者术后生存时间；所述lncRNA1如序列表的序列1所示；所述lncRNA2如序列表的序列2所示；所述lncRNA3如序列表的序列3所示。 

所述用于检测lncRNA1的表达量的物质具体可为核苷酸如序列表的序列4所示的探针。所述用于检测lncRNA2的表达量的物质具体可为核苷酸如序列表的序列5所示的探针。所述用于检测lncRNA3的表达量的物质具体可为核苷酸如序列表的序列6所示的探针。 

本发明还保护用于检测lncRNA1（ENST00000435885·1）的表达量的物质、用于检测lncRNA2(XLOC_013014）的表达量的物质和用于检测lncRNA3（ENST00000547963·1）的表达量的物质和记载有如下模型和评判方法的载体在制备辅助预测食管鳞癌患者术后生存时间的试剂盒中的应用： 

$d_{\mathrm{ig}}=\sqrt{{(E_1^i+2.11)}^2+{(E_2^i+1.35)}^2+{(E_3^i-3.38)}^2},$$d_{\mathrm{ip}}=\sqrt{{(E_1^i+0.57)}^2+{(E_2^i+2.5)}^2+{(E_3^i-2.38)}^2},$其中，依次表示所述lncRNA1的相对表达量、所述lncRNA2的相对表达量和所述lncRNA3的相对表达量； 

所述lncRNA1如序列表的序列1所示；所述lncRNA2如序列表的序列2所示；所述lncRNA3如序列表的序列3所示。 

某一lncRNA（lncRNA1、lncRNA2或lncRNA3）的相对表达量=待测食管鳞癌患者的肿瘤组织中该lncRNA的表达量-该待测食管鳞癌患者的癌旁组织中该lncRNA的表达量。 

如果d_ig<d_ip，该待测食管鳞癌患者被预测为“低危患者”，预期生存期为60个月以上；如果d_ig≥d_ip，该待测食管鳞癌患者被预测为“高危患者”，预期生存期小于60个月。 

如果d_ig<d_ip，该待测食管鳞癌患者被预测为“低危患者”，预期术后生存时间为60个月以上的可能性大；如果d_ig≥d_ip，该待测食管鳞癌患者被预测为“高危患者”，预期术后生存时间为60个月以上的可能性小。 

所述用于检测lncRNA1的表达量的物质具体可为核苷酸如序列表的序列4所示的探针。所述用于检测lncRNA2的表达量的物质具体可为核苷酸如序列表的序列5所示的探针。所述用于检测lncRNA3的表达量的物质具体可为核苷酸如序列表的序列6所示的探针。 

本专利的研究内容受到国家自然科学基金81172336及“863”高技术研究发展计划资助项目2012AA02A503的资助。 

本发明中纳入了多个ESCC病人，分析lncRNA在癌和癌旁正常组织中的表达特点，发现若干lncRNA在癌组织中的表达谱明显不同于癌旁正常组织，进一步基于3个lncRNA的相对表达量建立了模型，该模型可用于辅助预测食管鳞癌患者术后生存时间。 

附图说明

图1为模型的建立过程；（A）数据初步筛选与处理后，训练集患者的lncRNA表达谱为一个带有“好预后”与“差预后”标记的60*8900的矩阵；（B）经过两部筛选，留下909个进行后续分析；（C）选出9个与预后相关性最高的lncRNA，用随机森林算法通过多步迭代筛选与预后相关的lncRNA，每次迭代舍弃重要性评分最低的1/3lncRNA；（D）通过最小临近算法对9个lncRNA的所有组合(N=2⁹-1=511)进行建模，V_g及V_p分别为预后好及预后差患者的相对lncRNA组合的平均表达量.V_i是样本i的相对lncRNA组合的表达值，欧氏距离d(V_i,V_g)及d(V_i,V_p)用来将样本i归为高危或低危组；（E）最终预后模型的确定，计算所有511个模型的准确率，对于k=1,2,…,9，选出准确率最高的组合，最终，3个lncRNA的组合被确定为最终的预后模型。 

图2为采用预后模型预测ESCC患者术后生存，高危组及低危组患者z-score转换后相对表达量的热图(A-C)及Kaplan-Meier生存曲线(D-F)；P值根据log-rank检验计算。 

图3为II期及III期患者的生存预测，预后模型将II期及III期ESCC患者分为高危和低危组的Kaplan-Meier生存曲线；(A)第一组样本中的II期患者(n=22)；(B)第三组样本中的II期患者(n=55)；(C)第一组样本中的III期患者(n=36)；(D)第三组样本中的III期患者(n=56)。 

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。TNM分期基于美国癌症联合会（AJCC）的分期手册第七版。 

实施例1、方法的建立 

收集119例具备至少5年随访信息的食管鳞癌（ESCC）患者的癌组织和癌旁正常组织，检测其中lncRNA的表达情况。所有病人均在2005年12月至2007年12月在中国医学科学院肿瘤医院行食管切除术，术后证明均为原发瘤。随访信息通过电话随诊获得，最后随访日期2012-12-15，有46人生存，73人死亡。所有样本均取得了患者 的知情同意书。没有病人在手术前进行放化疗。组织样本在切除后迅速冷冻在-80℃液氮中保存。每块标本取出一小部分进行石蜡包埋、切片、常规HE染色，进行病理检查。肿瘤组织学由两个独立的病理医生鉴定。所有肿瘤组织中的癌细胞的比率均大于60%，所有癌旁正常组织中均未发现肿瘤细胞。 

使用Agilent人类lncRNA+mRNA阵列v2.0平台进行lncRNA的表达分析。这个平台每张片子上有四个完全相同的芯片（4×180K），每个芯片最多可以容纳39,000个lncRNA探针和32,000个mRNA探针。每个RNA都会被2个同样的探针重复检测2次。另外还有4974个对照探针作为阴性对照。 

首先，对lncRNA进行了初筛。先将同样序列的lncRNA合并，得到35,025个lncRNA探针。发明人查询了UCSC数据库、GENCODE数据库和Cabili M.等的lincRNA数据库（三个数据库共有13,812个长链基因间的ncRNA及6,528个反义ncRNA），之后用这些lncRNA的序列对探针进行筛选，共选出8,900个在数据库上有注释的lncRNA。先用中位数法确定lncRNA的正常表达值（对芯片数据取以2为底的对数，丢失的数值用随机森林法补充。每个lncRNA的中位表达值即作为其表达量），再使用Cluster 3.0进行lncRNA表达的分层聚类。聚类在完全链锁及中位Pearson相关系数条件下完成。 

然后，对8,900个lncRNA再进行筛选。整体上来说，lncRNA表达量比mRNA表达量要低。本研究中，119例ESCC癌-癌旁正常组织lncRNA表达量是5.93，而相应的mRNA却有10.19。因为表达量小的lncRNA很有可能是噪音，故只选取表达量比较高的lncRNA，所以选取了表达量>5的lncRNA，小于等于5的lncRNA被舍去了。另一方面，癌旁正常组织和肿瘤组织相差特别小的lncRNA也被舍去（这里是肿瘤-正常<0.03被舍去）。最终得到了4,874个lncRNA。 

之后进行第二轮筛选。为了减少不同病人间基因异质性的影响，发明人选择了同个病人“肿瘤组织减去癌旁正常组织”的表达量，作为相对表达量。在4,874个lncRNA中选取了癌-癌旁差异比较大的lncRNA。这次选择了909个在癌-癌旁正常组织中绝对表达量变化>2倍的lncRNA用于后面的分析。 

划分“预后好”和“预后差”。分类器的最终效果是对样本得到一个0-1分类变量。因此需要对预后的好、差进行划分。将病人随机分到训练组（n=60）及测试组（n=59）。根据119个病人生存期是否超过5年分为了预后好（47人）和预后差（72人）。训练组中，预后好：预后差为24:36，测试组中则为23:36。 

得到909个lncRNA以后，使用以上的随机森林算法，给909个从上述步骤筛选出的lncRNA依据排位重要性评分，从中选出和预后最相关的lncRNA（具体操作使用软件Random Jungle）。在本算法中，为了缩小基因数量，使用迭代法，每次迭代时至少舍弃1/3相对不重要的lncRNA。每一步产生1000个分类树，将（n为每一步输入 的lncRNA数量）设为随机选择的lncRNA分类树的节点数目。由于预后好和预后差的病人数目并不相等，故而分类权重也根据以上进行调整。泛化误差通过袋外样品（out-of-bag sample）得到。最终得到了9个lncRNA。 

得到9个lncRNA以后，发明人使用最小临近算法（nearest shrunken centroid algorithm）进行建模与筛选。首先，列出9个lncRNA的所有可能组合（g1，g1g2，g1g3，…，g1g2…g9，n=511）。之后，针对每一个lncRNA组合，对于预后好和预后差的病人分别确定出其相应的lncRNA的表达量，作为两个“中心点”（此2点维数从1维到9维不等），即“好点”和“差点”。然后，算出所有样本实际表达量和这两个点的欧几里得距离。d_ig定义为样本i和“好点”之间的距离，d_ip定义为样本i和“差点”之间的距离。如果d_ig<d_ip，则预测i样本为“好”（低危组），反之则预测i样本为“差”（高危组）。和患者实际的预后比较后，可以计算出这个lncRNA分类器的预测准确率（预测准确率定义为预后好组和预后差组预测准确率的平均值）。 

在511个分类器中综合考虑预测准确率与分类器中lncRNA的数量，选取一个作为最终的分类器。如果不同lncRNA组的预测准确率相同，则比较每组错误预测的总距离，选取总距离的最小者。 

最终通过训练组数据构建了一个由3个lncRNA（ENST00000435885·1,XLOC_013014,及ENST00000547963·1）组成的分类器（又称预测模型）。在该分类器中，“好”与“坏”的质心分别为(-2.11,-1.35,3.38)与(-0.57,-2.50,2.38)，代表了训练集中预后好与预后差的患者3个lncRNA的平均相对表达量。于是，分类器为： $d_{\mathrm{ig}}=\sqrt{{(E_1^i+2.11)}^2+{(E_2^i+1.35)}^2+{(E_3^i-3.38)}^2},$$d_{\mathrm{ip}}=\sqrt{{(E_1^i+0.57)}^2+{(E_2^i+2.5)}^2+{(E_3^i-2.38)}^2},$其中， 依次表示样本i中ENST00000435885·1(ENST00000435885·1长链非编码NA,简称lncRNA1，lncRNA1如序列表的序列1所示)、XLOC_013014(XLOC_013014为长链非编码RNA,简称lncRNA2，lncRNA2如序列表的序列2所示)和ENST00000547963·1(ENST00000547963·1为长链非编码RNA,简称lncRNA3，lncRNA3如序列表的序列3所示)的相对表达量。对于某个患者，若d_ig<d_ip，则该患者被预测为“低危”（预测其术后生存时间为60个月以上的可能性大），如果d_ig≥d_ip，该患者被预测为“高危”（预测其术后生存时间为60个月以上的可能性小）。对于某个患者，若d_ig<d_ip，则该患者被预测为“低危”（预期生存期为60个月以上），如果d_ig≥d_ip，该患者被预测为“高危”（预期生存期小于60个月）。 

实施例2、方法的应用 

第一组样本：收集60例食管鳞癌（ESCC）患者的癌组织和癌旁正常组织；所有病人均于2005年12月至2007年12月在中国医学科学院肿瘤医院行食管切除术，术后 证明均为原发瘤；随访信息通过电话随诊获得，最后随访日期2012-12-15；所有样本均取得了患者的知情同意书；没有病人在手术前进行放化疗；组织样本在切除后迅速冷冻在-80℃液氮中保存，每块标本取出一小部分进行石蜡包埋、切片、常规HE染色，进行病理检查，肿瘤组织学由两个独立的病理医生鉴定，所有肿瘤组织中的癌细胞的比率均大于60%，所有癌旁正常组织中均未发现肿瘤细胞。 

第二组样本：收集59例食管鳞癌（ESCC）患者的癌组织和癌旁正常组织；所有病人均于2005年12月至2007年12月在中国医学科学院肿瘤医院行食管切除术，术后证明均为原发瘤；随访信息通过电话随诊获得，最后随访日期2012-12-15；所有样本均取得了患者的知情同意书；没有病人在手术前进行放化疗；组织样本在切除后迅速冷冻在-80℃液氮中保存，每块标本取出一小部分进行石蜡包埋、切片、常规HE染色，进行病理检查，肿瘤组织学由两个独立的病理医生鉴定，所有肿瘤组织中的癌细胞的比率均大于60%，所有癌旁正常组织中均未发现肿瘤细胞。 

第三组样本：收集60例食管鳞癌（ESCC）患者的癌组织和癌旁正常组织；所有病人均于2008年1月至2008年12月在中国医学科学院肿瘤医院行食管切除术，术后证明均为原发瘤；随访信息通过电话随诊获得，最后随访日期2012-12-15；所有样本均取得了患者的知情同意书；没有病人在手术前进行放化疗；组织样本在切除后迅速冷冻在-80℃液氮中保存，每块标本取出一小部分进行石蜡包埋、切片、常规HE染色，进行病理检查，肿瘤组织学由两个独立的病理医生鉴定，所有肿瘤组织中的癌细胞的比率均大于60%，所有癌旁正常组织中均未发现肿瘤细胞。 

晶生物芯片通用标记试剂盒：购自Capitalbio，试剂盒编号360069。 

1、分别提取组织（肿瘤组织或癌旁正常组织）的总RNA。 

2、RNA的扩增 

（1）取1μg步骤1得到的总RNA，使用CbcScript II逆转录酶（晶生物芯片通用标记试剂盒的组分）和cDNA合成系统（晶生物芯片通用标记试剂盒的组分）并按说明书进行操作，得到双链cDNA。 

（2）采用PCR NucleoSpin Extract II试剂盒（Extract II，购自MACHEREY-NAGEL公司，产品编号740.609.250）并按说明书进行操作，纯化步骤（1）得到的双链cDNA,然后用30μl洗脱液（“PCR NucleoSpin Extract II试剂盒”的组分）洗脱。 

（3）将步骤（2）得到的溶液真空浓缩至16μl，加入T7Enzyme Mix至40μl（晶 生物芯片通用标记试剂盒的组分），37℃转录14hr，得到RNA（称为cRNA）。 

（4）采用RNA Clean-up试剂盒（RNA clean-up，购自MACHEREY-NAGEL公司，产品编号740.948.250）纯化步骤（3）得到的cRNA。 

3、标记 

（1）将2μg步骤2得到的cRNA和2μL随机引物（Random Primer，晶生物芯片通用标记试剂盒的组分）混合，65℃变性5min，冰浴冷却。 

（2）完成步骤（1）后，加入5μl4×第一链缓冲液（晶生物芯片通用标记试剂盒的组分）、2μl0.1M DTT、1.5μl CbcScript II逆转录酶，25℃温浴10min，然后37℃反应90min，然后使用PCR NucleoSpin Extract II试剂盒纯化cDNA，然后真空浓缩至14μl。 

（3）将步骤（2）得到的cDNA与2μL随机引物（Random Primer，晶生物芯片通用标记试剂盒的组分）混合，95℃反应3min，然后立刻放入冰浴5min。 

（4）完成步骤（3）后，加入5μl Klenow缓冲液（晶生物芯片通用标记试剂盒的组分）、dNTP、Cy5-dCTP/Cy3-dCTP（购自GE Healthcare，货号PA55031/PA53031），使dATP的浓度为240M、dGTP的浓度为240M、dTTP的浓度为240M、dCTP的浓度为120M、Cy5-dCTP/Cy3-dCTP的浓度为40M。 

（5）完成步骤（4）后，加入1.2μl Klenow酶，37℃温浴反应90min。 

（6）采用PCR NucleoSpin Extract II试剂盒纯化步骤（5）得到的cDNA（具有Cy标记的cDNA）。 

4、杂交 

取步骤3得到的具有Cy标记的cDNA（约20微克），加入80μl杂交液（购自Agilent，货号5190-0403），95℃变性3min，然后使用CapitalBio BioMixerTM II杂交站杂交仪（Hybridization Oven G2545A，Agilent，G2545A）和Agilent人类lncRNA+mRNA阵列v2.0平台（用于检测ENST00000435885·1的探针为5’-AATCCCCCTGTTGGGAAGAGATATTATGGTTAAAATGGAGGCACTACTACAATTTAAGCA-3’，用于检测XLOC_013014的探针为5’-TTCAACTATAATTTCACAGGTCCCTATAAGGCTGCTCCAGTGCCCCCAAATTTGGACCTT-3’，用于检测ENST00000547963·1的探针为5’-ACAGATAATCATCACTACGAGTATATTGTGTGCCTGCTAAGCACCACACCTGAGATAAGC-3’）进行点阵杂交（8rpm、42℃、过夜），之后再连续用溶液洗脱（0.2%SDS，2×SSC，42℃5min；0.2×SSC，室温5min），得到原始结果。 

5、将步骤4得到的原始结果进行quantile归一化。同个病人：肿瘤组织中ENST00000435885·1的表达量-癌旁组织中ENST00000435885·1的表达量=ENST00000435885·1的相对表达量。同个病人：肿瘤组织中XLOC_013014的表达量-癌旁组织中XLOC_013014的表达量=XLOC_013014的相对表达量。同个病人：肿瘤组织中ENST00000547963·1的表达量-癌旁组织中ENST00000547963·1的表达量= ENST00000547963·1的相对表达量。 

将相对表达量代入如下模型： 

$d_{\mathrm{ig}}=\sqrt{{(E_1^i+2.11)}^2+{(E_2^i+1.35)}^2+{(E_3^i-3.38)}^2},$$d_{\mathrm{ip}}=\sqrt{{(E_1^i+0.57)}^2+{(E_2^i+2.5)}^2+{(E_3^i-2.38)}^2},$其中，依次表示样本i中ENST00000435885·1(ENST00000435885·1为长链非编码RNA,简称lncRNA1，lncRNA1如序列表的序列1所示)、XLOC_013014(XLOC_013014为长链非编码RNA,简称lncRNA2，lncRNA2如序列表的序列2所示)和ENST00000547963·1(ENST00000547963·1为长链非编码RNA,简称lncRNA3，lncRNA3如序列表的序列3所示)的相对表达量。对于某个患者，若d_ig<d_ip，则该患者被预测为“低危”（预测其术后生存时间为60个月以上的可能性大），如果d_ig≥d_ip，该患者被预测为“高危”（预测其术后生存时间为60个月以上的可能性小）。对于某个患者，若d_ig<d_ip，则该患者被预测为“低危”（预期生存期为60个月以上），如果d_ig≥d_ip，该患者被预测为“高危”（预期生存期小于60个月）。 

第一组样本的结果见表1。进行生存期预测后，33位患者属于高危组，27位患者属于低危组。基于随访结果，高危组患者的中位生存期为19.2月，低危组的中位生存期>60个月。结果表明，采用本发明提供的模型进行结果评判，高危组患者生存时间相比于低危组患者的生存时间显著缩短，p<0.0001（图2A，D）。两组患者临床和病理学特点并无显著性差异（见表4）。 

表1 第一组样本的结果（60位患者） 

第二组样本的结果见表2。进行生存期预测后，25位患者属于高危组，34位患者属于低危组。基于随访结果，高危组患者的中位生存期为21.5月，低危组的中位生存期>60个月。结果表明，采用本发明提供的模型进行结果评判，高危组患者生存时间相比于低危组患者的生存时间显著缩短，p=0.0030（图2B，E）。两组患者临床和病理学特点并无显著性差异（见表4）。 

表2 第二组样本的结果（59个患者） 

第三组样本的结果见表3。进行生存期预测后，37位患者属于高危组，23位患者属于低危组。基于随访结果，高危组患者的中位生存期为25.8月，低危组的中位生存期>48个月。结果表明，采用本发明提供的模型进行结果评判，高危组患者生存时间相比于低危组患者的生存时间显著缩短，p=0.0187（图2C，F）。两组患者临床和病理学特点并无显著性差异（见表4）。 

表3 第三组样本的结果（60个患者） 

表4 三组ESCC患者中高危与低危组的临床病理特征 

IQR:四分位距.如无特殊说明，P值通过Chi-square检验或Fisher精确性检验. ^﹡Student’s t检验.§Log-rank检验。 

为了本发明建立的模型的预测功能是否与病人的临床及病理因素相独立，进行了多因素Cox回归分析。选择的病人因素有年龄、性别、吸烟、饮酒、肿瘤位置、级别、T分期、N分期、TNM分期。对第一组进行多因素Cox回归，结果显示模型（风险比=7·58795%置信区间:3·222-17·866,p<0·0001）及年龄（风险比=2·184 95%置信区间:1·107-4·347,p=0·0242）与ESCC患者的预后显著相关（表5）。为了使验证准确，将第二组样本和第三组样本合成一个组，再进行多因素Cox回归分析，结果显示模型（风险比=2·14595%置信区间:1·291-3·564,p=0·0032）和N分期（风险比=1·93195%置信区间:1·164-3·203,p=0·0108）是ESCC病人预后的独立因素（表5）。综上，多因素Cox回归分析结果显示，模型是ESCC病人预后的独立因素。 

表5 模型与生存相关性的单因素及多因素Cox回归分析 

95% CI:95%置信区间. 

接下来，发明人对TNM分期II期及TNM分期III期患者分别进行了分析，以检验这个分类器是否能够在同期别病人中预测生存。对于II期病人进行log-rank检验，结果显示，在第一组样本和混合样本（第二组样本和第三组样本的混合样本）中，本发明提供的模型可以将病人分成高危和低危组（第一组样本，p<0.0001，n=22，图3A；混合样本，p=0.0257，n=55，图3B）。对于III期病人，本发明提供的模型可以将病人分成高危和低危组（第一组样本，p=0.0104，n=36，图3C；混合样本，p=0.0105，n=56，图3D）。由于I期病人的样本量较小（n=10），故没有对其进行分层分析。上述结果表明，本发明提供的模型能在相同TNM分期的ESCC患者中预测患者生存。