血清中葡萄糖氧化酶双试剂测定方法

摘要

本发明公开了一种血清中葡萄糖氧化酶测定方法，属于利用可见光，通过测试反应的结果产生颜色变化来测试材料的方法。本发明的技术方案是采用双试剂内空白法进行测定，通过试剂I中3-氨基-1，2，4-三唑抑制血红素过氧化氢酶活性来抑制干扰反应；加入试剂Ⅱ后，葡萄糖氧化酶氧化β-D型葡萄糖生成过氧化氢和D-葡萄糖酸，过氧化氢在过氧化物酶的作用下，与N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐和4-氨基安替比林缩合成兰色醌亚胺，仪器在595-610nm波长处检测。本发明检测时不受溶血中血红素过氧化酶干扰，是一种能消除溶血内源性干扰，准确性更高的葡萄糖检测方法。

说明书

技术领域

本发明属于一种包含酶的测定方法；或是利用可见光，通过测试反应的 结果产生颜色变化来测试材料的方法，特别是涉及一种用生化分析仪检测血 清中葡萄糖的双试剂测定方法。

背景技术

临床实验室常用GOD-PAP法测定血清葡萄糖，测定波长为520nm，但此 法易受脂血、黄疸血、溶血的干扰而造成或高或低的影响，当溶血标本采用葡 萄糖氧化酶法单试剂反应中，血红素中过氧化氢酶会分解葡萄糖氧化酶氧化葡 萄糖产生的过氧化氢，从而使产生的红色醌亚胺与葡萄糖不成等量关系，而使 葡萄糖测定结果偏低；脂血、黄疸、溶血在中测定波长为520nm产较大吸光 度，从而干扰葡萄糖测定，脂血、黄疸、溶血等对血清葡萄糖的测定影响主要 是光谱吸收；当脂血、黄疸、溶血血清指数较大时，会超过仪器设置的样品限， 仪器会报警提示可能对结果造成影响，测定反应的光吸收远小于血清指数的光 吸收，测定信号被“淹没”，光信号的微小变化对测定结果产生较大波动。

为了克服葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖干扰，特别是溶血干扰，本发明采用 了双试剂内空白测定方法，使用3-氨基-1，2，4-三唑通过抑制血红素过氧化氢 酶活性来抑制干扰反应；加入试剂Ⅱ后，葡萄糖氧化酶氧化β-D型葡萄糖生成 过氧化氢和D-葡萄糖酸，过氧化氢在过氧化物酶的作用下，与N-乙基-N-(2- 羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐(DAOS)和4-氨基安替比林缩合成兰 色醌亚胺，仪器在595-610nm波长处检测，本发明检测时不受溶血中血红蛋白 产生的血红素过氧化酶干扰。采用N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧 基苯胺钠盐色原物，由于形成兰色醌亚胺，其测定波长为600nm,在脂血、黄疸、 溶血等光谱吸收远小于520nm红色醌亚胺的光吸收，增加了反应信号和噪音的 比值，提高了测定的准确性，因此，既降低了内源性干扰，有消除了血清指数 的干扰，是准确性更高的葡萄糖检测方法。

本研究采用新的酚衍生物N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基 苯胺钠盐为Tinder反应的色源，显色反应的灵敏度高，且生成的醌亚胺染料 最大吸收波长为600nm等方法，溶血、黄疸、脂血等引起的干扰使用双试剂 和新色原物后明显减小，各项方法学指标满足临床实际应用需要，具有选择 性好、灵敏度高、测定简便等特点，适合临床推广应用，具备全自动生化分 析仪的临床实验室使用。

发明内容

为解决溶血标本中血红素过氧化氢酶干扰问题及血清指数干扰问题，本 发明设计了双试剂测定方法，试剂配方及使用方法如下：

试剂I：每升0.1mol/L磷酸盐缓冲液中含有3-氨基-1，2，4-三唑0.80mol， 4-氨基安替比林0.60mmol，变旋酶2KU、Proclin-300 200μL。

试剂II：每升0.1mol/L磷酸盐缓冲液中含有N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙 基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐1.2mmol、抗坏血酸氧化酶30KU、葡萄糖氧化酶 (POD)20KU、过氧化物酶15KU、Proclin-300 200μL。

其测定方法为：血清先与试剂Ⅰ于37℃温浴3～5分钟，血清中葡萄糖与 试剂Ⅰ中变旋酶反应，α型葡萄糖转化为β-D型葡萄糖，3-氨基-1，2，4-三 唑抑制血红素过氧化氢酶活性，抑制干扰反应如反应式(1)(2)；加入试剂 Ⅱ后于37℃温浴4～7分钟，葡萄糖氧化酶氧化β-D型葡萄糖生成过氧化氢 和D-葡萄糖酸，过氧化氢在过氧化物酶的作用下，与N-乙基-N-(2-羟基-3- 磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐和4-氨基安替比林缩合成兰色醌亚胺如反应 式(3)(4)，仪器在595-610nm波长处检测，以样品与试剂Ⅰ反应为空白， 由试剂Ⅱ反应产生的兰色醌亚胺计算出葡萄糖的含量。本发明检测时不受溶 血、脂血、黄疸等血清干扰，不受溶血中血红蛋白产生的血红素过氧化酶的 影响，不增加工作量与试剂成本，经济方便易行，是一种既能消除内源性干 扰，又能消除溶血、脂血、黄疸干扰，准确性更高的葡萄糖检测方法。

本发明方法葡萄糖氧化酶法测定反应公式：

第一步反应

第二步反应

附图说明

附图是本发明测定健康人体葡萄糖的反应曲线图。

具体实施方式：

下面通过实施例及附图对本发明做进一步详细说明。

实施例1

试剂的组成：

a.试剂Ⅰ：每升0.1mol/L磷酸盐缓冲液中含有3-氨基-1，2，4-三唑 0.80mol，4-氨基安替比林0.60mmol，变旋酶2KU、Proclin-300 200μL；

b.试剂Ⅱ：每升0.1mol/L磷酸盐缓冲液中含有N-乙基-N-(2-羟基-3-磺 丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐1.2mmol、抗坏血酸氧化酶30KU、葡萄糖氧化 酶(POD)20KU、过氧化物酶15KU、Proclin-300 200μL。

c.标准液：5.55mmol/L葡萄糖水溶液。

其中，3-氨基-1，2，4-三唑为过血红素过氧化氢酶的抑制剂，Proclin-300 为液体高效防腐剂。

测定程序

双试剂法：在日本OLYMPUS AU2700全自动化生化分析仪上，仪器自 动将2μl样品加入到150μl试剂Ⅰ中混匀，37℃孵育3分钟，加入50μl试剂 Ⅱ混匀，37℃孵育5.1分钟，全自动分析仪在600nm波长处检测，仪器自动 计算出葡萄糖结果如图1，反应参数见表1。

表1.本发明自动化生化分析仪测试条件

反应OD_GLU计算值＝OD₂-OD₁×[(SV+R₁V₁)/(SV+R₁V₁+R₂V₂)]

葡萄糖浓度＝F×OD_GLU

其中OD_GLU是葡萄糖产生的吸光度；OD₁是样品加入试剂Ⅰ反应后测得的吸 光度；OD₂是样品加入试剂Ⅱ反应后测得的吸光度；SV是血清样品的体积，R₁V₁是试剂Ⅰ的体积；R₂V₂是试剂Ⅱ的体积；F是校正因数。

加入试剂II后OD₁的稀释倍数为[(SV+R₁V₁)/(SV+R₁V₁+R₂V₂)]，加入试 剂II后的吸光度即为OD₁×[(SV+R₁V₁)/(SV+R₁V₁+R₂V₂)]，所以，由葡萄糖 产生的醌亚胺的吸光度为：OD_GLU＝OD₂-OD₁×[(SV+R₁V₁)/(SV+R₁V₁+R₂V₂)]， 即OD_GLU＝OD₂–(2+150)/(2+150+50)×OD₁，只要测出OD₁和OD₂即可计算出 葡萄糖的浓度。

下面通过采用两种不同的检测试剂检测血清中的葡萄糖,来进一步说明本 发明的积极效果。

1.检测对象：健康体检人员68人，其中男性52人，平均年龄42.5岁； 女性34人，平均年龄39.5岁，空腹采血。

2.试剂

2.1 试剂：

(1)全国临床检验操作规程推荐方法按中华医学会推荐法配制:试 剂Ⅰ：每升0.1mmol(pH7.0)磷酸盐缓冲液中溶解葡萄糖氧化酶1200U、过氧 化氢酶1200U，4-氨基安替比林10mg；试剂Ⅱ：每升0.1mol/L磷酸盐缓冲液中 溶解4-氯酚1g。测定时试剂I∶试剂II等量混合。样品∶试剂＝1∶150，37℃， 反应8.1分钟520nm波长处终点法测定。

(2)本发明测定方法试剂Ⅰ：每升0.1mol/L磷酸盐缓冲液中含有3- 氨基-1，2，4-三唑0.80mol，4-氨基安替比林0.60mmol，变旋酶2KU、 Proclin-300 200μL；试剂Ⅱ：每升0.1mol/L磷酸盐缓冲液中含有N-乙基-N-(2- 羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐1.2mmol、抗坏血酸氧化酶30KU、 葡萄糖氧化酶(POD)20KU、过氧化氢酶15KU、Proclin-300 200μL。样品∶ 试剂I∶试剂II＝1∶75∶25。37℃，样品与试剂I温浴3分钟，加入试剂II， 反应5.1分钟，600nm波长处终点法测定。

2.2 标准液：5.55mmol/L葡萄糖水溶液。

3.仪器：日本Olympus AU2700型全自动生化分析仪4. 方法将患者血清分为两组，正常血清组采用生化管采血，离心分离进行 测定，溶血组采用部分冻融红细胞溶血进行测定。

3.实验结果比较：

3.1 采用全国临床检验操作规程推荐方法和本发明方法分别测定溶血组 和正常血清组结果比较如表2：

表2 两种葡萄糖测定方法测定溶血组和非溶血组血糖结果比较(mmol/L)

在表2中，本发明方法和推荐方法在测定正常组患者血清葡萄糖时，测定结 果无显著性差异t＝1.03,P>0.05；本发明方法和推荐方法在测定溶血组患者 血清葡萄糖时，测定结果有显著性差异t＝11.45,P<0.05，测定结果偏低。 在应用葡萄糖氧化酶法测定溶血标本时，不仅受到溶血中过氧化氢酶的干扰， 而且受到血清颜色的光谱吸收干扰，而造成较大误差，本发明通过应用双试 剂内空白、添加血红素过氧化氢酶抑制剂、改变色原物颜色等方法，增加了 反应信号和噪音的比值，减少了干扰反应，显著提高了测定方法的准确性。