公开/公告号CN104721462A
专利类型发明专利
公开/公告日2015-06-24
原文格式PDF
申请/专利权人 亚宝药业集团股份有限公司;
申请/专利号CN201310704050.3
申请日2013-12-20
分类号
代理机构
代理人
地址 044600 山西省运城市芮城县富民路43号
入库时间 2023-12-18 09:18:47
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2018-11-27
授权
授权
2016-01-20
实质审查的生效 IPC(主分类):A61K36/8945 申请日:20131220
实质审查的生效
2015-06-24
公开
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发明领域
本发明涉及一种药物组合物及其制备方法,特别涉及一种治疗滑膜炎和骨性关节炎的药 物组合物及其制备方法。
背景技术
滑膜炎是一种多发性疾病,其发病部位主要在膝关节。由于膝关节滑膜广泛并位于肢体 表较浅部位,故遭受损伤和感染的机会较多,膝关节滑膜炎主要是因膝关节扭伤和多种关节 内损伤,而造成的一组综合症。骨性关节炎(Knee Jio nt Osteo arthritis,简称KOA)是 一种老年性多发病,属中医“骨痹”、“膝痛”范畴。其主要临床表现为缓慢发展的关节痛、 僵硬、关节肿胀伴活动受限。目前中成药以滑膜炎为适应证的品种很少,西药治疗以非甾体 类抗炎药为主,疗效确切,但副作用大,容易产生胃溃疡等不良反应。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗滑膜炎和骨性关节炎的药物组合物及其制备方法。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的:
本发明药物组合物的原料药组成为:
本发明药物组合物的原料药组成优选为:
本发明药物组合物的原料药组成进一步优选为:
或
或
本发明药物组合物的制备方法为:
(1)取赤芍加有机溶剂提取,滤过,合并滤液,浓缩,干燥,粉碎成细粉;
(2)将组合物中其余十味原料药,加水煎煮,滤过,合并滤液,浓缩,加入有机溶剂, 静置,滤过,滤液浓缩干燥,粉碎成细粉,与步骤(1)中所得细粉混合,即得。
本发明药物组合物的制备方法优选为:
(1)取赤芍加2~20倍量的40%~90%乙醇,回流提取1~6次,每次0.2~4小时,滤 过,合并滤液,减压浓缩的温度为60℃,浓缩至相对密度为1.30~1.35的稠膏,减压干燥, 粉碎成细粉;
(2)将组合物中其余十味原料药,加2~20倍量水,煎煮1~5次,每次0.2~3小时, 滤过,合并滤液,减压浓缩的温度为60℃,滤液浓缩至相对密度为1.10~1.15的清膏,加 入乙醇使含醇量达到40%~90%,静置12~48小时,滤过,滤液回收乙醇,减压浓缩的温度 为60℃,浓缩至相对密度为1.30~1.35的稠膏,减压干燥,粉碎成细粉,与步骤(1)中所 得细粉混合,即得。
本发明药物组合物的制备方法进一步优选为:
(1)取赤芍加10倍量的70%乙醇,回流提取3次,每次0.5小时,滤过,合并滤液, 减压浓缩的温度为60℃,浓缩至相对密度为1.30~1.35的稠膏,减压干燥,粉碎成细粉;
(2)将组合物中其余十味原料药,加10倍量水,煎煮3次,每次1小时,滤过,合并 滤液,减压浓缩的温度为60℃,滤液浓缩至相对密度为1.10~1.15的清膏,加入乙醇使含 醇量达到60%,静置24小时,滤过,滤液回收乙醇,减压浓缩的温度为60℃,浓缩至相对 密度为1.30~1.35的稠膏,干燥,粉碎成细粉,与步骤(1)中所得细粉混合,即得。
本发明药物组合物根据中医配伍理论,采用桑枝、赤芍、连翘、川芎、牛膝、绵萆、 当归、黄芪、猪苓、泽泻、陈皮十一味药,共收清热祛湿,活血通络之功效;同时药效实验 结果表明,其对滑膜炎与关节炎与对照药相比具有良好的治疗作用;并且,本发明还对药物 组合物的提取工艺进行了考察验证,确定了最优提取方案。
下述实验例和实施例用于进一步证明但不限于本发明。
实验例1:提取工艺验证试验
1、赤芍干浸膏生产工艺验证试验
称取处方量药材,分别按照最佳生产工艺制备干浸膏,考察醇提浓缩-干燥二个关键工艺 步骤的芍药苷转移率等参数,以验证生产工艺的合理性。
将所得干浸膏研细后,精密称取0.45g于三角瓶中,精密加入50%甲醇100ml,称定重 量,超声处理30分钟,放冷再称定重量,用50%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续 滤液,以高效液相色谱法测定芍药苷的含量,计算芍药苷转移率、干浸膏重量、芍药苷含量, 结果见表1。计算公式如下:
干浸膏重量=(干浸膏+蒸发皿)重量-蒸发皿重量
芍药苷含量=对照品浓度×对照品进样量×样品峰面积×100ml/对照品峰面积/样品进样量/ 取样量
芍药苷转移率%=干浸膏中芍药苷含量/药材含量×100%
表1赤芍醇提工艺验证试验
从上述结果可知,芍药苷能得到较高的转移率,出膏率可控制在制剂允许范围内,表明 赤芍的醇提浓缩干燥工艺合理可行。
2、连翘等10味药材干浸膏粉工艺验证试验
称取处方量药材,分别按照最佳提取工艺制备干浸膏,并将干浸膏研细后,精密称取0.5g 于三角瓶中,精密加入50%甲醇250ml,称定重量,超声处理30分钟,放冷,再称定重量, 用50%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液以高效液相色谱法测定连翘苷的含量, 计算转移率。
计算连翘苷转移率、干浸膏重量、连翘苷含量,结果见表2。
计算公式如下:
干浸膏重量=(干浸膏+蒸发皿)重量-蒸发皿重量
连翘苷含量=对照品浓度*对照品进样量*样品峰面积/对照品峰面积/样品进样量/取样量
连翘苷转移率%=干浸膏测得含量/药材含量*100%
表2干浸膏中连翘苷转移率
从上述结果可知,连翘苷能得到较高的转移率,出膏率可控制在制剂允许范围内,表明 连翘等10味药的水提醇沉-浓缩干燥工艺合理可行。
实验例2:本发明药物组合物药效实验研究
一、实验材料
1.受试药物本发明药物组合物颗粒(由实施例1方法制备),含生药6.67g/g干浸膏粉, 亚宝药业集团有限公司提供,批号110604。阳性对照药滑膜炎颗粒,神威药业有限公司产品, 批号11041101。
2.剂量设计本发明药物组合物颗粒人临床日用量为48.0g生药,按60公斤体重计算, 用药剂量为0.8g生药/kg体重;按动物与人公斤体重等效剂量折算,小鼠剂量为17.6g、8.8g、 4.4g生药/kg;大鼠剂量为8.6g、4.3g、2.15g生药/kg;家兔剂量为5.0g、2.5g、1.25g生 药/kg。中剂量相当于临床等效剂量,高剂量为中剂量的两倍,低剂量为中剂量的1/2。滑膜 炎颗粒临床日用量为36.0g,折合0.6g/kg体重,小鼠用量13.2g/kg、大鼠用量6.5g/kg、家 兔用量3.7g/kg为临床等效剂量的两倍。
3.动物:CD(SD)、Wistar大鼠和CD-1(ICR)小鼠,北京维通利华实验动物技术有限公 司提供,动物许可证号分别为SCXK(京)2006-0009和SCXK(京)2011-0011;家兔,由北 京沙河通利实验动物养殖场提供,动物许可证号为SCXK(京)2010-0004。饲养于屏障环境, 室温22-25℃,自由进食与饮水。清洁级大、小鼠维持饲料,由北京科澳协力饲料有限公司 提供,合格证号:京饲审(2009)06166。实验动物使用许可证号:SYXK(京)2008-0023, 适用范围:屏障环境:小鼠、大鼠、豚鼠、兔,有效期为2008年11月17日至2013年11 月17日。
4.试剂:木瓜蛋白酶,aladdin产品,批号:38549;L-半胱氨酸,CIVI-CHEM产品, 批号:20110529;考马斯亮蓝蛋白、总超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)测定试剂盒, 南京建成生物工程研究所生产,批号分别为:20111028、20111011和20111013;白介素-6 (IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α)测定试剂盒,批号:20110909;白介素-1(IL-1)和前 列腺素E2(PGE2)测定试剂盒,批号:20111017,BlueGene公司产品;Freund’s完全佐剂, Sigma公司产品,批号F5881;角叉菜胶,Sigma公司产品,2011年分装;巴豆油,日本株 式会社产品,批号DCCL7737;甲醛,北京化工厂生产,批号:980219。
5.仪器:PV-200足趾容积测量仪,成都泰盟科技有限公司产品;RCY-2热板测痛仪,冀 星实验仪器有限公司生产;RT-6000酶标分析仪,深圳雷杜生命科学股份有限公司出品;AVE 型半自动生化分析仪,爱威科技实业有限公司产品;SA-5000自动血流变测试仪,北京赛科希 德科技发展有限公司产品;电热三用水箱,北京医疗设备厂有限责任公司生产;6K15型离心 机,Sigma公司产品;微量加样器:5-50、50-200、1000μl和1-5ml等规格,瑞士SOCOREX 产品。
二、方法和结果
1本发明药物组合物颗粒对关节炎模型动物的影响
1.1对骨性关节炎模型大鼠的影响
试验方法选取雄性SD大鼠,体重200-220g,按体重随机分为6组,分别为正常对照 组、模型对照组、本发明药物组合物颗粒高、中、低三个剂量组和阳性对照药滑膜炎颗粒组, 每组10只。除正常对照组外,分别在第1、3、7天,于大鼠右膝关节腔内注入4%木瓜蛋白 酶溶液与0.3mol/L半胱氨酸溶液(1:1),每只50μl。造模同时,分别灌胃给予本发明药 物组合物颗粒高、中、低三个剂量和阳性药滑膜炎颗粒,正常和模型对照组给予相同体积的 蒸馏水,灌胃体积为10ml/kg,每日一次,连续给药4周。末次药后1小时,用戊巴比妥钠 30mg/kg腹腔注射麻醉,大鼠麻醉后,经腹主动脉取血,3000rmp/min离心15min,分离血 清,测定血清总超氧化物歧化酶(SOD)活力及丙二醛(MDA)含量。同时取右侧膝关节滑膜 组织进行病理组织学检查,对炎症程度进行判定。
炎症程度判定标准:
“-”:膝关节滑膜组织结构正常。
“±”:膝关节滑膜组织细胞增生不明显。
“+”:膝关节滑膜组织细胞轻度增生,间质有充血。
“++”:膝关节滑膜充血、瘀血明显,并有细胞增生。
“+++”:膝关节滑膜间质血管充血明显,滑膜增厚,炎症细胞增生活跃。
“++++”:膝关节滑膜组织明显瘀血,炎症细胞明显增生,骨膜明显增厚。
表3本发明药物组合物颗粒对骨关节炎大鼠血清SOD活力和MDA含量的影响(±SD)
注:与模型对照组比较*P<0.05,**P<0.01。
表4本发明药物组合物颗粒对骨关节炎大鼠膝关节滑膜炎症程度的影响
注:秩和H0.05=78H0.01=71
试验结果以本发明药物组合物颗粒连续给药4周,所试剂量明显降低骨关节炎大鼠血 清MDA含量,高、中剂量明显增加血清SOD活力,与模型对照组相比均有显著性差异(表3)。 经秩和检验分析,本发明药物组合物颗粒高、中剂量可明显改善大鼠关节炎症浸润,与模型 对照组相比有显著性差异(表4)。结果表明,本发明药物组合物颗粒对大鼠骨性关节炎具有 治疗作用。
1.2对家兔运动性膝关节创伤性滑膜炎的影响
试验方法选取体重2.2-2.5kg家兔,雌雄各半,按体重随机分为6组,分别为正 常对照组、模型对照组、阳性对照药滑膜炎颗粒组(3.7g/kg)和本发明药物组合物颗 粒高、中、低(5.0g、2.5g、1.25g生药/kg)三个剂量组,每组8只。用人工使膝关节不 停的被动屈伸,每天两次,每次在10分钟内屈伸运动300次,共10天。造模同时开始 灌胃给药,连续10天,每日一次,灌胃体积2ml/kg体重。实验第11天,用3%戊巴比妥 钠按1ml/kg由耳缘静脉缓慢推注进行麻醉后,家兔颈动脉取血,3000rmp/min离心15min, 分离血清,检测血清SOD活性和MDA含量。然后膝关节注射生理盐水1ml,回抽关节液, 用考马斯亮蓝法检测其蛋白含量,并测定IL-1β和PGE2的含量,分别用pg/mg蛋白和ng/ mg蛋白表示其水平。打开关节,取出滑膜组织,10%福尔马林溶液固定,石蜡切片,HE 染色,进行病理切片炎症程度判定。
炎症程度判定标准:
“-”:膝关节滑膜未见充血、炎症,结构正常。
“±”:膝关节滑膜有充血、未见炎症。
“+”:膝关节滑膜有充血,细胞轻度增生。
“++”:膝关节滑膜充血明显,细胞增生明显。
“+++”:膝关节滑膜间质血管充血明显,滑膜增厚,炎症细胞增生活跃。
“++++”:膝关节滑膜增厚,严重充血、瘀血,大面积炎症细胞浸润。
表5本发明药物组合物颗粒对家兔膝关节液IL-1β和PGE2水平的影响(±SD)
注:与模型对照组相比*P<0.05,**P<0.01。
表6本发明药物组合物颗粒对家兔血清SOD活性和MDA含量的影响(±SD)
注:与模型对照组相比较*P<0.05,**P<0.01
表7本发明药物组合物颗粒对家兔膝关节滑膜炎症程度的影响
注:秩和H0.05=49H0.01=43
试验结果由表5、6可见,本发明药物组合物颗粒高剂量明显降低运动性膝关节创伤 性滑膜炎家兔关节腔滑膜液中PGE2含量;高、中剂量明显增加血清SOD活力和降低血清MDA 含量。本发明药物组合物颗粒高、中、低三个不同剂量组家兔膝关节滑膜病变与模型组相 比,有不同程度减轻。经秩和检验分析,本发明药物组合物颗粒所试剂量明显改善大鼠关节 炎症浸润,与模型对照组相比有显著性差异(表7)。结果表明本发明药物组合物颗粒对滑膜 炎具有治疗作用。
1.3本发明药物组合物颗粒对大鼠佐剂性关节炎的影响
试验方法选取160-180g雄性大鼠,按体重随机分为6组,分别为正常对照组、 模型对照组、阳性对照药滑膜炎颗粒组(6.5g/kg)和本发明药物组合物颗粒高、中、 低(8.6g、4.3g、2.15g生药/kg)三个剂量组,每组10只。试验前,先用足趾容积测量仪测 定大鼠左、右后足趾容积(ml)为基础值。于大鼠右后足垫皮内注射Freund’s完全佐剂 0.1ml/只致炎,致炎第二天测量足趾容积后开始灌胃给药,连续24天,每日一次,灌 胃容积为1ml/100g体重。分别于给药后4小时、第四天及以后每四天药后2小时测量各 组大鼠右后足容积,药后第8天开始,每四天测量致炎对侧足容积,按下列公式计算 各时间点肿胀值和抑制率,采用t检验分别比较各时间点给药组与模型对照组之间差 异的显著性,并每8天称体重一次,计算体重增长值。给药24天后,大鼠眶静脉丛取 血,离心,检测血清IL-6和TNF-α,并处死大鼠,摘取胸腺、脾脏器称重,计算重量 指数,并分别按下式计算肿胀值(ml)和抑制率(%):
肿胀值(ml)=致炎后足趾容积(ml)-致炎前足趾容积(ml)
表8本发明药物组合物颗粒对佐剂性关节炎大鼠体重增长的影响(±SD,n=10)
注:与模型对照组相比*P<0.05,**P<0.01。
表11本发明药物组合物颗粒对佐剂性关节炎大鼠脏器指数的影响(±SD,n=10)
表12本发明药物组合物颗粒对佐剂性关节炎大鼠血清IL-6和TNF-α含量的影响
注:与模型对照组相比较*P<0.05,**P<0.01。
试验结果表8结果可见,注射佐剂后大鼠体重增长缓慢,本发明药物组合物颗粒 各剂量组药后可不同程度地改善由佐剂引起的体重增长缓慢的状况,高剂量组体重增 长与模型对照组相比有显著性差异。表9、10、11结果显示,模型对照组在致炎后12 天左右踝关节肿胀达高峰,此后逐渐消退;本发明药物组合物颗粒高、中剂量给药组, 在给药当天开始起效,与模型对照组相比有显著性差异,一直持续到实验结束;对致 炎对侧足踝关节继发肿胀亦有不同程度的抑制作用;对胸腺、脾脏器指数无明显影响。 由表12可见,本发明药物组合物颗粒高、中剂量对佐剂性关节炎大鼠血清TNF-α的升 高有明显的抑制作用。结果提示:本发明药物组合物颗粒对大鼠佐剂性关节炎具有一 定的治疗作用,可能是通过抑制炎症细胞因子TNF-α发挥作用。
2.本发明药物组合物颗粒对一般炎症的影响
2.1对小鼠耳壳巴豆油性炎症的影响
试验方法小鼠按体重随机分组(见表13),用2%巴豆油0.05ml涂于右耳前后两面, 左耳为对照,致炎后半小时,分别灌胃给予本发明药物组合物颗粒(17.6g、8.8g、4.4g生 药/kg)三个剂量和阳性对照药滑膜炎颗粒(13.2g/kg),模型对照组给予相同体积的蒸馏 水。致炎后4小时将小鼠处死,沿耳廓基线剪下两耳,用直径8mm的不锈钢冲子在同一部位 分别冲下耳片,称重。以左右耳片的重量差为肿胀值,用t检验进行统计学处理。
表13本发明药物组合物颗粒对巴豆油诱发小鼠耳水肿的影响(±SD)
注:与模型对照组相比*P<0.05,**P<0.01。
试验结果本发明药物组合物颗粒高、中剂量对巴豆油引起的小鼠耳肿胀均有较强 的抑制作用(表13)。提示本发明药物组合物颗粒具有一定的抗炎作用。
2.2对大鼠角叉菜胶性足肿胀的影响
试验方法160-180g SD健康大鼠50只,按体重随机分为5组,分别为模型对照 组、阳性对照药滑膜炎颗粒(6.5g/kg)组和本发明药物组合物颗粒高、中、低(8.6g、 4.3g、2.15g生药/kg)三个剂量组,每组10只。实验开始时,用足趾容积测量仪测定大鼠 右后足容积(ml)为基础值,每组分别灌胃给予大鼠相应药液,灌胃容积为10ml/kg体 重,模型对照组给予相同容积的蒸馏水。给药后1小时,于每只大鼠右侧后足跖中央 皮下注射1%角叉菜胶溶液0.1ml,分别于致炎后1、2、4、6小时各测一次右后足跖容 积,计算出肿胀值(致炎后与致炎前容积之差),分别比较各时间点给药组与模型对照 组之间的差异性,按下列公式计算各时间点给药组的肿胀抑制率(%):
表14本发明药物组合物颗粒对大鼠角叉菜胶性足肿胀的影响(n=10)
注:与模型对照组相比*P<0.05,**P<0.01。
实验结果由表14可见,在6小时的观察期间,本发明药物组合物颗粒三个剂量对角叉 菜胶性足肿胀均有不同程度的抑制作用,高、中剂量作用明显。提示本发明药物组合物颗粒 具有一定的抗炎作用。
3.本发明药物组合物颗粒的镇痛作用
3.1本发明药物组合物颗粒对醋酸刺激致小鼠疼痛反应的影响(扭体法)
试验方法取健康小鼠,按体重随机分为5组,分别为模型对照组、阳性对照滑膜炎颗 粒组、本发明药物组合物颗粒(17.6g、8.8g、4.4g生药/kg)三个剂量组,每组10只,每日 灌胃给药一次,灌胃容积为0.2ml/10g体重(模型对照组给予相同容积的蒸馏水),连 续三天。末次药后1小时,每鼠腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2ml,记录致痛5分钟后15分钟内小 鼠扭体次数,扭体数以t检验进行统计学处理。
表15本发明药物组合物颗粒对醋酸致小鼠扭体反应的影响(±SD)
注:与模型对照组相比*P<0.05。
结果表15结果表明,本发明药物组合物颗粒可显著减少醋酸引起的小鼠扭体发生数, 高、中剂量组小鼠扭体次数与模型对照组相比,有显著性差异。提示本发明药物组合物颗粒 具有一定的镇痛作用。
3.2本发明药物组合物颗粒对热刺激致小鼠疼痛反应的影响(热板法)
实验方法选取体重20-21g小鼠,用热板测痛仪,记录小鼠自放入热板至出现舔足所 需时间(秒),该时间作为小鼠的痛阈值,凡小鼠舔足时间小于5秒或大于30秒或跳跃者均 弃之不用。将合格小鼠随机分为5组,分别为正常对照组、阳性对照药滑膜炎颗粒组和本 发明药物组合物颗粒高、中、低三个剂量组,各组分别灌胃给予药物,每日一次,灌胃容积 为0.2ml/10g体重,正常对照组给予相同容积的蒸馏水,连续3天。末次药后1小时和2小 时,以前述方法测定痛阈值。以t检验进行统计学处理。
表16本发明药物组合物颗粒对热板致小鼠疼痛反应的影响(±SD)
注:与正常对照组相比*P<0.05,**P<0.01。
试验结果采用小鼠热板法试验结果显示,本发明药物组合物颗粒所试剂量明显提高热 刺激致小鼠疼痛的痛阈值,与正常对照组相比有显著性差异。提示本发明药物组合物颗粒具 有一定的镇痛作用。
4.本发明药物组合物颗粒对肾上腺素结合冰水浸泡致大鼠血粘度增高的影响
实验方法选取Wistar大鼠,体重200-220g,按体重随机分为6组,分别为正常对照 组、模型对照组、本发明药物组合物颗粒高、中、低三个剂量组和阳性对照药滑膜炎颗粒组, 每组10只。分别灌胃给予药物,正常和模型对照组给予相同体积的蒸馏水,灌胃容积为 10ml/kg,连续7天。末次药后1小时,除正常对照组外,其余大鼠皮下注射肾上腺素10μ g/ml(0.08ml/100g体重)共2次,两次间隔4小时,在两次注射肾上腺素之间(前后各间隔 2小时)将大鼠浸入冰水内5分钟,处置后禁食16小时,股动脉取血,肝素钠抗凝,测定 1s-1、5s-1、50s-1、100s-1和200s-1切变率下的全血粘度。
试验结果本发明药物组合物颗粒所试剂量明显抑制皮下注射肾上腺素结合冰水浸泡 致大鼠全血粘度增高,高、中剂量组大鼠在不同切变率下全血粘度值均明显低于模型对照组 (表17)。提示本发明药物组合物颗粒具有一定的活血化瘀作用。
实验例3:药物组合物药效比较研究
一、实验材料
1.受试药物
组合物A:本发明药物组合物,按实施例1方法制备;
组合物B:川芎275g 黄芪413g 丹参413g 猪苓413g 牛膝275g 赤芍330g 泽 泻330g 萆248g 连翘413g,按与组合物A同样方法制备;
组合物A、B均含生药6.67g/g干浸膏粉,亚宝药业集团股份有限公司提供。
2.剂量设计组合物A人临床日用量为48.0g生药,按60公斤体重计算,用药剂量为0.8g 生药/kg体重;按动物与人公斤体重等效剂量折算,小鼠剂量为17.6g、8.8g、4.4g生药/kg; 大鼠剂量为8.6g、4.3g、2.15g生药/kg;家兔剂量为5.0g、2.5g、1.25g生药/kg;中剂量 相当于临床等效剂量,高剂量为中剂量的两倍,低剂量为中剂量的1/2。组合物B人临床日用 量为48.0g生药,实验选用临床等效剂量的两倍,即小鼠剂量为17.6g生药/kg,大鼠剂量为 8.6g生药/kg,家兔剂量为5.0g生药/kg。
3.动物同实验例2。
4.试剂:同实验例2。
5.仪器:同实验例2。
二、方法和结果
1组合物A、B对关节炎模型动物的影响
1.1对骨性关节炎模型大鼠的影响
试验方法选取雄性SD大鼠,体重200-220g,按体重随机分为6组,分别为正常对照 组、模型对照组、组合物A高、中、低三个剂量组和组合物B组,每组10只。除正常对照 组外,分别在第1、3、7天,于大鼠右膝关节腔内注入4%木瓜蛋白酶溶液与0.3mol/L半胱 氨酸溶液(1:1),每只50μl。造模同时,分别灌胃给予组合物A高、中、低三个剂量和组 合物B,正常和模型对照组给予相同体积的蒸馏水,灌胃体积为10ml/kg,每日一次,连续 给药4周。末次药后1小时,用戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉,大鼠麻醉后,经腹主动 脉取血,3000rmp/min离心15min,分离血清,测定血清总超氧化物歧化酶(SOD)活力及丙 二醛(MDA)含量。同时取右侧膝关节滑膜组织进行病理组织学检查,对炎症程度进行判 定。
表18组合物A、B对骨关节炎大鼠血清SOD活力和MDA含量的影响(±SD)
注:与模型对照组比较*P<0.05,**P<0.01。
表19镜下大鼠膝关节滑膜炎症统计
炎症程度判定标准:
“-”:膝关节滑膜组织结构正常。
“±”:膝关节滑膜组织细胞增生不明显。
“+”:膝关节滑膜组织细胞轻度增生,间质有充血。
“++”:膝关节滑膜充血、瘀血明显,并有细胞增生。
“+++”:膝关节滑膜间质血管充血明显,滑膜增厚,炎症细胞增生活跃。
“++++”:膝关节滑膜组织明显瘀血,炎症细胞明显增生,骨膜明显增厚。
表20组合物A、B对骨关节炎大鼠膝关节滑膜炎症程度的影响
注:秩和H0.05=78 H0.01=71
试验结果以组合物A连续给药4周,所试剂量明显降低骨关节炎大鼠血清MDA含量,高、 中剂量明显增加血清SOD活力,与模型对照组相比均有显著性差异(表18)。经秩和检验分 析,组合物A高、中剂量可明显改善大鼠关节炎症浸润,与模型对照组相比有显著性差异(表 19-20)。结果表明,组合物A对大鼠骨性关节炎具有治疗作用。
1.2对家兔运动性膝关节创伤性滑膜炎的影响
试验方法 选取体重2.2-2.5kg家兔,雌雄各半,按体重随机分为6组,分别为正 常对照组、模型对照组、组合物B组和组合物A高、中、低三个剂量组,每组8只。用人 工使膝关节不停的被动屈伸,每天两次,每次在10分钟内屈伸运动300次,共10天。 造模同时开始灌胃给药,连续10天,每日一次,灌胃体积2ml/kg体重。实验第11天, 用3%戊巴比妥钠按1ml/kg由耳缘静脉缓慢推注进行麻醉后,家兔颈动脉取血, 3000rmp/min离心15min,分离血清,检测血清SOD活性和MDA含量。然后膝关节注射生理 盐水1ml,回抽关节液,用考马斯亮蓝法检测其蛋白含量,并测定IL-1β和PGE2的含量, 分别用pg/mg蛋白和ng/mg蛋白表示其水平。打开关节,取出滑膜组织,10%福尔马林溶 液固定,石蜡切片,HE染色,进行病理切片炎症程度判定。
表21组合物A、B对家兔膝关节液IL-1β和PGE2水平的影响(±SD)
注:与模型对照组相比*P<0.05,**P<0.01。
表22组合物A、B对家兔血清SOD活性和MDA含量的影响(±SD)
注:与模型对照组相比较*P<0.05,**P<0.01
表23镜下家兔膝关节滑膜炎症半定量统计
炎症程度判定标准:
“-”:膝关节滑膜未见充血、炎症,结构正常。
“±”:膝关节滑膜有充血、未见炎症。
“+”:膝关节滑膜有充血,细胞轻度增生。
“++”:膝关节滑膜充血明显,细胞增生明显。
“+++”:膝关节滑膜间质血管充血明显,滑膜增厚,炎症细胞增生活跃。
“++++”:膝关节滑膜增厚,严重充血、瘀血,大面积炎症细胞浸润。
表24组合物A、B对家兔膝关节滑膜炎症程度的影响
注:秩和H0.05=49H0.01=43
试验结果由表21、22可见,组合物A高剂量明显降低运动性膝关节创伤性滑膜炎家兔关 节腔滑膜液中PGE2含量;高、中剂量明显增加血清SOD活力和降低血清MDA含量。经秩和检 验分析,组合物A所试剂量明显改善大鼠关节炎症浸润,与模型对照组相比有显著性差异(表 22)。结果表明组合物A对滑膜炎具有治疗作用。
1.3组合物A、B对大鼠佐剂性关节炎的影响
试验方法选取160-180g雄性大鼠,按体重随机分为6组,分别为正常对照组、模 型对照组、组合物B组和组合物A高、中、低三个剂量组,每组10只。试验前,先用足 趾容积测量仪测定大鼠左、右后足趾容积(ml)为基础值。于大鼠右后足垫皮内注射 Freund’s完全佐剂0.1ml/只致炎,致炎第二天测量足趾容积后开始灌胃给药,连续24 天,每日一次,灌胃容积为1ml/100g体重。分别于给药后4小时、第四天及以后每四 天药后2小时测量各组大鼠右后足容积,药后第8天开始,每四天测量致炎对侧足容积, 按下列公式计算各时间点肿胀值和抑制率,采用t检验分别比较各时间点给药组与模 型对照组之间差异的显著性,并每8天称体重一次,计算体重增长值。给药24天后, 大鼠眶静脉丛取血,离心,检测血清IL-6和TNF-α,并处死大鼠,摘取胸腺、脾脏器 称重,计算重量指数,并分别按下式计算肿胀值(ml)和抑制率(%):
肿胀值(ml)=致炎后足趾容积(ml)-致炎前足趾容积(ml)
表25组合物A、B对佐剂性关节炎大鼠体重增长的影响(±SD,n=10)
注:与模型对照组相比*P<0.05,**P<0.01。
表28组合物A、B对佐剂性关节炎大鼠脏器指数的影响(±SD,n=10)
表29组合物A、B对佐剂性关节炎大鼠血清IL-6和TNF-α含量的影响
注:与模型对照组相比较*P<0.05,**P<0.01。
试验结果表25结果可见,注射佐剂后大鼠体重增长缓慢,组合物A各剂量组药后可不 同程度地改善由佐剂引起的体重增长缓慢的状况,高剂量组体重增长与模型对照组相 比有显著性差异。表26、27、28结果显示,模型对照组在致炎后12天左右踝关节肿胀 达高峰,此后逐渐消退;组合物A高、中剂量给药组,在给药当天开始起效,与模型 对照组相比有显著性差异,一直持续到实验结束;对致炎对侧足踝关节继发肿胀亦有 不同程度的抑制作用;对胸腺、脾脏器指数无明显影响。由表29可见,组合物A高、 中剂量对佐剂性关节炎大鼠血清TNF-α的升高有明显的抑制作用。结果提示:组合物 A对大鼠佐剂性关节炎具有一定的治疗作用,可能是通过抑制炎症细胞因子TNF-α发 挥作用。
2.组合物A、B对一般炎症的影响
2.1对小鼠耳壳巴豆油性炎症的影响
试验方法小鼠按体重随机分组(见表30),用2%巴豆油0.05ml涂于右耳前后两面, 左耳为对照,致炎后半小时,分别灌胃给予组合物A三个剂量和组合物B,模型对照组给予 相同体积的蒸馏水。致炎后4小时将小鼠处死,沿耳廓基线剪下两耳,用直径8mm的不锈 钢冲子在同一部位分别冲下耳片,称重。以左右耳片的重量差为肿胀值,用t检验进行统 计学处理。
表30组合物A、B对巴豆油诱发小鼠耳水肿的影响(±SD)
注:与模型对照组相比*P<0.05,**P<0.01。
试验结果组合物A高、中剂量对巴豆油引起的小鼠耳肿胀均有较强的抑制作用(表 30)。提示组合物A具有一定的抗炎作用。
2.2对大鼠角叉菜胶性足肿胀的影响
试验方法160-180g SD健康大鼠50只,按体重随机分为5组,分别为模型对照组、 组合物B组和组合物A高、中、低三个剂量组,每组10只。实验开始时,用足趾容积测量 仪测定大鼠右后足容积(ml)为基础值,每组分别灌胃给予大鼠相应药液,灌胃容积为 10ml/kg体重,模型对照组给予相同容积的蒸馏水。给药后1小时,于每只大鼠右侧后 足跖中央皮下注射1%角叉菜胶溶液0.1ml,分别于致炎后1、2、4、6小时各测一次右 后足跖容积,计算出肿胀值(致炎后与致炎前容积之差),分别比较各时间点给药组与 模型对照组之间的差异性,按下列公式计算各时间点给药组的肿胀抑制率(%):
表31组合物A、B对大鼠角叉菜胶性足肿胀的影响(n=10)
注:与模型对照组相比*P<0.05,**P<0.01。
实验结果由表31可见,在6小时的观察期间,组合物A三个剂量对角叉菜胶性足肿胀均 有不同程度的抑制作用,高、中剂量作用明显。提示组合物A具有一定的抗炎作用。
3.组合物A、B的镇痛作用
3.1组合物A、B对醋酸刺激致小鼠疼痛反应的影响(扭体法)
试验方法取健康小鼠,按体重随机分为5组,分别为模型对照组、组合物B组、组合物 A三个剂量组,每组10只,每日灌胃给药一次,灌胃容积为0.2ml/10g体重(模型对照组 给予相同容积的蒸馏水),连续三天。末次药后1小时,每鼠腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2ml, 记录致痛5分钟后15分钟内小鼠扭体次数,扭体数以t检验进行统计学处理。
表32组合物A、B对醋酸致小鼠扭体反应的影响
注:与模型对照组相比*P<0.05。
结果表32结果表明,组合物A可显著减少醋酸引起的小鼠扭体发生数,高、中剂量组小鼠 扭体次数与模型对照组相比,有显著性差异。提示组合物A具有一定的镇痛作用。
3.2组合物A、B对热刺激致小鼠疼痛反应的影响(热板法)
实验方法选取体重20-21g小鼠,用热板测痛仪,记录小鼠自放入热板至出现舔足所 需时间(秒),该时间作为小鼠的痛阈值,凡小鼠舔足时间小于5秒或大于30秒或跳跃者 均弃之不用。将合格小鼠随机分为5组,分别为正常对照组、组合物B组和组合物A高、 中、低三个剂量组,各组分别灌胃给予药物,每日一次,灌胃容积为0.2ml/10g体重,正 常对照组给予相同容积的蒸馏水,连续3天。末次药后1小时和2小时,以前述方法测定 痛阈值。以t检验进行统计学处理。
表33组合物A、B对热板致小鼠疼痛反应的影响(±SD)
注:与正常对照组相比*P<0.05,**P<0.01。
试验结果采用小鼠热板法试验结果显示,组合物A所试剂量明显提高热刺激致小鼠 疼痛的痛阈值,与正常对照组相比有显著性差异。提示组合物A具有一定的镇痛作用。
4.组合物A、B对肾上腺素结合冰水浸泡致大鼠血粘度增高的影响
实验方法选取Wistar大鼠,体重200-220g,按体重随机分为6组,分别为正常对 照组、模型对照组、组合物A高、中、低三个剂量组和组合物B组,每组10只。分别灌胃 给予药物,正常和模型对照组给予相同体积的蒸馏水,灌胃容积为10ml/kg,连续7天。末 次药后1小时,除正常对照组外,其余大鼠皮下注射肾上腺素10μg/ml(0.08ml/100g体重) 共2次,两次间隔4小时,在两次注射肾上腺素之间(前后各间隔2小时)将大鼠浸入冰 水内5分钟,处置后禁食16小时,股动脉取血,肝素钠抗凝,测定1s-1、5s-1、50s-1、100s-1和200s-1切变率下的全血粘度。
试验结果组合物A所试剂量明显抑制皮下注射肾上腺素结合冰水浸泡致大鼠全血粘度 增高,高、中剂量组大鼠在不同切变率下全血粘度值均明显低于模型对照组(表34)。提示组 合物A具有一定的活血化瘀作用。
具体实施方式
实施例1:颗粒剂
取赤芍加10倍量的70%乙醇,回流提取3次,每次0.5小时,滤过,合并滤液,减压 浓缩的温度为60℃,浓缩至相对密度为1.30~1.35的稠膏,减压干燥,粉碎成细粉;将组 合物中其余十味原料药,加10倍量水,煎煮3次,每次1小时,滤过,合并滤液,减压浓 缩的温度为60℃,滤液浓缩至相对密度为1.10~1.15的清膏,加入乙醇使含醇量达到60%, 静置24小时,滤过,滤液回收乙醇,减压浓缩的温度为60℃,浓缩至相对密度为1.30~ 1.35的稠膏,干燥,粉碎成细粉,与赤芍提取所得细粉混合,加入常规辅料,按照常规工 艺制成颗粒剂。
实施例2:片剂
取赤芍加2倍量的90%乙醇,回流提取6次,每次0.2小时,滤过,合并滤液,减压浓 缩的温度为60℃,浓缩至相对密度为1.30~1.35的稠膏,减压干燥,粉碎成细粉;将组合 物中其余十味原料药,加2倍量水,煎煮5次,每次3小时,滤过,合并滤液,减压浓缩 的温度为60℃,滤液浓缩至相对密度为1.10~1.15的清膏,加入乙醇使含醇量达到40%, 静置12小时,滤过,滤液回收乙醇,减压浓缩的温度为60℃,浓缩至相对密度为1.30~ 1.35的稠膏,干燥,粉碎成细粉,与赤芍提取所得细粉混合,加入常规辅料,按照常规工 艺制成片剂。
实施例3:丸剂
取赤芍加20倍量的40%乙醇,回流提取1次,每次4小时,滤过,合并滤液,减压浓 缩的温度为60℃,浓缩至相对密度为1.30~1.35的稠膏,减压干燥,粉碎成细粉;将组合 物中其余十味原料药,加20倍量水,煎煮1次,每次0.2小时,滤过,合并滤液,减压浓 缩的温度为60℃,滤液浓缩至相对密度为1.10~1.15的清膏,加入乙醇使含醇量达到90%, 静置48小时,滤过,滤液回收乙醇,减压浓缩的温度为60℃,浓缩至相对密度为1.30~ 1.35的稠膏,干燥,粉碎成细粉,与赤芍提取所得细粉混合,加入常规辅料,按照常规工 艺制成丸剂。
实施例4:胶囊剂
取赤芍加15倍量的50%乙醇,回流提取2次,每次3小时,滤过,合并滤液,减压浓 缩的温度为60℃,浓缩至相对密度为1.30~1.35的稠膏,减压干燥,粉碎成细粉;将组合 物中其余十味原料药,加15倍量水,煎煮2次,每次0.5小时,滤过,合并滤液,减压浓 缩的温度为60℃,滤液浓缩至相对密度为1.10~1.15的清膏,加入乙醇使含醇量达到80%, 静置36小时,滤过,滤液回收乙醇,减压浓缩的温度为60℃,浓缩至相对密度为1.30~ 1.35的稠膏,干燥,粉碎成细粉,与赤芍提取所得细粉混合,加入常规辅料,按照常规工 艺制成胶囊剂。
实施例5:口服液
取赤芍加5倍量的80%乙醇,回流提取5次,每次0.5小时,滤过,合并滤液,减压浓 缩的温度为60℃,浓缩至相对密度为1.30~1.35的稠膏,减压干燥,粉碎成细粉;将组合 物中其余十味原料药,加8倍量水,煎煮4次,每次2小时,滤过,合并滤液,减压浓缩 的温度为60℃,滤液浓缩至相对密度为1.10~1.15的清膏,加入乙醇使含醇量达到50%, 静置24小时,滤过,滤液回收乙醇,减压浓缩的温度为60℃,浓缩至相对密度为1.30~ 1.35的稠膏,干燥,粉碎成细粉,与赤芍提取所得细粉混合,加入常规辅料,按照常规工 艺制成口服液。
实施例6注射剂
取赤芍加12倍量的60%甲醇,回流提取2次,每次2小时,滤过,合并滤液,减压浓 缩的温度为60℃,浓缩至相对密度为1.30~1.35的稠膏,减压干燥,粉碎成细粉;将组合 物中其余十味原料药,加12倍量水,煎煮2次,每次0.5小时,滤过,合并滤液,减压浓 缩的温度为60℃,滤液浓缩至相对密度为1.10~1.15的清膏,加入甲醇使含醇量达到80%, 静置48小时,滤过,滤液回收乙醇,减压浓缩的温度为60℃,浓缩至相对密度为1.30~ 1.35的稠膏,干燥,粉碎成细粉,与赤芍提取所得细粉混合,加入常规辅料,按照常规工 艺制成注射剂。
机译: 化合物,其制备方法,药物组合物,抑制二肽基肽酶-iv的方法,用于治疗由抑制二肽基肽酶-iv介导的疾病,提高的胰岛新生,b细胞存活和胰岛素生物合成的疾病的患者治疗或控制糖尿病,高血糖,肥胖,胰岛素抵抗,一种或多种疾病,动脉粥样硬化,哺乳动物患者的一种或多种疾病,中性粒细胞减少和贫血的一种或多种疾病,以治疗或控制生长激素缺乏症和艾滋病毒感染在哺乳动物患者中,调节哺乳动物患者的免疫反应,减少精子运动,并产生药物组合物,以及药物组合
机译: 包合物,一种分离环糊精衍生物的方法,一种制备环糊精衍生物的方法,一种分离的环糊精单取代的方法。提高溶解度的方法,环糊精衍生物,药物组合物,一种治疗宿主动物的方法,组合物cromatografica,偶联的环糊精包合物的制备方法,提供环糊精包合物的药物稳定剂的过程。向宿主动物供应药物的方法,包合物的制备方法,直肠
机译: 式(i)的化合物,式(ii)的化合物,式(iii)的化合物,式(i)的化合物的制备方法,式(ii)的化合物的制备方法,式(iii)的化合物的制备方法,药物组合物,抑制细胞中一个或多个垫家族的方法,治疗由一个或多个垫介导的病症的方法,该化合物的用途,用于治疗和/或预防由一种或多种疾病介导的病症的方法垫家族,类风湿关节炎的治疗方法和癌症的治疗方法