用于自RNA模板开始的等温DNA扩增试剂盒

摘要

提供了扩增RNA模板的方法。所述方法包括使用第一反应混合物，将核糖核酸(RNA)模板逆转录以形成cDNA，所述第一反应混合物包含RNA模板、能够与RNA模板杂交的至少一种引物、逆转录酶和脱氧核苷三磷酸(dNTPs)；和使用第二反应混合物，扩增cDNA以形成扩增产物，所述第二反应混合物包含至少一种链置换DNA聚合酶、至少一种含肌苷的引物和能够在引物的肌苷残基的DNA？3ˊ产生缺口的核酸酶。所述方法在等温条件下完成，无需使cDNA模板变性。也提供了定量测定样品中的RNA模板的方法和检测样品中的RNA模板的方法。也提供了用于自核糖核酸(RNA)模板扩增脱氧核酸(DNA)的试剂盒。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求保护于2012年6月29日提交的美国专利申请号13/538,955和2012年6月29日提交的13/538,962的优先权，其公开内容通过引用全部结合到本文中。

发明领域

本发明总体涉及用于合成脱氧核糖核酸(DNA)的方法，所述方法通常在等温条件下，自核糖核酸(RNA)模板开始在单次反应中通过使用逆转录酶、内切核酸酶和DNA聚合酶以扩增所需DNA。

发明背景

核酸扩增技术经常用于基于核酸的测定，其用于分析物检测、传感、法医和诊断应用、基因组测序、全基因组扩增等。这些应用常常要求核酸扩增技术具有高特异性、灵敏度、准确性和稳健性。当起始核酸材料以少量存在时，核酸的扩增尤其重要。

目前许多技术用于扩增核酸，其中的一些仅从几个分子的核酸材料开始扩增。这些技术包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCP)、自动维持序列复制(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、多重置换扩增(MDA)和滚环扩增(RCA)。目前有若干方法可用于将RNA逆转录为DNA，然后进行DNA扩增。将RNA逆转录为DNA的现有方法和随后的DNA扩增包括两个步骤并且是在不同条件下。

在聚合酶链式反应(PCR)中，将模板DNA、一对引物和DNA聚合酶混合在一起并进行重复温度循环，其允许解链、退火和延伸步骤。解链或变性步骤典型地在高温时发生，将聚合酶的选择限制在嗜热聚合酶并且其步骤可能进一步增加对仪器的需求。替代的扩增方法在等温条件下使用链置换DNA聚合酶、含肌苷的引物和内切核酸酶V，从而消除了对实现核酸扩增的反应热循环的需要和对热稳定的聚合酶的需求；能够经得起在高温时重复加热。内切核酸酶V，也称为内切V或肌苷3′内切核酸酶，是一种DNA修复酶，该酶识别含有具有脱氨基的或经其它方式修饰的碱基例如肌苷的核苷酸的DNA。内切核酸酶V切割同一链中的肌苷3′的第二(或第三)磷酸二酯键，产生具有3′-羟基和5′-磷酸的缺口。在扩增反应中，DNA聚合酶以模板指导方式将核苷酸加到已有的DNA链的3'末端，导致5’→3’延伸，产生互补链。该延伸反应可包括已有链的置换，导致DNA链拷贝数的净增加。

RNA模板的扩增在例如RNA表达谱分析中是需要的。在该技术中，测定生物样品中的RNA分子的相对浓度。生物样品中的一些RNA分子可能以相对低的浓度存在，因此在分析之前需要扩增RNA，以允许稳健的检测和分析。经PCR的mRNA扩增导致以不同速率产生不同分子种类的RNA并可能提供模糊结果，使得难以进行RNA定量测定。另外，所述分析需要至少3个步骤和不同的条件。目前可用的RNA扩增技术具有高背景噪声的问题，这可能是因非特异性扩增反应所致。

需要自RNA模板扩增DNA的更好的方法和组合物。理想地，这样的方法和组合物应当更稳健、高度灵敏和可重复。

简述

方法的一个实施方案包括使用第一反应混合物，将核糖核酸(RNA)模板逆转录以形成cDNA，所述第一反应混合物包含RNA模板、能够与RNA模板杂交的至少一种引物、逆转录酶和脱氧核苷三磷酸(dNTPs)；和使用第二反应混合物，扩增cDNA以形成扩增产物，所述第二反应混合物包含至少一种链置换DNA聚合酶、至少一种含肌苷的引物和能够在引物的肌苷残基的DNA 3'产生缺口的核酸酶。所述方法在等温条件下完成，无需使cDNA模板变性。

定量测定来自样品的核糖核酸(RNA)模板的方法的另一实施方案包括使用第一反应混合物，将RNA逆转录以形成cDNA，所述第一反应混合物包含RNA模板、能够与RNA模板杂交的至少一种引物、逆转录酶和脱氧核苷三磷酸(dNTPs)；和使用第二反应混合物，扩增cDNA以形成扩增产物，所述第二反应混合物包含至少一种链置换DNA聚合酶、至少一种含肌苷的引物和能够在引物的肌苷残基的DNA 3'产生缺口的核酸酶；分析扩增产物的合成速率以定量测定样品中存在的RNA模板，其中逆转录和扩增在等温条件下完成，无需使cDNA模板变性。

在一个实施方案中，定量测定来自样品的核糖核酸(RNA)模板的方法包括使用第一反应混合物，将RNA逆转录以形成cDNA，所述第一反应混合物包含RNA模板、能够与RNA模板杂交的至少一种引物、逆转录酶和脱氧核苷三磷酸(dNTPs)；和使用第二反应混合物，扩增cDNA以形成扩增产物，所述第二反应混合物包含至少一种链置换DNA聚合酶、至少一种含肌苷的引物和能够在引物的肌苷残基的DNA 3'产生缺口的核酸酶；和使用核酸检测系统，检测扩增产物的存在。逆转录和扩增在等温条件下完成，无需使cDNA模板变性。

在再一个实施方案中，扩增核糖核酸(RNA)模板的方法包括将RNA模板逆转录为cDNA；和扩增cDNA以形成扩增产物，无需使cDNA变性，其中逆转录和扩增在等温条件下和在单一反应混合物中发生，所述反应混合物包含RNA模板、能够与RNA杂交的至少一种引物、逆转录酶、链置换DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、和至少一种含肌苷的引物和能够在引物的肌苷残基的DNA 3'产生缺口的核酸酶。

用于自核糖核酸(RNA)模板扩增脱氧核酸(DNA)的试剂盒的一个实施方案包含至少一种含肌苷的引物；和至少一种酶，其包括：逆转录酶活性、链置换DNA聚合酶活性、在引物的肌苷残基的DNA 3'产生缺口的核酸酶活性或其组合。

用于自RNA模板扩增脱氧核酸(DNA)的试剂盒的另一实施方案包含至少一种含肌苷的引物、包含逆转录酶活性和链置换DNA聚合酶活性的酶、和在引物的肌苷残基的DNA 3'产生缺口的核酸酶。

用于自RNA模板扩增脱氧核酸(DNA)的试剂盒的另一实施方案包含至少一种含肌苷的引物、逆转录酶、链置换DNA聚合酶、和在引物的肌苷残基的DNA 3'产生缺口的核酸酶。

定量测定来自样品的核糖核酸(RNA)模板的试剂盒的一个实施方案包含至少一种含肌苷的引物、逆转录酶、链置换DNA聚合酶；在引物的肌苷残基的DNA 3'产生缺口的核酸酶；和核酸检测系统。

附图

当参考附图阅读以下详述时，本发明的这些和其它特征、方面和优势将变得更好理解，附图中相似符号在全部附图中代表相似部分，其中：

图1是自RNA模板开始，经由cDNA: RNA异源双链体中间产物的DNA合成方案的实例的示意图。

图2是自RNA模板开始，经由双链DNA中间产物的DNA合成方案的示意图。

图3是使用具有经修饰的碱基的引物和链置换DNA聚合酶的DNA扩增机制的示意图。

图4提供凝胶电泳图像，显示在逆转录酶存在或不存在时，需要或无需模板变性，自RNA或cDNA模板开始的DNA扩增产物。

图5提供凝胶电泳图像，显示在2种不同逆转录酶的递增浓度存在时，自RNA模板开始的DNA扩增产物。

图6是凝胶电泳图像，显示在RNA酶A不存在时，自来自脾或肾的DNA或RNA模板开始的p53序列的DNA扩增产物。

图7提供了凝胶电泳图像，显示自来自脾或肾的DNA或RNA模板开始的p53序列的DNA扩增产物，所述模板已经用RNA酶A处理，作为阴性对照。

发明详述

本发明涉及用于自RNA模板的DNA扩增的方法和试剂盒。所述方法通常包括在单一反应混合物中将RNA模板逆转录，然后扩增所得DNA的步骤。本方法允许自少量细胞或痕量RNA样品开始，产生足够的DNA，用于分析RNA样品或基因表达。自少量RNA模板产生扩增的cDNA，其更容易被量化和检查(interrogate)。所述方法使用逆转录酶、DNA聚合酶、内切核酸酶V和至少一种含有肌苷核苷酸的引物(含肌苷的引物)，并且同时完成RNA逆转录和DNA扩增，而不使用热循环机器。

为了更清晰而简明地描述和指出所要求保护的发明的主题，为用于以下说明和所附权利要求书中的特定术语提供以下定义。在整个说明书中，特定术语的使用应该被视为非限制性实例。

除非上下文中另外明确指出，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数对象。如本文整个说明书和权利要求书中所用，近似措词可以用于修饰任何定量性表述，这些表述可容许改变，而不引起所涉及的基本功能的改变。因此，由术语例如“约”修饰的数值不限于所指定的精确值。在某些情况下，近似措词可相应于用于测定数值的仪器的精确度。在必要时提供了范围，那些范围包含了它们之间的所有子范围。

本文使用的“逆转录酶”通常是指能够将RNA复制为互补DNA或cDNA的酶。逆转录是将RNA模板拷贝为DNA的过程。在某些实施方案中，逆转录酶是能够使用RNA链作为合成模板而产生DNA链的酶。在一个实例中，所述酶最好具有从RNA模板产生DNA的逆转录酶活性，其中所述酶既无DNA聚合酶活性也无最低DNA聚合酶活性。在另一实例中，所述酶具有标称的DNA聚合酶活性和高的逆转录酶活性。逆转录酶或者具有逆转录酶活性的DNA聚合酶都可以从RNA模板产生cDNA链。逆转录酶可以是天然存在的逆转录酶、或保留上述所需酶活性的其变体或片段。通过分子生物学领域内常规方法产生的、具有逆转录酶活性的任何重组工程化的逆转录酶都可用于本发明的实践。

本文使用的术语“DNA聚合酶”指利用核酸链作为模板从头合成DNA链的酶。DNA聚合酶利用已有的DNA或RNA作为模板合成DNA，并且催化脱氧核糖核苷酸沿其读取的模板链聚合。新合成的DNA链与模板链互补。DNA聚合酶仅可向新形成链的3’-羟基末端添加游离核苷酸。它通过从脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)转移核苷单磷酸至生长的寡核苷酸链的3’-羟基来合成寡核苷酸。这导致新链以5’→3’方向延伸。因为DNA聚合酶仅可在已有的3’-OH基团上添加核苷酸以开始DNA合成反应，所以DNA聚合酶需要其可添加第一个核苷酸的引物。适合的引物包括RNA或DNA的寡核苷酸。DNA聚合酶可以是天然存在的DNA聚合酶或具有上述活性的天然酶的变体。例如，它可以包括具有链置换活性的DNA聚合酶、缺乏5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶、具有逆转录酶活性的DNA聚合酶或具有外切核酸酶活性的DNA聚合酶。

本文所用的“链置换核酸聚合酶”指除其核酸合成活性之外还有链置换活性的核酸聚合酶。就是说，链置换核酸聚合酶可在核酸模板链序列的基础上继续合成核酸(即读取模板链)，同时置换已与模板链退火的互补链。链置换是导致多拷贝靶序列合成所必需的。5'→3'外切核酸酶活性，如果存在的话，可导致合成链的降解，并且因此，在某些实例中，优选无5'→3'外切核酸酶活性的链置换DNA聚合酶。任何天然存在的DNA聚合酶、或保留DNA聚合酶活性的其变体或片段、或表现出所需酶活性(例如DNA聚合酶活性)的任何重组工程化的DNA聚合酶都可用于本文公开的方法和试剂盒。用于产生重组蛋白、尤其是酶、更尤其是DNA聚合酶的方法是众所周知的并且是分子生物学领域常规的。

本文使用的术语“内切核酸酶V”或“内切V”或“肌苷3′内切核酸酶”是指具有内切核酸酶活性的酶。典型地，内切核酸酶V是DNA修复酶，其识别含有肌苷的DNA并水解肌苷3′的第二或第三个磷酸二酯键，产生具有3′-羟基和5′-磷酸的缺口。内切核酸酶V在从大肠杆菌到人的生物体中存在，并且任何内切核酸酶V酶都可用于反应，以在相对于肌苷类似物的DNA3'提供缺口形成。内切核酸酶V也可识别含黄嘌呤或次黄嘌呤的DNA并水解黄嘌呤或次黄嘌呤残基的3′的第二或第三个磷酸二酯键，产生具有3′-羟基和5′-磷酸的缺口。所用的内切核酸酶可以是天然存在的内切核酸酶、或保留酶活性的其变体或其片段。通过分子生物学领域内的标准方法产生的、表现出所需酶活性(例如内切核酸酶活性)的任何工程化的重组内切核酸酶都可用于本发明的实践。本领域技术人员会具有产生重组蛋白(例如酶例如逆转录酶、DNA聚合酶或内切核酸酶)的技能并会认识到这样的重组蛋白可以通过多种分子生物学技术制得。

本文所用的“引物”或“引物序列”通常指与靶序列互补和退火的线性寡核苷酸。引物长度的下限按杂交能力而定，因为非常短的引物(例如小于5个核苷酸)在大多数杂交条件下不形成热力学稳定的双链体。引物长度通常在8-50个核苷酸内变化。在某些实施方案中，引物介于大约15-25个核苷酸之间。本文使用的引物包含位于引物的3’末端附近(例如在引物的3'末端的倒数第二个核苷酸)的至少一个肌苷。本文使用的术语“正向引物”是指在倒数第二个3’位置包含肌苷或肌苷类似物的引物，其与靶DNA的一条特定链退火。本文使用的术语“反向引物”是指在倒数第二个3’位置包含肌苷或肌苷类似物的引物，其与靶DNA的相反链退火。总之，正向引物和反向引物通常以类似于PCR引物的方式定向在靶DNA序列上，使得其3'末端比其5'末端更接近靶序列。天然存在的核苷酸(尤其是鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶，在下文称为“G”、“A”、“C”和“T”)以及核苷酸类似物，都可用于本发明方法和组合物的引物。

对于引物，本文使用的术语“解链温度”是指50%引物-DNA杂合体解离成为游离的引物和DNA的温度。引物的解链温度随引物长度而增加。引物的解链温度也可取决于其核苷酸组成。因此，具有多个G和C核苷酸的引物比仅具有A和T核苷酸的引物将在更高温度时解链。高解链温度(例如超过65°C)和非常高的解链温度(例如超过80°C)，在某些实施方案中可能并非有利，因为某些DNA聚合酶在这样高温时会变性和失活。因为离子强度也影响引物的解链温度，所以除非另有说明，否则本文提供的所有解链温度值都在pH 7.7和5 mM MgCl₂和50 mM NaCl中测定。

本文使用的“扩增产物”是指自核酸模板，通过核酸扩增而产生的扩增的核酸。

本文使用的“模板DNA”或“模板RNA”是指作为用于扩增的所需靶标的核酸。例如，模板RNA被逆转录为cDNA，并且该模板cDNA用于产生扩增产物。

本文使用的术语“核苷酸类似物”指与天然存在的核苷酸在结构上相似的化合物。核苷酸类似物可以具有改变的磷酸骨架、糖部分、核碱基或其组合。通常具有改变的核碱基的核苷酸类似物尤其赋予不同的碱基配对和碱基堆积特性。具有改变的磷酸-糖骨架的核苷酸类似物(例如肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA))通常尤其改变链特性，例如二级结构形成。

术语“扩增子”或“扩增产物”通常是指含有由靶DNA扩增引起的一个或多个靶DNA或RNA序列的DNA或RNA扩增产物，所述扩增通过内切核酸酶使含肌苷的引物产生缺口联合聚合酶延伸而驱动。可使用例如单个的含肌苷的引物、成对的含肌苷的引物、或巢式成对的含肌苷的引物，产生扩增子。扩增子可包含单链或双链DNA、DNA:RNA杂合体、或RNA。扩增子可包含扩增产物混合物(即混合的扩增子群体)、若干优势种类的扩增产物(即多个离散的扩增子)、或单个优势种类的扩增产物(即DNA或RNA)。在某些实施方案中，可使用本领域已知技术，例如亲和纯化或电泳，自混合群体分离单一种类的扩增子。扩增子可以大部分为单链或者部分或完全为双链DNA、DNA:RNA杂合体、或RNA，取决于所用的反应方案。

本文使用的术语“保守变体”同时适用于氨基酸序列和核酸序列。对于具体的核酸序列，术语“保守变体”是指编码相同或类似氨基酸序列的那些核酸并包括简并序列。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在指定丙氨酸的每个氨基酸位置上，这些密码子的任一个在构建相应核苷酸序列时都可互换使用。这样的核酸变体是保守变体，因为它们编码相同蛋白，假定序列中仅有这一个改变。本领域技术人员将会知道核酸中的每个密码子，除了AUG (即氨基酸甲硫氨酸的唯一密码子)和UGG(即氨基酸色氨酸的唯一密码子)之外，都可以被保守修饰，以得到功能相同的肽或蛋白。对于氨基酸序列，本领域技术人员将会知道，改变、添加或缺失一个氨基酸或少量氨基酸(例如典型地小于大约10个氨基酸)的多肽或蛋白序列的取代、缺失或添加是“保守变体”，其中改变导致一个氨基酸被化学上类似的氨基酸取代。

本文使用的术语“互补的”是指在寡核苷酸或多核苷酸内的核苷酸之间精确配对的能力。例如，具有T和G的一对通过氢键与C配对。如果寡核苷酸某位置上的核苷酸与DNA分子相应位置上的核苷酸能够形成氢键的话，则认为该寡核苷酸和该DNA在这一位置上彼此互补。当各自有足够数量的相应位置具有彼此形成氢键的核苷酸时，则认为整个寡核苷酸和该DNA互补。

本文使用的术语“dNTP混合物”通常是指含有以三磷酸形式的磷酸、糖和有机碱的脱氧核苷酸的组合，其为DNA聚合酶提供了DNA合成所需的前体。dNTP混合物可包括每种天然存在的脱氧核苷酸(即腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)和胸腺嘧啶(T))。在某些实施方案中，每种天然存在的脱氧核苷酸可被合成的类似物置换或补充；但是只要肌苷不置换或补充dNTP混合物中的G。

本文使用的术语“肌苷”是指2'-脱氧核糖核苷或核糖核苷，其具有正常碱基、尤其是脱氨基的或类似的碱基的类似物，当在DNA中遇到时其被内切核酸酶V识别和切割。本文使用的术语“肌苷类似物”是指2'-脱氧核糖核苷或核糖核苷，其中所述碱基包括例如，次黄嘌呤(即肌苷本身)、黄嘌呤、尿苷、oxanine (即oxanosine)、其它O-1嘌呤类似物、N-6-羟基氨基嘌呤、水粉荤素(nebularine)、7-脱氮次黄嘌呤、其它7-脱氮嘌呤和2-甲基嘌呤。

本文使用的术语“含肌苷的引物”是指包含至少一个肌苷或肌苷类似物的引物。

本文使用的术语“还原剂”是指将二硫化物还原为硫醇的试剂。合适的还原剂可含有硫醇基例如二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇(βME)和2-巯基乙胺(MEA)。或者，还原剂可含有膦和它们的衍生物，例如，三(羧基乙基)膦(TCEP)。

本文使用的术语“单链DNA结合蛋白”，缩写为“SSB”，是指与单链DNA非共价结合的蛋白，其亲和力高于与双链DNA的结合。单链结合蛋白的合适实例包括但不限于大肠杆菌SSB、T4基因32蛋白、T7基因2.5蛋白、Ncp7、recA、或其组合。

本文使用的术语“靶DNA”是指天然或合成来源的DNA序列区，可使用本发明的一种或多种方法或组合物合成或扩增所述DNA序列区。

本文使用的术语“模板”是指靶RNA或DNA的部分，其经DNA聚合酶扩增而产生一种或多种扩增产物或扩增子。

除非另有说明，否则本说明书和权利要求书中使用的表示成分的量、性质例如分子量、反应条件等的所有数值都被理解为在所有情况下被术语“约”修饰。因此，除非有相反说明，否则以下说明书和所附权利要求书中给出的数值参数是近似值，其可取决于本发明试图获取的所需性质而变化。至少，和并非试图将等同原则的应用限制在权利要求书的范围内，每个数值参数应当至少按照报告的有效数字的数值和通过应用常规舍入技术而解释。

在一个实例中，所述方法包括将RNA模板逆转录以形成cDNA，和然后扩增cDNA以形成扩增产物。使用第一反应混合物进行逆转录，产生cDNA，所述第一反应混合物包含RNA模板、能够与RNA杂交的至少一种引物、逆转录酶和脱氧核苷三磷酸(例如dNTPs)。注意，所述方法进一步包括使用第二反应混合物，扩增cDNA以形成扩增产物，所述第二反应混合物包含至少一种链置换DNA聚合酶、至少一种含肌苷的引物和能够在引物的肌苷残基的DNA 3'产生缺口的核酸酶(例如内切V)。整个方法开始于RNA模板并导致cDNA扩增产物的产生，其是在等温条件下完成，无需使cDNA变性。

在一个实施方案中，逆转录和扩增步骤在单一反应混合物中进行。用于扩增RNA模板的方法包含将RNA模板逆转录为cDNA，然后扩增cDNA以产生DNA扩增产物，其中进行扩增，无需使cDNA变性。在某些实施方案中，逆转录和扩增过程在等温条件下在单一反应混合物中发生。在所述方法的一个或多个方面，所述单一反应混合物是指包含逆转录步骤(即步骤一)和DNA扩增(即步骤二)所需的所有试剂的组合物。上述单一反应混合物可包含RNA模板、逆转录酶、能够与RNA模板杂交的一种或多种引物、DNA聚合酶、含有能够与cDNA杂交的修饰碱基的一种或多种引物(例如含肌苷的引物)、dNTP和能够在引物的肌苷残基的DNA3'产生缺口的内切核酸酶。

在所述方法的某些实施方案中，逆转录和扩增反应可以在两个单独步骤中连续发生或者同时发生。一方面，将RNA模板逆转录为cDNA，并且随后用该cDNA作为模板进行扩增步骤。在一个实施方案中，扩增步骤在逆转录步骤之后发生。在某些其它实施方案中，当同时进行所述方法时，RNA模板的逆转录和cDNA的扩增同时进行。在一个或多个实施方案中，当扩增开始于RNA模板并在等温条件下在单一反应混合物中发生时，所述单一反应混合物包含逆转录和DNA扩增所需的所有试剂。

在某些方面，逆转录步骤产生单链cDNA、双链cDNA、RNA:cDNA异源双链体或其组合。含肌苷的引物在扩增反应中的使用是有利的，因为含肌苷的引物可以与模板cDNA的任何形式(例如单链、双链或异源双链体cDNA)结合，并且可以起始模板cDNA的扩增。含肌苷的引物形成引物:模板杂合体，其中核酸酶在引物的3’ DNA邻近肌苷残基处形成缺口。链置换DNA聚合酶与带缺口的链结合并开始合成互补DNA链。一个或多个示例性的实施方案见图3，其进一步详述如下。

如上所述，所述方法包括将RNA模板逆转录为cDNA模板，其中逆转录需要逆转录酶。逆转录酶的示例性实施方案包括但不限于来自1型人免疫缺陷病毒(HIV)的逆转录酶、来自莫洛尼鼠白血病病毒的逆转录酶(MMLV RT)和来自禽成髓性白血病病毒的逆转录酶(AMV RT)。某些逆转录酶具有增加的热稳定性，例如，SuperScript^TM II或SSII^TM 逆转录酶，其在约42°C合成cDNA。在某些实施方案中，逆转录酶(例如SS II^TM)与单链RNA、单链DNA或DNA-RNA杂合体结合。逆转录酶提供全长产物的特异性和较高收率。

在一个或多个实施方案中，某些逆转录酶可具有核糖核酸酶H (RNA酶H)活性(例如MMLV RT)。具有RNA酶H活性的酶倾向于降解RNA模板，尤其是水解RNA:DNA杂合体中的RNA的磷酸二酯键并产生3′-OH和5′-P-末端产物。单链核酸、双链DNA、或双链RNA耐受RNA酶H活性。在某些方面，将逆转录酶突变以降低RNA酶H活性，例如SSII^TM逆转录酶(Invitrogen^TM)。SSII^TM逆转录酶是MMLV逆转录酶的突变形式，其中将MMLV逆转录酶突变以降低RNA酶H活性。具有降低的RNA酶H活性的逆转录酶的优势是，它提供了模板RNA的更好的稳定性。在逆转录酶具有更高RNA酶H活性的某些实施方案中，该酶降解模板RNA。

在某些实施方案中，在反应混合物中的一种或多种DNA聚合酶具有相同程度的逆转录酶活性。在这些实施方案中，当DNA聚合酶具有显著的逆转录活性时，该聚合酶起到逆转录酶的作用。具有逆转录酶活性的DNA聚合酶的实例是Bst DNA聚合酶。然而，BstDNA聚合酶不是有效的逆转录酶。例如，图4，泳道5，在65°C和95°C，其显示出没有来自包含RNA和Bst DNA聚合酶的反应混合物的扩增产物，从而明确地支持了Bst DNA聚合酶不是有效的逆转录酶的这一观察结果。图4显示凝胶图像，其中标记“失活”或“变性”是指在加入包含逆转录酶、DNA聚合酶和内切核酸酶V的酶混合物之前，模板RNA或模板cDNA和引物的混合物在大约65°C或95°C的温度的加热步骤。

与RNA模板杂交的引物在本文中可交换地用作“RNA引物”。同样，与DNA模板杂交的引物在本文中可交换地用作“DNA引物”。在某些实施方案中，使用DNA引物或者RNA引物可以起始RNA模板的逆转录或cDNA模板的扩增。在某些实施方案中，RNA引物包含含肌苷的引物、寡核苷酸dT引物、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)或其组合。在所述方法的一些方面，用于逆转录的引物可包含大约8至大约25个核苷酸。在一个实施方案中，RNA引物包含20个核苷酸。在某些其它实施方案中，RNA引物可以与RNA的聚A尾互补，其中该引物可以与聚A尾退火。注意，RNA的聚A尾，其在本文中是指包含多个腺苷一磷酸并且位于RNA尾部(或末端)的RNA。在某些其它实施方案中，引物可经设计与RNA模板的特定序列互补。在备选实施方案中，RNA引物是随机引物，其经设计与RNA模板的随机序列结合。选择引物与模板RNA的退火温度范围，其中逆转录反应导致产生cDNA。在一个或多个方面，包含肌苷的寡核苷酸引物用于逆转录。在备选实施方案中，RNA引物也可以包含黄嘌呤，代替肌苷。

逆转录通常在等温条件下在20°C至70°C的温度范围内进行。在某些实施方案中，逆转录在室温(例如大约30°C)下发生。在一个实施方案中，逆转录在例如大约45°C的温度下发生。对逆转录温度的选择可取决于不同酶的功能，所述酶例如逆转录酶。在一个实施方案中，逆转录使用SSII^TM逆转录酶，其在大约42°C自RNA模板合成cDNA。在另外的实施方案中，因为RNA模板的逆转录和cDNA扩增在单一反应混合物中发生，所以选择最佳反应温度，使DNA聚合酶或内切核酸酶的效率可认为是相当高。因为某些DNA聚合酶和内切核酸酶在大约35-50°C具有显著更高的效率，所以可以选择进行逆转录和DNA聚合反应两者的最佳温度为大约45°C。

用模板cDNA和用于DNA扩增反应的试剂起始DNA聚合反应。在某些实施方案中，反应混合物包含DNA聚合酶、dNTP’s、含肌苷的引物和内切核酸酶，并且反应通常在相同温度(例如等温条件)进行。

在某些实施方案中，逆转录反应步骤与DNA扩增反应在单一反应混合物中同时发生。在备选实施方案中，进行逆转录反应步骤以产生cDNA，并在相同温度条件下将扩增反应混合物单独加入到cDNA以产生扩增产物。在均质样品中研究多个RNA种类的某些实例中，在等温条件下自RNA模板扩增DNA的方法可以是合适的，因为可使用一种或多种不同的检测方法来鉴定多个RNA种类。在某些实施方案中，进行逆转录反应步骤以产生cDNA，并将扩增反应混合物单独加入到cDNA中，用于扩增，其中逆转录和扩增在2种不同温度条件下发生。在样品中研究多个RNA种类的某些实例中，所述方法可以是合适的，因为在组合反应中将多个RNA种类转化为cDNA，然后将cDNA产物分到单独的扩增反应中以形成DNA扩增产物，其中逆转录和扩增在2种不同温度条件下发生。该实例测定起始样品中不同RNA种类的存在。

DNA扩增的示例性方法包括将含肌苷的引物与模板DNA退火以形成引物:模板DNA杂合体。扩增反应进一步包括使用在引物的肌苷残基的DNA 3'使引物:模板DNA杂合体产生缺口的核酸酶。核酸酶在DNA聚合酶和dNTPs存在时起作用，其中DNA聚合酶与带缺口的DNA模板结合，置换DNA链并用反应混合物中的dNTPs合成另一DNA链，产生与模板DNA (或cDNA)的部分互补的至少一种扩增产物。

用于自RNA模板的DNA扩增的方法可以包括使用例如包含肌苷的寡核苷酸引物，将肌苷引入模板DNA的特定位置。DNA聚合酶自引物:DNA模板杂合体合成DNA，从肌苷残基的DNA 3'开始。然后内切核酸酶V在肌苷残基的DNA 3'形成缺口，允许DNA聚合酶与带缺口的DNA模板结合。然后DNA聚合酶合成与模板DNA互补的DNA链，同时进行链置换。内切核酸酶V在肌苷残基的3' DNA的重复缺口形成，允许DNA聚合酶以重复方式反复与带缺口的模板结合，产生靶DNA的互补链。在某些其它实施方案中，寡核苷酸引物包含黄嘌呤，而非肌苷。在这些实施方案中，内切核酸酶V在黄嘌呤或次黄嘌呤残基的DNA 3'形成缺口，从而允许DNA聚合酶与带缺口的DNA模板结合。

在一个或多个实施方案中，用于扩增反应的引物选自含有修饰核苷酸(例如，核苷酸类似物)的引物。在某些实施方案中，在不同位置包含肌苷或黄嘌呤残基的引物用于DNA扩增。在一个实施方案中，肌苷或黄嘌呤残基可以位于距离引物5’末端至少4个核苷酸、至少5个核苷酸或至少10个核苷酸。在这些实施方案中，肌苷替代鸟苷并与胞嘧啶碱基或胸腺嘧啶碱基相对，但因为认为肌苷是“通用碱基”，所以它可相对任何碱基放置。在某些实施方案中，肌苷核苷酸可以是引物的倒数第二个3’核苷酸。在其它实施方案中，肌苷可以是引物的最后一个3’核苷酸。在备选实施方案中，肌苷可存在于引物的倒数第二个3’和最后一个3’位置，并且因为核酸酶使来自肌苷的2个核苷酸产生缺口，在扩增反应期间这两个肌苷可以保留在引物序列中。

在一个或多个实施方案中，第一、第二或这两种反应混合物包含多种正向和反向的含肌苷的引物，用于与cDNA退火。在某些实施方案中，可以使用本领域公认的合成技术来合成含肌苷的引物。可使用引物设计软件来设计能够与核酸退火的单个引物或多个引物，从而促使聚合酶-介导的延伸。在其中反应在10°C-50°C的温度范围内进行的实施方案中，引物的解链温度在大约 50 mM盐中通常为大约45oC。在本申请的其它方面，可以使用相对短的引物(例如10聚体至20聚体；更具体的是14聚体至18聚体、或16聚体)。在其它实施方案中，含肌苷的引物的长度为大约5-100、5-30、或5-20个核苷酸。

在某些实施方案中，设计含肌苷的引物，使肌苷残基位于引物中，其位置与靶DNA中的C或T互补。在某些实施方案中，肌苷位于引物的倒数第二个3’碱基。因为反应条件例如温度和离子强度影响引物与靶DNA的退火效率，所以引物中的肌苷位置可按特定反应条件而调整。一般而言，肌苷残基的位置远离引物的5’末端，使得在经内切核酸酶切出缺口后，引物仍然与靶DNA退火。因此，肌苷的引物5’区段的解链温度通常大致等于所选的反应条件的温度。如果连续有2个模板G，则2个肌苷可在引物中出现，作为倒数第二个3’和最后一个3’残基。GG、AA、GA、AG及其两个或更多个的组合也以类似方式很好地起作用。

在某些反应混合物中可包含多个引物。在其中同时产生正和负DNA链的实施方案中，反应混合物中可包括含有正向引物和反向引物的成对引物。包含多个成对引物可以提高反应混合物中离散核酸产物的相对百分率。可设计巢式引物，以在先前扩增子的3'末端上或附近结合，使得其以系列形式，该系列中的每个引物在原来的靶核酸上紧跟彼此或在彼此附近杂交。在其中使用多个巢式引物的实施方案中，反应混合物中可包含浓度通常为在10 μL体积内大约1 ng至1 μg的单链结合蛋白(SSB)，以增加保真度并减少背景。SSB可选自本领域已知的任何不同的SSB，并且最好根据与试剂条件的相容性和与反应混合物中使用的其它酶的协同相互作用而选择。

所述方法的一个或多个实施方案使用DNA聚合酶，其可显示一个或多个以下特征：链置换活性；从缺口起始链置换的能力；和对单链DNA的低降解活性。注意，DNA聚合包括使用DNA聚合酶和核苷酸三磷酸来合成DNA。DNA聚合酶使用核苷酸三磷酸，按照DNA模板链，以互补方式在引物的3’末端添加核苷酸，产生新的DNA链，其与原来的模板DNA互补。在一个或多个实施方案中，扩增产物可以是单链或双链DNA，通常延伸到模板链末端。

典型地，具有3’→5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶允许该酶通过以3’→5’方向切除修复错配的核苷酸来校正所合成的DNA。在某些实施方案中，不同于具有3’→5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶，扩增使用外切核酸酶缺乏的DNA聚合酶。外切核酸酶缺乏的DNA聚合酶用于在校正不存在时在肌苷3’ DNA上维持反复产生缺口并且它阻止肌苷的切除，允许使用修饰碱基。在某些实施方案中，可用硫代碱基(thioated bases)修饰引物以阻止被外切核酸酶活性的降解。在一个或多个实施方案中，含肌苷的引物包含硫代磷酸键(phosphorothioate linkage)。硫代磷酸键可用于在扩增期间阻止3'→5'外切核酸酶或内切核酸酶从引物上除去肌苷。硫代磷酸键的存在是需要的，如果用于本发明方法和试剂盒的DNA聚合酶具有校正的3'→5'外切核酸酶活性的话。如果所述方法中使用的任何酶具有核酸酶活性，或如果所用的模板被核酸酶污染的话，这也将是有利的。耐受核酸酶的键可以位于引物内的任何位置上，然而在某些实施方案中，硫代磷酸键直接连接到肌苷的5'或3'。

在某些实施方案中，外切核酸酶缺乏的DNA聚合酶具有链置换活性。因为DNA聚合酶与内切核酸酶所形成的缺口结合并自3’→5’方向合成DNA，所以需要链置换活性以将DNA聚合酶向前移动并合成互补链。在一个或多个实施方案中，用于所述方法的示例性的DNA聚合酶包括但不限于BstDNA聚合酶、外切核酸酶-缺乏的T7 DNA聚合酶、外切(-) Klenow、delta TtsDNA聚合酶、BCADNA聚合酶、Phi 29 DNA聚合酶、测序酶2、T4 DNA聚合酶、T5 DNA聚合酶及其任何组合。

注意，在某些实施方案中，所述方法包括内切核酸酶，其在引物中存在的肌苷或黄嘌呤残基的3’末端形成缺口。在一个或多个实施方案中，所述内切核酸酶是内切核酸酶V。在一个实施方案中，所述内切核酸酶V是专门在肌苷核苷酸的核苷酸3’的DNA上形成缺口的核酸酶。当靶DNA为双链时，缺口发生在同一链的肌苷上。所述内切核酸酶，连同链置换DNA聚合酶和引物产生靶向DNA扩增。首先，DNA聚合酶延伸引物，为核酸酶产生缺口位点。缺口为DNA聚合酶产生起始位点，置换单链DNA产物，同时它再次产生双链引物延伸产物。该循环重复，合成与模板下游部分互补的多个单链DNA。

本文使用的内切核酸酶V识别含有肌苷的DNA并水解肌苷3′的第二或第三个磷酸二酯键，产生具有3′-羟基和5′-磷酸的缺口。任何内切核酸酶V酶都相对于肌苷类似物的3'在DNA上产生缺口。在某些实施方案中，野生型内切核酸酶V (例如SEQ ID NO:1)可以用于本发明的方法。在备选实施方案中，本文提供的作为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的变体可用于使含肌苷的靶DNA产生缺口。在一个或多个实施方案中，内切核酸酶V也识别含有黄嘌呤或次黄嘌呤的DNA并水解黄嘌呤或次黄嘌呤残基3′的第二或第三个磷酸二酯键，产生具有3′-羟基和5′磷酸的缺口。在靶核酸未经加热变性的实施方案中，用于本文的内切核酸酶V变体在相对低温度例如低于85°C、或介于20°C和80°C之间时具有最大活性。

使用单一的正向引物，各分子的互补拷贝的合成速率是相对恒定的，导致拷贝数随时间稳步线性增加。当加入反向的第二引物时，在与正向引物确定的距离上与模板DNA退火，加速了扩增过程。正向和反向引物可以是彼此相对接近(即距离小于约1 kb)，使拷贝正向扩增子到由内切核酸酶V切割位点限定的其5’末端所需的时间最少，从而增加了动力学并减少了自模板DNA产生扩增子的总时间。当限制其它成分的核酸酶或聚合酶的量时，反应速率达到最大值。额外的巢式引物也可用于进一步增加扩增速率。在某些实施方案中，因为产生缺口的反应消除了将引物序列复制为扩增产物，所以需要一种或多种巢式引物，以便进一步扩增所述扩增产物。

扩增的反应温度可在扩增子产生过程期间变化，范围在20°C至70°C。在某些实施方案中，反应温度可以保持在40-50oC。在一个实施方案中，反应温度可以保持在45°C。

在备选实施方案中，所述方法使用至少一种延伸模板(extender template)，用于扩增。所述延伸模板是特定序列，例如启动子序列或限制性内切核酸酶位点特异性序列。可以设计延伸模板，使得扩增子的3'末端与其退火。如果所述延伸模板含有两段序列，一个与扩增子互补，另一个不互补，并且杂交产生非互补引物序列的5'突出端，扩增子的3'凹缺末端将由DNA聚合酶进一步延伸。该延伸反应可以用于将特定DNA序列掺入最里面的扩增子的3’末端。该延伸反应也可用于自5'突出端置换序列。

在一个或多个实施方案中，所述延伸模板的5'末端可含有发夹环，其中荧光染料和猝灭剂位于茎的任一臂上，然后染料荧光可通过能量转移而被大量淬灭。当由链置换DNA聚合酶自扩增子的凹缺3'末端进行延伸后，茎环结构变为双链并且染料和猝灭剂被进一步分开，消除了某些或所有猝灭，并产生可检测信号。该信号可因延伸模板的序列和猝灭染料的颜色而为多重的，使得可以同时监测两个或更多个独立扩增过程。

在某些实施方案中，所述延伸模板的5'末端可包括RNA聚合酶启动子序列的互补序列。因此，可以产生双链RNA聚合酶启动子，即通过将延伸模板与扩增子杂交，接着扩增子3'末端经DNA聚合酶延伸到启动子区。在反应物中包含RNA聚合酶的实施方案中，扩增子可以被转录为单链RNA聚合酶模板。在所有实施方案中，本发明方法产生的核酸可被定性或定量测定。

在某些实施方案中，自RNA模板扩增DNA的方法进一步包括分析扩增产物的合成速率以定量测定样品中存在的RNA模板。在某些备选实施方案中，所述方法进一步包括使用核酸检测系统检测扩增产物。在某些实施方案中，所述核酸检测系统包括凝胶电泳、嵌入染料、荧光标记、酶联标记、抗体-介导的标记和放射性标记或焦磷酸定量测定。

可使用任何常规的核酸检测系统来检测DNA扩增产物(扩增的序列)，所述检测系统例如荧光标记的检测、酶联检测系统、抗体-介导的标记检测和放射性标记的检测。所公开的方法的关键特征是扩增并非在循环中发生，而是以连续、等温复制方式发生。这使得扩增并不太复杂并且输出更稳定得多。链置换在单个连续的等温反应中允许多拷贝核酸序列或样品的快速产生。然后，使用所公开的方法而产生的DNA可用于任何目的或用于任何其他所需方法。

为了有助于扩增核酸的检测和定量测定，检测标记可以直接掺入到扩增的核酸中或可以与检测分子偶联。本文使用的检测标记是可与扩增的核酸直接或间接缔合并直接或间接产生可检测、可测定信号的任何分子。掺入到核酸中或与核酸探针偶联的许多这类标记是本领域技术人员已知的。适合使用的检测标记的实例是放射性同位素、荧光分子、磷光分子、酶、抗体和配体。

合适的荧光标记的实例包括荧光素(5-羧基荧光素-N-羟基琥珀酰亚胺酯)、罗丹明(5,6-四甲基罗丹明)、异硫氰酸荧光素(FITC)、5,6-羧基甲基荧光素、德克萨斯红、硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑-4-基(NBD)、香豆素、丹磺酰氯、4'-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和花菁染料Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7。

标记的核苷酸是检测标记的另一形式，因为在合成期间可将它们直接掺入到扩增产物中。可掺入到扩增的DNA或RNA中的检测标记的实例包括核苷酸类似物例如BrdUrd (BUDR三磷酸、Sigma)、BrUTP以及用生物素或用合适的半抗原例如异羟基洋地黄毒苷(digoxygenin)修饰的核苷酸。合适的荧光-标记的核苷酸是异硫氰酸荧光素-dUTP、花菁-3-dUTP和花菁-5-dUTP。BrdUrd常用于DNA的核苷酸类似物检测标记，生物素-16-尿苷-5'-三磷酸(生物素-16-dUTP, Boehringher Mannheim)常用于RNA的核苷酸类似物检测。可将荧光素、Cy3和Cy5与dUTP连接，用于直接标记。Cy3.5和Cy7可作为抗生物素蛋白或抗异羟基洋地黄毒苷缀合物得到，用于生物素或异羟基洋地黄毒苷-标记的探针的第二检测。

掺入扩增的核酸的检测标记，例如生物素，可随后使用本领域众所周知的灵敏方法来检测。例如，生物素可以使用链霉抗生物素-碱性磷酸酶缀合物(Tropix, Inc.)来检测，所述缀合物与生物素结合并随后通过合适底物(例如，化学发光底物CSPD: 3-(4-甲氧基螺-[1,2-二氧杂环丁烷-3-2'-(5'-氯)三环[3.3.1.1.sup.3,7 ]癸烷]-4-基)苯基磷酸二钠；Tropix, Inc.)的化学发光来检测。用于检测扩增的RNA的检测标记是吖啶酯-标记的DNA探针。吖啶酯-标记的检测探针允许检测扩增的RNA，无需洗涤，因为未杂交的探针可用碱来破坏。

检测探针是标记的寡核苷酸，其序列与扩增的核酸上的检测标签互补。检测探针的互补部分可以是支持检测探针和检测标签之间特异性和稳定杂交的任何长度。为了该目的，优选10-35个核苷酸的长度，其中最优选检测探针的互补部分为16-20个核苷酸的长度。检测探针可含有上述任何检测标记。生物素和荧光分子可以用于分析或定量测定扩增产物。分子信标是用荧光部分标记的检测探针，其中荧光部分仅当检测探针被杂交时才发荧光。这类探针的使用消除了在标记检测前去除未杂交探针的需要，因为未杂交的检测探针将不会产生信号，这在多重测定法中尤其有用。

地址探针(address probe)也可用于定量测定扩增产物。地址探针是具有与引物上的地址标签互补的序列的寡核苷酸。地址探针的互补部分可以是支持地址探针和地址标签之间特异性和稳定杂交的任何长度。为了该目的，优选10-35个核苷酸的长度，其中最优选地址探针的互补部分为12-18个核苷酸的长度。地址探针可含有单个互补部分或多个互补部分。优选地，地址探针直接或经由间隔分子与固态支持物偶联。地址探针和固态支持物的这类组合是固态检测器的优选形式。

组合两个或更多个这些检测标记的分子也被认为是检测标记。任何已知的检测标记可与所公开的探针或标签一起使用，并使用所公开的方法来检测扩增的核酸。检测和测定由检测标记产生的信号的方法也是本领域技术人员已知的。例如，放射性同位素可以通过闪烁计数或直接显现而检测；荧光分子可以用荧光分光光度计检测；磷光分子可以用分光光度计检测或直接用相机可视化；酶可以通过检测来检测或由该酶催化的反应的产物显现来测定；抗体可以通过检测与抗体偶联的第二检测标记来检测。本文使用的检测分子是这样的分子：其与扩增的核酸相互作用并且其上偶联了一种或多种检测标记。

在使用末端-磷酸-标记的核糖核苷酸的实施方案中，磷酸酶可用于在定性或定量测定法中生色。在这样的实施方案中，可通过使用dNTP或脱氧核苷四磷酸的末端-磷酸甲基酯将末端磷酸保护以免脱磷酸化。

在一个或多个实施方案中，RNA模板分离自真核来源、原核来源、病毒来源、噬菌体来源或合成来源。在一个或多个实施方案中，疑似或已知含有特定核酸序列例如RNA的样品，可得自多种来源。所述样品可以是例如生物样品、食物、农业样品或环境样品。在某些实施方案中，所述样品源自多种生物受试者。所述生物受试者可包括原核或真核来源。在某些实施方案中，生物受试者包括病毒。在一个或多个实施方案中，源自生物受试者的核酸样品可源自生物组织、完整细胞、细胞部分、细胞培养物或体液或渗出物(例如血液、血浆、血清或尿、乳、脑脊液、胸水、淋巴、泪液、痰、唾液、粪便、肺抽吸物、咽喉或生殖道拭子等)。

在一个或多个实施方案中，待扩增的核酸(或靶核酸)存在于样品中，其中所述样品可分散在溶液中或者可固定在固体支持物(例如印迹、阵列、微量滴定板或孔板)上。在某些实施方案中，样品可以经预处理以使靶核酸可用于杂交。在某些实施方案中，当靶核酸以双链形式存在时，无需使核酸变性就可扩增该双链核酸。在这些实施方案中，引物具有与任何形式的核酸结合的能力，所述核酸例如单链、双链或异源双链体形式，用于杂交，随后进行核酸合成。

可用于本发明方法的核苷酸包括脱氧核糖核苷酸(“dNTPs”)和核糖核苷酸(“rNTPs”)两者。dNTP混合物提供了DNA聚合酶进行DNA合成所需的脱氧核苷酸组合。dNTP混合物可包括每种天然存在的脱氧核苷酸碱基(即腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T))。在某些实施方案中，每种天然存在的脱氧核苷酸可以被合成的类似物置换或补充；但条件是在dNTP混合物中脱氧肌苷三磷酸可不置换或补充dGTP。

在某些实施方案中，合成反应发生在导致反应pH介于6-9之间的缓冲液中。在某些实施方案中，pH为7.7。可使用大部分本领域公认的用于核酸合成反应的缓冲液(例如Tris缓冲液或HEPES缓冲液)。

一般而言，提高DNA稳定性的缓冲液(例如HEPES)可以用于某些扩增子产生方法。然而，Tris:硼酸盐、HEPES和MOPS缓冲液对于使用靶DNA热变性的某些特定的扩增子产生方法而言可能是不利的。

聚合酶通常需要二价阳离子(例如Mg+2、Mn+2、或其组合)。因此，在某些实施方案中，可将一种或多种二价阳离子加入到反应混合物中。可将MgCl₂以2 mM至6 mM的浓度范围加入到反应混合物中。当将高浓度(例如大于10 pmoles、大于20 pmoles、或大于30 pmoles)的含肌苷的引物加入到反应混合物中时，期需更高浓度的MgCl₂。

在某些实施方案中，可将表面活性剂(例如去垢剂)加入到反应混合物中。在某些实施方案中，表面活性剂是选自以下的去垢剂：吐温20、NP-40、Triton-X-100、或其组合。在某些实施方案中，将0.05% NP-40和0.005% Triton X-100加入到反应混合物中。可将表面活性剂加到反应管中，然后引入反应混合物的第一组分。或者，可将表面活性剂连同反应组分一起加入反应混合物。在某些具体的实施方案中，反应缓冲液可包含25 mM Tris:硼酸盐；5 mM MgCl2；0.01%吐温；和20%乙二醇。

在某些实施方案中，可将一种或多种封闭剂例如白蛋白(例如BSA)加入到反应混合物中，以与反应容器(例如塑料微量离心管或微量滴定板)表面结合，增加可用于与逆转录酶、核酸酶或聚合酶反应的靶核酸的相对量。

在某些实施方案中，可将一种或多种还原剂(例如DTT、βME、TCEP或MEA)加入到反应混合物中以减少反应混合物中酶的氧化并提高所产生扩增子的品质和得率。

在一个或多个实施方案中，用于扩增RNA模板的试剂盒，包含至少一种含肌苷的引物和至少一种酶，其中所述酶包含逆转录酶活性、链置换DNA聚合酶活性、在引物的肌苷残基的DNA 3'产生缺口的核酸酶活性及其组合。

在一个或多个实施方案中，RNA模板分离自真核来源、原核来源、病毒来源、噬菌体来源或合成来源。待扩增的RNA模板可分离自各种来源或各种生物样品。生物样品可以得含有或疑似含有靶核酸的生物受试者。生物样品也包括来自含有患病细胞的生物受试者的区的样品。生物样品可以是真核来源，例如，昆虫、原生动物、鸟类、鱼类、爬行动物和优选哺乳动物，例如大鼠、小鼠、牛、狗、豚鼠或兔，或灵长类，例如黑猩猩或人类。或者，生物样品可以是原核来源或病毒或噬菌体来源。

在试剂盒的一个实施方案中，至少一种酶具有逆转录酶活性，至少一种酶具有链置换DNA聚合酶活性，和至少一种酶具有在引物的肌苷残基的DNA 3'产生缺口的核酸酶活性。在某些其它实施方案中，至少一种酶同时具有逆转录酶和链置换DNA聚合酶的活性。在某些其它实施方案中，至少一种酶具有逆转录酶活性、链置换DNA聚合酶活性和在引物的肌苷残基的DNA 3'产生缺口的核酸酶活性。在某些实施方案中，DNA聚合酶是外切核酸酶缺乏的DNA聚合酶。在另一个实施方案中，所述试剂盒可包含酶，其具有逆转录酶活性和外切核酸酶缺乏的链置换DNA聚合酶活性。例如，delta Tts是具有逆转录酶活性的DNA聚合酶。参见例如，美国专利号5,744,312。所述试剂盒的一个或多个实施方案可包括选自Bst DNA聚合酶的DNA聚合酶、外切核酸酶缺乏的T7 DNA聚合酶、外切(-) Klenow、delta Tts DNA聚合酶及其组合。

在一个实施方案中，所述试剂盒包含内切核酸酶V。在某些具体的实施方案中，所述内切核酸酶V选自具有SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO:3或其保守变体的序列的蛋白。

在某些实施方案中，所述试剂盒进一步包括dNTPs、缓冲液、SSB、还原剂、变性剂、封闭剂、表面活性剂及其组合。包含dTTP、dCTP、dATP和dGTP的dNTPs的浓度范围为大约100 μM至100,000 μM。所述试剂盒可以进一步包含缓冲液，其选自Tris、HEPES或MOPS。所述试剂盒可包含一种或多种表面活性剂，其选自吐温20、NP-40、Triton X-100及其组合。

在一个或多个实施方案中，所述试剂盒进一步包括一种或多种还原剂，其选自二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇(β-ME)、2-巯基乙胺(MEA)、三(羧基乙基)膦(TCEP)。

所述试剂盒可以进一步包含单链DNA结合蛋白，其选自大肠杆菌SSB、T4基因32蛋白、T7基因2.5蛋白、Ncp7、recA及其组合。所述试剂盒可包含含有白蛋白的封闭剂。所述试剂盒可以进一步包含至少一种拓扑异构酶，可选自I型拓扑异构酶。

RNA扩增的示例性实施方案示意于图1。图1说明了经RNA模板逆转录的cDNA:RNA异源双链体的形成，接着是DNA扩增。当含有核苷酸类似物的引物(例如含肌苷的引物)与cDNA模板结合，自异源双链体置换RNA时，开始扩增反应，如图1所示。正向引物与cDNA模板结合后，内切核酸酶在含肌苷的正向引物的3'形成缺口并且DNA聚合酶合成DNA的互补链。产生DNA的互补链的过程称为延伸。这种产生缺口和随后延伸以循环方式重复发生，从而产生模板链的扩增产物。该步骤紧接着是使用多种正向和反向引物的多个扩增反应，所述引物包括与模板DNA的3'或5'末端结合的P1、P2、P3、P4、P5、P6，并且以同样机制导致扩增产物的形成。

图2在示意图中说明了自RNA模板开始的DNA扩增的另一个示例性实施方案。在该实施方案中，通过RNA模板的逆转录产生cDNA，然后是DNA扩增。使用DNA聚合酶和至少一种引物，通过合成互补链，单链cDNA形成双链DNA。当含肌苷的引物与cDNA模板结合，置换互补DNA链时，开始扩增反应，如图2所示。使用内切核酸酶、含肌苷的正向和反向引物(包括P1、P2、P3、P4、P5、P6)和DNA聚合酶，进行多个扩增反应以产生扩增产物。

图3示意性地说明了缺口形成和链置换扩增反应，其中当含有修饰碱基的引物(例如含肌苷的引物)与cDNA模板结合时，开始扩增反应。正向引物与cDNA模板结合后，内切核酸酶在含肌苷的正向引物上形成缺口，在引物链上形成缺口。然后链置换DNA聚合酶与引物的3'末端在缺口处结合，并以5'至3'的方向合成模板DNA的互补链。该步骤紧接着是使用多种正向和反向引物的多个缺口形成和扩增反应，以形成扩增产物。

图3所示的基本方法可通过使用额外引物或其它寡核苷酸、额外的酶、额外的核苷酸、染色剂、染料或其它带标记的组分而改变。因此，例如，用单个引物的扩增可用于双脱氧测序，对于每个模板分子产生多个测序产物，并且，任选通过加入染料-标记的双脱氧核苷酸终止子。可自双链cDNA产生带标记的探针，所述双链cDNA是用序列-标记的寡聚(dT)引物从mRNA样品制成。单一引物可以是标签序列的互补序列，便于鉴定和/或分离。

使用多个成对引物的扩增便于快速和大量扩增，这可用于检测特定序列的存在，以定量测定样品中存在的这些序列的量，或产生大量序列，用于通过方法来分析，所述方法例如测定大小的电泳、限制酶消化、测序、杂交或其它分子生物学技术。

实施例1 自RNA模板开始的DNA扩增，不考虑变性条件。

FirstChoice?人脾脏总RNA得自Life Technologies?。寡聚物(Oligo)得自Integrated DNA Technologies, Inc。使用Oligo SEQ ID NO: 1从总脾脏RNA制备cDNA:RNA异源双链体，其中SuperScript? II (SS II)逆转录酶和随同的缓冲液购自Life Technologies?并按照制造商的说明书来制备。

表1: 用于实施例1的寡核苷酸序列。

SEQ. ID No.寡核苷酸序列15'-d[CCAGCCTGGGCATCCTTGAI*T]-3'25'-d[TTCAGCTCTCGGAACATCTCI*A]-3'35'-d[TCACGCCCACGGATCTGAAI*G]-3'45'-d[CATCCAGTGGTTTCTTCTTTI*G]-3'55'-d[GAGAGGAGCTGGTGTTGTTI*G]-3'65'-d[TGCTCGCTTAGTGCTCCCTI*G]-3'75'-d[TTGTGCCTGTCCTGGGAGAI*A]-3'85'-d[GACGGAACAGCTTTGAGGTI*C]-3'95'-d[CACACTGGAAGACTCCAGTI*G]-3'105'-d[TGGGCGGCATGAACCGGAI*G]-3'115'-d[CTACATGTGTAACAGTTCCTI*C]-3'125'-d[CCTGAGGTTGGCTCTGACTI*T]-3'

表1含有SEQ ID No 1 – 12的寡聚物，其中“I”代表肌苷而“*”代表寡聚物序列中的硫代磷酸键。用在0.01 %吐温20 (Sigma)中的SEQ ID No 1 – 12的寡聚物制备反应混合物(mix)，使1 μl混合物含有10 pmol各寡聚物(Oligo Mix)。将10X变性缓冲液是100 mM HEPES (Sigma), pH 8.0, 1 mM EDTA (Life Technologies)和0.1 % 吐温20 (Sigma)的组合。10X反应缓冲液是100 mM HEPES, pH 8.0, 30 mM氯化镁(Life Technologies), 1 mM硫酸锰(Sigma), 0.1 % 吐温20, 2.5 mM dATP (GE Healthcare), 2.5 mM dCTP (GE Healthcare), 2.5 mM dGTP (GE Healthcare), 2.5 mM dTTP (GE Healthcare)和100 mM DTT (Sigma)的组合。酶稀释缓冲液是10 mM HEPES, pH 8.0, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 200 mM氯化钠(Sigma), 0.01 %吐温20和50%甘油(Sigma)。Bst DNA聚合酶(DNAP)的大片段来自New England Biolabs^?, Inc。突变的大肠杆菌内切核酸酶V (内切V；Y76A)来自General Electric Company。额外试剂包括25 %甲酰胺(Sigma)和99.5 %乙二醇(Sigma)。

制备单一等温扩增反应物，终体积10 μl。这一总体积的5 μl来自变性混合物，5 μl来自反应混合物。

变性混合物含有200 ng总脾脏RNA或1 μl完全的cDNA反应物。将0.5 μl 10X变性缓冲液、0.5 μl 25 %甲酰胺和1 μl寡聚物混合物加入到变性混合物中，并用水将终体积调节至5 μl。当包括无模板对照(NTC)时，cDNA或总RNA的体积用水来替代(GIBCO^?)。

各种酶混合物由40单位Bst DNA聚合酶、1 μg大肠杆菌单链DNA结合蛋白(SSB；Affymetrix-USB)和255 ng内切V (Y76A)组成。用酶稀释缓冲液将酶混合物的终体积调节至1 μl。然后将酶混合物(1 μl)与1 μl 10X反应缓冲液、2 μl乙二醇和1 μl 10 mg/ml BSA (Sigma)混合以制备反应混合物。

对于本实施例，制备了相同的两组，各自含有6个反应。反应1是无模板对照(NTC)，反应2含有1 μl cDNA以及Bst DNAP，反应3含有200 ng RNA以及Bst DNAP，反应4含有200 ngRNA以及Bst DNAP和SS II，反应5含有RNA以及Bst DNAP并加入75 mM KCl，反应6含有RNA以及Bst DNAP和SS II两者并加入75 mM KCl。

表2 不同反应混合物的组成。

将一组变性混合样品经65°C加热5分钟而处理，然后冷却至22°C。将另一组变性混合样品经95°C加热2分钟而变性，然后冷却至22°C。冷却后，将各样品涡旋振荡并微量离心。

将单独的变性混合物和反应混合物在45°C预热30秒，然后将5 μl反应混合物与5 μl变性混合物混合。将反应物在45°C孵育1小时。孵育后，将3 μl各反应物与6 μl凝胶上样缓冲液II (Life Technologies)混合，在95°C加热变性2分钟并在冰上淬灭。按照制造商的说明书，将来自各变性样品的5微升上样到10%丙烯酰胺TBE-Urea凝胶(Life Technologies, Inc.)的单独的孔中并进行电泳。

凝胶上包括含有0.45 μg 10 bp DNA梯(Life Technologies；泳道M)的一个泳道。继续电泳，直到溴酚蓝染料到达距离凝胶底部大约2 cm为止。将凝胶在1:500稀释的SYBR Gold (Life Technologies)的TE 缓冲液(pH 7.4) (Sigma)中染色15分钟，并在Typhoon^TM 9410 Variable Mode Imager (GE Healthcare)上成像。

图4显示了凝胶图像，其中预期大小的条带同时出现在反应2(其使用cDNA作为扩增模板)和反应4(其使用总RNA作为扩增模板并与Bst DNA聚合酶和SSII逆转录酶混合)中。对于有和无95°C的最初变性两者，泳道2和4中的条带均相同，表明当在单个管内自RNA模板开始时，等温扩增方法起作用。等温扩增发生在自RNA模板开始的一步反应中，其中使用SSII^TM RT，在95°C变性之前或之后将RNA转化为cDNA。在泳道1、3、5和6中显示无扩增产物。泳道1中不存在任何扩增产物，因为NTC预期作为反应混合物，缺乏任何模板。泳道3中不存在扩增产物，其中反应混合物含有RNA和Bst DNA Pol，确定了Bst DNA Pol存在时，RNA不转化为cDNA，因此酶Bst DNA Pol没有任何逆转录酶活性。泳道5显示在逆转录酶不存在时无扩增产物，并且Bst DNA Pol不能逆转录RNA，甚至在75 mM KCl存在时。泳道6显示最低浓度的扩增产物，其中在RNA、Bst DNA Pol、SSII和75 mM KCl存在时进行反应。因为泳道6的反应混合物不同于泳道4的反应混合物，不同之处仅在于反应6中加入75 mM KCl。理想地，KCl用于优化逆转录反应，尽管更高浓度的KCl看来对内切核酸酶V具有抑制效应，从而抑制整个反应。

实施例2 使用不同逆转录酶的逆转录

如实施例1制备和分析等温扩增反应物，其中起始RNA模板的变性在95°C进行。对于本实施例，将增加量的同时含有逆转录酶和RNA酶H活性的莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV；Life Technologies)逆转录酶(RTase)，或SS II RTase (降低的RNA酶H活性)加入到扩增反应物中。如所示的，反应物含有12.5、25、50或100单位的MMLV或SS II。含有任一RTase的扩增反应物合成预期大小的片段，表明在RNA逆转录、接着扩增的单个组合反应中的靶mRNA的成功扩增，如图5所示。

实施例3 在单一反应混合物中RNA的等温扩增，无变性

如实施例1制备和分析等温扩增反应物，但在扩增前，起始RNA模板无任何变性。将200 ng总RNA (来自脾或肾)单独扩增，有或无30分钟的RNA酶A预处理(以消除RNA，作为阴性对照)。寡聚物混合物与先前在实施例1中所用的相同，其自cDNA:RNA模板开始已扩增了正确的产物大小。在扩增前，RNA酶A未被灭活。50单位的SS II包括在所有反应中。

表3 用于实施例3的寡核苷酸序列

表3含有SEQ ID No 13 – 24的寡聚物，其中“I”代表肌苷而“*”代表寡聚物序列中的硫代磷酸键。在相同条件下使用经设计用于扩增p53的不同引物组(Oligo SEQ ID NO: 13-24)作为扩增的阳性对照，扩增人基因组DNA。扩增对照包括：1)无模板/无酶(NE)和，2)无模板/加上酶(NTC)。图6显示来自脾和肾RNA两者作为起始材料而无RNA酶A处理的RNA扩增的预计大小的条带。图6显示与来自分离自脾的RNA模板相比，来自分离自肾的RNA模板的扩增产物的较低量，证实如所预期的，在肾中的较低拷贝数的p53 mRNA。另外，图6显示在有或无RNA酶处理时，甚至在反应物中存在逆转录酶时，DNA扩增产生预期大小的片段。图7显示用RNA酶A处理的RNA模板的扩增产物。在扩增前，用RNA酶A处理模板，不显示预期的扩增产物，表明在单个管中自RNA模板发生了扩增。本实验的结果表明1)起始材料的热变性对于成功的单个管的扩增反应(RNA或DNA)而言不是必需的，和2)在单个管中的用于自DNA或RNA扩增的单个扩增方案可用于本发明的扩增。

尽管本文仅阐明和描述了本发明的某些特征，但本领域技术人员可想到许多修改和改变。因此，应该理解，所附权利要求书意图涵盖落入本发明真实精神之内的所有这类修改和改变。