一种猪肠道干细胞的分离培养方法

摘要

本发明属于细胞分离技术领域，具体公开了一种猪肠道干细胞的分离培养方法；本发明首先筛选可用于猪肠道干细胞分选的特异性抗体，所述抗体包括CD24、CD44和CD166，所述CD24抗体来源于ML5单克隆；利用该抗体，通过流式细胞技术可针对性的筛选出猪肠道干细胞，通过建立三维的培养体系，可培养出类肠团，本发明为肠道上皮更新研究和组织特异性干细胞移植提供良好的材料。

说明书

技术领域

本发明涉及细胞分离技术领域，更具体地，涉及一种猪肠道干细胞的分离培养方法。

背景技术

肠道干细胞（intestinal stem cells，ISC）旺盛的增殖分化能力，在维持肠粘膜屏障结构和功能的完整性及肠粘膜的损伤修复中起着至关重要的作用。有研究发现，ISC参与了肠道粘膜增生、分化以及肠道肿瘤的发生发展。

猪肠道干细胞可以产生新的细胞以维持猪肠道上皮日常更新和修复猪肠道上皮损伤，因此对于肠道损伤修复、肠道健康和肠道再生医学具有极大的作用。然而，猪肠道干细胞存在于肠道隐窝中，猪肠道隐窝存在于肠道肌层深处，且肠道干细胞在隐窝中存在的数目非常少。在科学研究和临床上应用前，猪肠道干细胞必需先被分离出来，然后通过体外培养增加其细胞数目，现有技术中对于如何获得足够数量且活性良好的猪肠道干细胞，并对其进行体外扩大培养的研究也不断增多，这些研究为肠道上皮更新研究和组织特异性干细胞移植提供良好的理论基础。

关于上述研究主要集中在猪肠道干细胞的分离和体外培养扩大。目前各种研究证据表明，肠道干细胞可通过流式细胞技术从肠上皮细胞中分离出来，通过体外三维培养体系进行培养。但是，从新鲜猪肠道中分离肠道干细胞进行体外培养有别于小鼠等其它物种，其主要的困难在于缺乏可用于流式细胞技术的有效抗体和适合分离后猪肠道干细胞的培养体系。因此，目前还没有关于猪肠道干细胞分离培养的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于填补现有猪肠道干细胞分离技术空白，提供一种通过流式细胞术分离猪肠道干细胞的特异性抗体。

本发明的第二个目的是提供一种可以有效分离猪肠道干细胞的方法。

本发明的第三个目的是提供上述猪肠道干细胞的体外扩大培养方法。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

     一种通过流式细胞术分离猪肠道干细胞的特异性抗体，所述抗体包括CD24、CD44和CD166，所述CD24抗体来源于ML5单克隆。

肠道干细胞对于肠道损伤修复、肠道健康和肠道再生医学具有极大的作用，因此获取肠道干细胞具有重要的指导意义，但是，当前相关研究的最大障碍是缺乏针对肠道干细胞的抗体，从而严重制约了肠道干细胞的分离和体外培养。

肠道干细胞表面被不同的蛋白受体所覆盖，可选自性地结合和黏附其他“信号”分子，由于与“信号”分子的亲和力不同，在用流式细胞术分离猪肠道干细胞时，现有技术还没有针对猪肠道干细胞的特异性抗体。

本发明在现有技术的基础上，通过大量的实验分析研究，筛选出了特异性针对猪肠道干细胞的抗体，利用该抗体，并结合流式细胞术可以针对性的分离出猪肠道干细胞。

优选地，本发明所述抗体由CD24、CD44及CD166组成，所述CD24抗体来源于ML5单克隆。

提供一种猪肠道干细胞的分离方法，是将猪肠道隐窝团消化为单个细胞，加入标记的CD24、CD44及CD166抗体，通过流式细胞术分离出猪肠道干细胞，所述CD24抗体来源于ML5单克隆。

具体地，上述分离方法为：用消化液将猪肠道隐窝团消化为单个细胞，将这些细胞过滤以去除组织块及黏连细胞，加入标记CD24、CD44及CD166三种细胞表面抗体，借助流式细胞技术，分离出猪肠道干细胞，所述CD24抗体来源于ML5单克隆。

优选地，所述肠道隐窝团通过以下方法获得：将清洗过的仔猪小肠剪成小段，低温条件下在分离液中孵育，去除分离液后用HBSS重悬、混匀获得；所述分离液为30.0 mM Na₂EDTA-2H₂O；5.6mM 葡萄糖；5.3mM KCl；0.45mM KH₂PO₄；4.2 mM NaHCO₃；138mM NaCl；0.34mM Na₂HPO₄。

更优选地，所述仔猪小肠在分离液中孵育的时间为20～40min；所述低温为0～8℃。

更优选的，所述猪肠道隐窝团通过以下方法获得：取15～30 cm新鲜的仔猪空肠，用HBSS将内容物冲洗干净，将肠段剪成1～2 cm的小段，在4℃环境下用分离液孵育30 min，去除分离液后用HBSS重悬这些空肠片段，上下颠倒摇晃5～10min，获得猪肠道隐窝团。

提供猪肠道干细胞的培养方法，是将上述任一种方法分离获得的猪肠道干细胞在含有血清和细胞因子的培养基进行培养；所述细胞因子包括Wnt3a、R-spondin1、Y-27632、Noggin、EGF、LY2157299和SB202190。

优选地，上述猪肠道干细胞的培养方法是：将上述任一种方法分离获得的猪肠道干细胞与含有血清和细胞因子的培养基及Magtrigel混匀，待混合物凝固后，加入完全培养基进行培养；所述细胞因子包括Wnt3a、R-spondin1、Y-27632、Noggin、EGF、LY2157299和SB202190。具体地，所述猪肠道干细胞的培养条件为细胞领域的常规培养；更具体地，所述猪肠道干细胞的培养方法为：将分离到的猪肠道干细胞按1000个细胞/毫升的浓度与Magtrigel混合均匀，以25微升/孔的体积接种于48孔细胞培养板中，每孔加入250微升的完全培养基，培养20天，期间每2天换液1次。

发明人通过实验研究发现，不同的单克隆所产生的CD24，有些能够分离出猪肠道干细胞，而有些则不能分离出猪肠道干细胞，本发明所述CD24来源于ML5单克隆，该CD24的说明书见网址（http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd24-antibody-3364.html），说明书内容见说明书附图的图5。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

    本发明提供一种通过流式细胞术分离猪肠道干细胞的特异性抗体，所述抗体包括CD24、CD44和CD166，所述CD24抗体来源于ML5单克隆；利用该抗体，通过流式细胞技术可针对性的筛选出猪肠道干细胞，通过建立三维的培养体系，可培养出结构完整、活性高的猪肠道干细胞，通过本发明所述特异性抗体和分离方法获得的猪肠道干细胞为肠道上皮更新研究和组织特异性干细胞移植提供良好的材料。

附图说明

图1为显微镜下的猪隐窝细胞团。

图2为流式细胞仪分选结果。

图3为CD44⁺CD24^loCD166⁺细胞二维培养。

图4为CD44⁺CD24^loCD166⁺细胞三维培养。

图5为BioLegend anti human CD24的说明书。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明所述抗体由BioLegend anti human CD24、BioLegend anti-mouse/human CD44及BioLegend anti –mouse/human CD166组成。

实施例1猪肠道干细胞的分离

（1）取15～30 cm新鲜的仔猪空肠，用HBSS将内容物冲洗干净，将肠段剪成1～2 cm的小段，在4℃环境下用分离液（30.0 mM Na₂EDTA-2H₂O；5.6mM 葡萄糖；5.3mM KCl；0.45mM KH₂PO₄；4.2 mM NaHCO₃；138mM NaCl；0.34mM Na₂HPO₄）孵育30 min，去除分离液后用HBSS重悬这些空肠片段，上下颠倒摇晃5～10min，获得猪肠道隐窝团，显微镜下观察隐窝团如图1。

（2）向获得的隐窝团中加入适量消化液，37℃消化成单个细胞，终止消化后用30 μm的细胞筛过滤，收集滤液（单细胞），用Advance DMEM-F12重悬这些单细胞，使其浓度达到10⁶个细胞/mL。

（3）先用10%的胎牛血清（FBS）封闭肠道隐窝细胞表面的非特异性抗原结合位点，PBS洗涤后加入适量的荧光标记的CD24、CD44及CD166抗体，4℃条件下孵育30 min，PBS洗涤2遍后，重悬这些隐窝单细胞，使其浓度达到10⁶个细胞/mL。

    （4）将与CD24、CD44及CD166抗体标记的肠道隐窝细胞使用MoFlo^TMXDP超速流式细胞分选系统进行分离，液流压力为12psi，喷嘴大小为150 μm。收集CD44⁺CD24^loCD166⁺细胞，实验结果如图3。

实施例2 猪肠道干细胞二维培养

用含有血清和细胞因子（Wnt3a、R-spondin1、Y-27632、Noggin、EGF、LY2157299和SB202190）的完全培养基悬浮实施例1获得的CD44⁺CD24^loCD166⁺细胞，接种于96孔板中，放置CO₂培养箱中培养，培养温度为37℃，培养箱内含5% CO₂的湿润空气。通过培养，观察CD44⁺CD24^loCD166⁺细胞在二维培养条件下的生长情况，实验结果如图4。

结果显示，二维条件下培养猪肠道干细胞不能形成类肠团结构。

实施例3 猪肠道干细胞三维培养

用含有血清、细胞因子（Wnt3a、R-spondin1、Y-27632、Noggin、EGF、LY2157299和SB202190）及实施例1获得的CD44⁺CD24^loCD166⁺细胞的基本混合物与Matrigel均匀混合，接种至48孔板中，等待混合物凝固后，加入完全培养基（完全培养基的组分和实施例1和2相同）覆盖在上面。通过培养，观察CD44⁺CD24^loCD166⁺细胞在三维培养条件下的生长情况，实验结果如图5。

对比例1 猪肠道干细胞的分离

实验方法同实施例1，唯一不同的是，步骤（3）中所加入是荧光标记mEphB2抗体，不能成功分选到猪肠道干细胞。

对比例2 猪肠道干细胞的分离

实验方法同实施例1，唯一不同的是，步骤（3）中所加入是荧光标记BD Pharmingen^TM anti-human CD24、BioLegend anti-mouse/human CD44及BioLegend anti –mouse/human CD166抗体，不能成功分选到猪肠道干细胞。

结果表明：对比例1、2均不能获得猪肠道干细胞。