一种打破北乌头种子休眠的方法

摘要

本发明涉及中药材栽培技术领域，尤其涉及一种打破北乌头种子休眠的方法。该方法：北乌头种子杀菌后，以浓度为300mg/L～400mg/L的赤霉素处理；将赤霉素处理后的种子进行高低温交替培养后于0℃～5℃培养；高低温交替培养过程中，低温培养的温度为14℃～16℃，时间为11h～13h；高温培养的温度为19℃～21℃，时间为11h～13h。发明结合赤霉素及变温处理北乌头种子，能够快速打破北乌头种子休眠，将北乌头种子传统技术条件下至少90d的休眠期缩短至40d左右，发芽率提高到78.65％。

说明书

技术领域

本发明涉及中药材栽培技术领域，尤其涉及一种打破北乌头种子休眠的方法。

背景技术

毛茛科乌头属植物分为乌头亚属(Subgen Aconitum)、露蕊乌头亚属(Subgen Paraconitum)和牛扁亚属(Subgen Gymnaconitum)。其中，乌头亚属又分为乌头组和多果乌头组，乌头组又分为兴安乌头系、短柄乌头系、褐紫乌头系、保山乌头系、准噶尔乌头系、岩乌头系、圆叶乌头系、显柱乌头系、甘青乌头系、蔓乌头系。乌头属植物多含有乌头碱等生物碱，多数种类的块根有剧毒。乌头属植物中约有36种可供药用。但不同种的乌头形态特征、生长习性、药用价值皆有不同。例如：

乌头(Aconitum carmichaeli Debx.)属乌头亚属蔓乌头系，乌头主产四川、陕西。云南、贵州、河北、湖南、湖北、江西、甘肃等省有栽培。生山地草坡或灌丛中。乌头种子长3～3.2毫米，三棱形，只在二面密生横膜翅。花期9～10月，果期10月至11月。《中国药典2010》规定其干燥块根为“川乌”。具有祛风除湿、温经止痛。用于风寒湿痹、关节疼痛、心腹冷痛、寒疝作痛及麻醉止痛。

露蕊乌头(Aconitum gymnandrum Maxim.)属露蕊乌头亚属，分布于西藏、四川西部、青海、甘肃南部。生于山地草坡、田边草地或河边砂地。种子倒卵球形、密生横狭翅。花期6～8月。具有祛风镇痛的作用，用于祛风湿、止痛、杀虫等。

黄花乌头(Aconitum coreanum(H.Lév.)Rapaics)属乌头亚属短柄乌头系，分布于中国、朝鲜、俄罗斯远东地区，生于山地草坡或疏林中。种子长约椭圆形，具三条纵棱，花期8～9月。治偏正头痛、寒湿痹痛、口眼歪斜等症，外用可治疥癣。块根水浸液可作农药，防治小麦杆锈病。

北乌头(Aconitum kusnezoffii Rchb)属乌头亚属蔓乌头系，在我国主要分布在山西、河北、内蒙古、辽宁、吉林和黑龙江，生于山坡或草甸上。北乌 头的种子长约2.5毫米，扁椭圆球形，沿棱具狭翅，只在一面生横膜翅。花期7～9月。《中国药典2010》规定其干燥块根为“草乌”，具有祛风除湿、温经止痛的功能，用于风寒湿痹，关节疼痛，心腹冷痛，寒疝作痛及麻醉止痛。目前，草乌在强心、镇痛、抗炎、调节免疫等方面已显示了良好的应用基础。以草乌为主要原料的“乌头注射液”与目前常用镇痛药“杜冷丁”相比，在治疗晚期癌症疼痛等方面疗效显著，且无成瘾性，得到了广泛的应用。对草乌资源的需求日益提高。

但是，由于生态环境严重破坏及人为的采挖，北乌头野生资源趋于枯竭。因产地及习惯上的不同也将黄草乌、多裂乌头、瓜叶乌头、圆锥序乌头、松潘乌头及太白乌头的干燥块根当草乌用，造成市场草乌基源品混乱，中药的有效性、安全性和稳定性难以控制。因此，进行北乌头引种驯化，使野生变家种，实现北乌头资源的迁地保护及可持续利用显得尤为重要。北乌头种子存在胚后熟及生理后熟，即尽管种子的形态上已经发育成熟，但胚尚未完成发育，种胚体积较小，结构不完善，必须要再经过一段时间发育使胚成熟后，种子才具备萌发的条件。北乌头种子的这种特性使北乌头在种子繁殖的过程中出现萌发率低、发芽慢、发芽不整齐的现象。其休眠期长、发芽率低等问题成为北乌头规模化生产的主要瓶颈，严重影响了北乌头的种子繁殖效果。

目前，人工种植北乌头虽然可以采用块根繁殖或切芽繁殖等无性繁殖方式，但利用无性繁殖存在诸多缺陷，如(1)采用块根繁殖，其繁殖系数较低，一株野生品仅能繁殖3～5株栽培品；(2)当采用块根进行多代繁殖后，种苗将出现退化现象，具体表现抗性差、病害多、产量低等方面；(3)采用块根繁殖同样会对野生资源造成毁灭性的伤害。

因此，打破北乌头种子休眠，提高其萌发率，将成为改变北乌头栽培模式的关键技术，同时将会促进北乌头产业的发展。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种快速打破北乌头种子休眠、提高北乌头种子发芽率的方法。

本发明提供的打破北乌头种子休眠的方法包括：

北乌头种子杀菌后，以浓度为300mg/L～400mg/L的赤霉素处理；

将赤霉素处理后的种子进行高低温交替培养后于0℃～5℃培养；

高低温交替培养过程中，低温培养的温度为14℃～16℃，时间为11h～13h；高温培养的温度为19℃～21℃，时间为11h～13h。

北乌头种子的萌芽率低是造成目前北乌头种子繁殖瓶颈的核心问题。乌头属植物种子中普遍存在胚后熟现象，但现有的研究结果表明：不同种的乌头属植物对催芽条件的响应也不同，表现为：不同种间对同种植物激素最适浓度不同；不同种间对不同的植物激素响应不同；不同种间对诱导温度的响应也不同。本发明通过实验证明，北乌头种子杀菌后，经赤霉素浸泡和变温培养后，种子萌发率可达78％以上，并且将种子的休眠期缩短为40d左右。

作为优选，低温培养的温度为15℃，时间为12h；高温培养的温度为20℃，时间为12h；高低温交替培养后于3℃培养。

作为优选，变温培养的空气湿度为65％～70％。

北乌头种子的休眠时间受温度影响较大，本发明通过实验证明，采用本发明提供的变温方法培养，可以显著提高种子的发芽率。

作为优选，将种子置于两层湿润的滤纸上变温培养。

作为优选，本发明提供的打破北乌头种子休眠的方法在黑暗条件下进行。

作为优选，交替培养后，北乌头种子的胚率不小于80％。

胚率是指胚长占胚乳长的百分比。研究实践表明，胚率达80％以上，此时胚已分化出子叶、胚芽、胚轴、胚根，基本上完成形态后熟。但是，此时种子还不能萌发，必须在低温条件下进行生理后熟，生理后熟期间胚在形态上不发生任何变化，只是胚体增大。只有当北乌头种子完成了形态后熟和生理后熟后才能够萌发，且形态后熟和生理后熟间存在着严格的顺序性和不可逆性，因此，只有当北乌头种子经变温培养至胚率不小于80％后，进行低温培养使其进入生理后熟，才能保证最终的种子发芽率。

作为优选，高低温交替培养的时间为18d～22d。

优选的，高低温交替培养的时间为20d。

作为优选，0℃～5℃培养的时间为17d～25d。

优选的，0℃～5℃培养的时间为20d。

作为优选，赤霉素的浓度为300mg/L。

作为优选，赤霉素处理的时间为24h。

赤霉素是一种植物激素，可刺激叶和芽的生长。现有技术表明，赤霉素对不同种的乌头属植物的最适浓度是不一致的。但目前，并未见赤霉素用于打破北乌头种子休眠的报道。并且，由于种子萌发的营养完全依赖于胚乳，而当赤霉素浓度过高，虽然可能会使种胚在赤霉素的刺激下迅速的长大，却可能会使胚乳贮藏的营养物质大量水解，不能及时被胚生长发育利用，致使胚乳液化，最终导致种子腐烂、死亡。本发明通过实验证实，当赤霉素浓度为300mg/L时，最有利于种子的萌发，且烂种率较低。

作为优选，杀菌采用质量分数为1％的次氯酸钠水溶液。

作为优选，杀菌的时间为5～10min。

作为优选，杀菌与赤霉素处理之间，还包括蒸馏水冲洗的步骤；冲洗的次数为3～5次。

种子在培养过程中霉烂是因为其表皮中携带有大量的细菌或真菌所致。本发明采用质量分数为1％的次氯酸钠水溶液对种子进行杀菌处理后，再对种子进行培养。实验证实，采用本发明提供的方法进行杀菌，北乌头种子的烂种率不超过10％。

本发明提供的打破北乌头种子休眠的方法包括：北乌头种子杀菌后，以浓度为300mg/L～400mg/L的赤霉素处理；将赤霉素处理后的种子进行高低温交替培养后于0℃～5℃培养；高低温交替培养过程中，低温培养的温度为14℃～16℃，时间为11h～13h；高温培养的温度为19℃～21℃，时间为11h～13h。本发明结合赤霉素及变温处理北乌头种子，能够快速打破北乌头种子休眠，将北乌头种子传统技术条件下至少90d的休眠期缩短至40d左右，发芽率提高到78.65％，本发明处理方法简便，高效，可在较短时间内解除北乌头种子休眠，使其萌发，为北乌头规模化生产播种前处理及室内种子质量检验提供快速、高效的技术措施，具有广阔的应用前景。

具体实施方式

本发明提供了一种打破北乌头种子休眠的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不 脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的原料皆为普通市售品，皆可由市场购得。

其中，1、北乌头种子：供试北乌头(Aconitum kusnezoffii Reichb.)种子于2014年10月采集吉林省磐石市取柴河镇，由中国农业科学院特产研究所王英平研究员鉴定。采集的种子自然风干后，除去果梗、果壳、霉变种子等杂质，储存阴凉干燥处备用。

2、化学试剂：赤霉素GA3购自上海源叶生物科技有限公司，次氯酸钠购自天津市福晨化学试剂厂。

3、仪器设备：游标卡尺(0～150mm)，数显控温冰箱(BCD-251WBSV)，可编程光照培养箱(MGC-250BP-2)

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1～2

取北乌头种子，除去杂质，用1％的次氯酸钠溶液消毒灭菌5～10min，再以蒸馏水冲洗3～5次，将消毒后的种子分别在不同质量浓度的赤霉素溶液中浸泡24h，然后挑选大小一致，颗粒饱满的种子置于垫有两层滤纸的培养皿中，每个培养皿中放100粒种子，每个处理重复3次，将各处理的种子进行不同温度处理，采用游标卡尺测定各处理种子的胚长及胚乳长，计算胚率、萌发率、烂种率。胚率测定为该条件下培养20天时测定值；萌发率是培养40天测定值，所有烂种率测定时间为培养40天。实施例设置如表1所示：

表1实施例设置

对比例1～19

取北乌头种子，除去杂质，用1％的次氯酸钠溶液消毒灭菌5～10min，再以蒸馏水冲洗3～5次，将消毒后的种子分别在不同质量浓度的赤霉素溶液中 浸泡24h，然后挑选大小一致，颗粒饱满的种子置于垫有两层滤纸的培养皿中，每个培养皿中放100粒种子，每个处理重复3次，将各处理的种子进行不同温度处理，采用游标卡尺测定各处理种子的胚长及胚乳长，计算胚率、萌发率、烂种率。对比例1～13：胚率测定为该条件下培养20天时测定值；萌发率是培养40天测定值，所有烂种率测定时间为培养40天。对比例设置如表2所示：

表2对比例设置

实施例3

利用SAS8.0软件对实施例1～2和对比例1～19的统计数据进行单因素方差分析，不同处理组间差异显著性采用Fisher's LSD法分析。计算公式为：

胚率(％)＝胚长/胚乳长×100％

烂种率(％)＝霉烂种子数/供试种子数×100％

萌发率(％)＝萌发种子数/供试种子数×100％

统计结果如表3所示：

表3结果统计

结果表明：北乌头种子存在深度休眠，常规条件下其休眠期长，发芽率低，而经质量浓度300mg·L^-1～400mg·L^-1赤霉素处理，胚生长速率显著高于对照，赤霉素最佳处理浓度为300mg·L^-1，结合15℃(12h)、20℃(12h)变温处理效果更佳，胚率可在培养20d达到80％以上，而后经3℃低温恒温培养，萌发率显著高于其它处理及对照组，可见，此方法可在短时间内打破北乌头种子休眠，促进其种子萌发。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。