基于胚泡发育的胚胎质量评估

摘要

本发明涉及一种基于观察到的细胞动力学和细胞形态学来选择用于体外受精的胚胎的方法和系统。本发明的一个实施方案涉及一种用于确定胚胎质量的方法，其包括将所述胚胎监测一段时间，所述一段时间包括所述胚胎从初始致密化或桑椹胚转化成胚泡，和测定所述胚胎的一个或多个胚泡质量标准，以及基于所述一个或多个胚泡质量标准来确定胚胎质量。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于观察到的细胞动力学和细胞形态学、尤其是在从 致密化起始到胚泡形成的后期阶段中的胚胎发育来选择用于体外受精的 胚胎的方法和系统。

背景技术

不孕症影响全球超过8千万人。据估计，所有夫妇中有10％经历原 发性或继发性不孕症。体外受精(IVF)是一种可选择的医学治疗，其可以 为原本不能怀孕的夫妇提供受孕的机会。它是将卵子(卵母细胞)从女性卵 巢中取出然后在实验室中用精子使其受精的过程。然后将这个过程中产生 的胚胎放入子宫中以进行可能的着床。为了避免多胎妊娠和多胞胎，只移 植几个胚胎(通常少于4个并且理想地只有1个)。选择用于移植的适当胚 胎是任何IVF治疗中的关键步骤。当前的选择程序大部分完全基于使用 标准立体显微镜对胚胎在发育期间的不同时间点的形态学评价，尤其是在 移植时的评价。然而，人们普遍认识到，该评价程序需要定性以及定量方 面的改进。

一种方法是使用“早期卵裂”至2细胞期(即在授精/注射后25-27 小时之前)作为质量指标。在这种方法中，在受精后25-27小时对胚胎进 行目视检查以确定第一次细胞卵裂是否已经完成。然而，虽然早期卵裂以 及其它早期标准可能是关于发育成胚胎的质量指标，但是仍然需要关于着 床成功并且从而因此成功怀孕的质量指标。

在此申请中或在本申请中引用的所有专利和非专利参考文献也以全 文引用的方式并入本文中。

发明内容

最近的研究(Wong等人(2010))集中于胚胎基因组活化(EGA)之前的 胚胎发育，指示了人类胚胎发育的成功和失败主要是在EGA之前确定的， 从而证明在受精后第2天的早期着床是正确的。本申请人在2012年5月 31日提交的未决申请PCT/DK2012/05018(“Embryo quality assessment  based on blastomere cleavage and morphology”)监测了其中发生胚胎基因 组活化的后续卵裂的发生时间(timing)和持续时间，并且产生了另外的胚 胎质量标准。然而，本发明人已经发现，监测胚胎一直到胚泡期(在此期 间胚胎基因组活化已经完全占主导地位(take over))，可以产生一系列的胚 泡质量标准，所述胚泡质量标准在选择已转化为胚泡的胚胎以增加着床成 功性方面非常有用。传统上已经基于滋养外胚层中或内细胞团中的细胞数 目评价了胚泡，但是这些胚泡参数难以定量。因此，本发明的目的是研发 更容易定量的新颖胚泡质量标准，以评价胚泡期的胚胎质量。

因此，本发明涉及一种有助于在胚胎转化成胚泡后基于胚胎发育期间 选取的形态学和/或动力学参数来选择待移植用于着床的最佳体外受精胚 胎的方法和系统。

在第一方面，本发明涉及一种用于确定胚胎质量的方法，其包括将所 述胚胎监测一段时间，所述一段时间包括胚胎从受精或初始致密化转化成 胚泡，即胚泡期中的一个；和测定所述胚胎的一个或多个胚泡质量标准； 以及基于所述一个或多个胚泡质量标准来确定胚胎质量。具体来说，可将 本发明应用于人类胚胎，并且获得的胚胎质量量度可用于鉴别和选择适合 移植到女性子宫中以便提供妊娠和活产婴儿的胚胎。

胚泡质量标准可以有利地与例如在WO 2007/144001中和在2012年5 月31日提交的名称为“Embryo quality assessment based on blastomere  cleavage and morphology”的未决PCT申请PCT/DK2012/05018中列出的 早期胚胎质量参数组合，并且因此与胚胎质量和胚胎存活力的其它信息组 合。这些申请因此也以全文引用的方式并入本文中。

定义和胚胎质量参数

卵裂时间被定义为观察到新形成的卵裂球被融合的细胞膜完全分开 的第一时间点。因此，卵裂时间是卵裂球卵裂完成的时间。在本上下文中， 所述时间被表示为ICSI显微注射后的小时数或在IVF中混合精液和卵母 细胞后的小时数，即授精时间。这是将精子专门引入到卵子中的时间。然 而，在本文中，还使用了术语受精来描述这个时间点。因此，卵裂时间如 下：

·t2：卵裂成2卵裂球胚胎的时间

·t3：卵裂成3卵裂球胚胎的时间

·t4：卵裂成4卵裂球胚胎的时间

·t5：卵裂成5卵裂球胚胎的时间

·t6：卵裂成6卵裂球胚胎的时间

·t7：卵裂成7卵裂球胚胎的时间

·t8：卵裂成8卵裂球胚胎的时间

细胞周期的持续时间定义如下：

·cc1＝t2：第一个细胞周期。

·cc2＝t3-t2：第二个细胞周期，即作为2卵裂球胚胎的时间段的 持续时间。

·cc2b＝t4-t2：两个卵裂球的第二个细胞周期，即作为2卵裂球 胚胎和3卵裂球胚胎的时间段的持续时间。

·cc3＝t5-t3：第三个细胞周期，即作为3卵裂球胚胎和4卵裂球 胚胎的时间段的持续时间。

·cc2_3＝t5-t2：第二个和第三个细胞周期，即作为2卵裂球胚胎、 3卵裂球胚胎和4卵裂球胚胎的时间段的持续时间。

·cc4＝t9-t5：第四个细胞周期，即作为5卵裂球胚胎、6卵裂球 胚胎、7卵裂球胚胎和8卵裂球胚胎的时间段的持续时间。

同步时间定义如下：

·s2＝t4-t3：从2卵裂球胚胎分裂成4卵裂球胚胎的同步性。

·s3＝t8-t5：从4卵裂球胚胎分裂成8卵裂球胚胎的同步性。

·s3a＝t6-t5；s3b＝t7-t6；s3c＝t8-t7：从4卵裂球胚胎发育成8 卵裂球胚胎中涉及的各细胞分裂的持续时间。

卵裂期：从第一次观察到细胞膜中出现凹陷(指示胞质卵裂开始)到胞 质细胞卵裂完成而使得卵裂球完全被融合的细胞膜分开的时间段。也称作 胞质分裂的持续时间。

受精和卵裂是胚胎的主要形态学事件，至少持续到8卵裂球期。卵裂 时间、细胞周期、分裂同步性和卵裂期是可以从这些主要形态学事件定义 的胚胎形态学参数的示例，并且这些胚胎形态学参数中的每一个都被定义 为两个形态学事件之间的时间周期的持续时间，例如以小时计。

归一化的胚胎形态学参数被定义为两个胚胎形态学参数的比率，例如 cc2除以cc3(cc2/cc3)、或cc2/cc2_3或cc3/t5或s2/cc2。

可以组合多个细胞周期(例如CC1、CC2、CC3和CC4)的持续时间以 形成共同的归一化参数：

其中CCi例如选自CC1到CC4。在本发明的一个实施方案中，高CC _归一化值指示差胚胎质量，因为变量CCi中的一个或多个远离中值，即使用 的不是CCi的绝对值，而是这些变量的相互关系。中值可以基于整个群 体或群体的部分(例如具有已知和阳性着床的胚胎)来计算。使用对数值替 代的另一个等价变量(lCC_归一化)也可以用于评估胚胎质量。

同样地，可以组合细胞分裂的同步时间Si(例如S2、S3和S4)以形成 共同的归一化参数：

在本发明的一个实施方案中，高S_归一化值指示差胚胎质量，因为同步 时间中的一个或多个相比较长。使用对数值替代的另一个等价变量(lS_归一化)也可以用于评估胚胎质量。

取决于孵育的持续时间，变量CC_归一化和S_归一化可以基于第一个细胞周 期、第二个细胞周期、第三个细胞周期或第四个细胞周期来计算。

来自相同申请人的于2012年6月29日提交并且名称为“Adaptive  embryo selection criteria optimized through iterative customization and  collaboration”的未决申请PCT/DK2012/050236涉及的问题是改变在不同 孵育条件下(例如不同诊所中)的胚胎培养物群体之间的胚胎质量标准。该 申请以全文引用的方式并入本文中。然而，质量参数如CC_归一化、lCC_归一化、 S_归一化和lS_归一化可有助于确保质量模型将在不同孵育条件下培养的不同胚 胎群体之间可直接应用，因为它们是基于对操作条件差异不敏感的变量。 其另一示例是基于相对时间段(例如CC2/CC3)的质量参数，相对时间段是 用该变量的中心估计值(例如平均值或中值，例如cc2/cc2_中值)相除或使 用目标区间的变量，其中根据中心估计值定标(scale)中心，并且根据变 异估计值(例如方差、标准偏差、百分位数)定标边界。

可以使用以下离散(二元)变量：

·MN2：在2卵裂球期观察到的多核现象(Multi nucleation)；可以 采取值“真”或“假”。

·MN2val：2细胞期时多核细胞的数目(0、1、2)。

·MN4：在4卵裂球期观察到的多核现象；可以采取值“真”或 “假”。

·MN4val：4细胞期时多核细胞的数目(0、1、2、3、4)。

·EV2：2卵裂球胚胎中卵裂球的均匀性；可以采取值“真”(即 均匀)或“假”(即不均匀)。

胚泡相关参数

胚泡质量标准是胚胎质量标准的一个示例。胚泡质量标准涉及胚胎从 致密化(即初始致密化)发育成孵化的胚泡。致密化是以下过程，其中具有 紧密连接的卵裂球与桥粒之间的接触加强，导致细胞间隙减小和细胞轮廓 变模糊(参见图3)。在致密化之前，胚胎的卵裂球可被单个地追踪，并且 在致密化之前，胚胎发育遵循清晰的且基本同步的细胞分裂的途径，这可 以通过肉眼观察到并且容易注释。在致密化之后，胚胎发育的特征是从桑 椹胚到胚泡的几乎连续的发育，其中非常难以追踪单个卵裂球，但是许多 阶段在视觉上是特征性的，并且可以被注释而变成胚泡相关参数。可以使 用以下胚泡相关参数：

初始致密化(IC)描述观察到2个或更多个卵裂球之间的致密化的第一 时间。因此，IC标志着致密化过程的起始。

桑椹胚(M)被定义为观察到在任何卵裂球之间都不存在质膜的第一 时间。当致密化过程完成时，在形成致密化的任何卵裂球之间都未见质膜， 胚胎可被定义为桑椹胚。最通常，在S3之后、接近第四个同步期(S4)开 始时见到桑椹胚。在致密化开始之前胚胎很少卵裂成16个或更多个细胞。

滋养外胚层的初始分化(IDT)被定义为在桑椹胚期过程中识别出明显 的滋养外胚层细胞的第一时间。其描述了滋养外胚层细胞分化的开始。卵 裂球逐渐变平变长，从而在外部环境与桑椹胚的内部细胞部分之间产生屏 障。

早期胚泡(ERB)被定义为可以观察到充满流体的空腔即胚泡腔的第 一时间。其也被称为“成腔作用开始”。其描述了胚胎的桑椹胚期与胚泡 期之间的过渡阶段的起始。在进入实际胚泡期之前，胚胎通常在这个过渡 阶段中停留一段时间。成腔作用开始通常在滋养外胚层细胞分化之后立即 出现。与外部环境接触的桑椹胚外层开始主动地将盐和水泵送到细胞间隙 中，因此开始形成空腔(胚泡腔)。

胚泡(Bl)被定义为最终形成了充满流体的空腔的时候，即所述空腔在 胚泡开始扩张(tEB)之前不再显著增大的时候。

内细胞团的初始分化(IDCIM)被定义为可以识别到内细胞团的第一 时间。IDCIM描述内细胞团发育的起始。偏心放置的细胞簇由其中细胞 之间的边界似乎不太明确的间隙连接连接。

胚泡扩张的开始(EB)被定义为胚胎充满卵周隙并且开始移动/扩张透 明带(zona pellucida)的第一时间。EB描述胚胎扩张的起始。随着胚泡扩张， 透明带变得明显更薄。

孵化中的胚泡(HB)被定义为滋养外胚层细胞离开/穿透透明带的第一 时间。

完全孵化的胚泡(FH)被定义为在孵化完成且透明带脱落时。

收缩次数(NC(X))描述胚胎在成腔作用开始之后所经历的收缩次数 (X)。在许多胚胎中，收缩可以很强并且导致胚胎体积显著减小。收缩被 定义为胚胎的横截面表面积减小超过15％。

空泡形成程度(VC(X)；X＝{0、1、2、3})描述桑椹胚期起始后的空泡 形成程度。空泡的程度被评定为0-3级(0＝无空泡形成；1＝较小程度的空 泡形成，其中出现小空泡但胚胎发育似乎不受影响；2＝中等程度的空泡 形成，其中出现大空泡并且胚胎发育在某种程度上受到影响；3＝严重的 空泡形成，其中出现很大的空泡并且胚胎发育受到严重影响)。在这种情 况下，空泡会被误认为是胚泡成腔作用。

部分致密化(PC)描述其中在致密化过程中不包括一个或多个卵裂球 的不均匀致密化。

在人类中，胚胎基因活化(EGA)通常在第3天大约8细胞期发生。在 EGA之前，观察到胚胎只翻译母系遗传的mRNA，即在卵母细胞受精时 存在于该卵母细胞中的mRNA。mRNA位于卵母细胞的不同部分中，使 得当卵母细胞/合子分裂时，该mRNA被分离到不同的卵裂球中。这种分 离被认为是在EGA之前发生的大量细胞分化的基础。在EGA之后，胚 胎开始转录其自身DNA，细胞变能够运动的并且细胞分裂变得不同步。 因为细胞现在转录其自身DNA，所以在这个阶段中第一次观察到父系基 因的差异表达。EGA附近的过渡也被称为中期胚泡或中期胚泡过渡。

染色体内容物

非整倍性是异常数目的染色体并且是一种类型的染色体异常。非整倍 体胚胎可以具有一条或多条缺失的染色体和/或一条或多条额外的染色 体。在细胞分裂期间，当染色体在两个细胞之间没有正确分离时，出现非 整倍性。非整倍体胚胎是含有非整倍性的胚胎。相应地，整倍体胚胎是特 征为染色体正常的胚胎。整倍体(即正常)胚胎具有正确数目的染色体对。 例如，整倍体人类胚胎具有23对染色体，总计46条染色体。

大多数情况的非整倍性导致发育中胎儿终止发育，但是也可有活胎出 生的情况。额外的或缺失的染色体是遗传障碍(出生缺陷)的常见原因。因 此尤其关注在移植前能够检测到非整倍体IVF胚胎，因为这些胚胎中的 一些能够发育到活胎出生，但是可能具有不想要的遗传障碍。

其它参数

细胞位置的重排＝细胞移动(参见下文)

细胞移动：细胞中心和外部细胞膜的移动。细胞器在细胞内的内部移 动不是细胞移动。外部细胞膜是动态结构，因此细胞边界将连续地且轻微 地改变位置。然而，这些轻微波动不被认为是细胞移动。当细胞的重心和 其相对于其它细胞的位置变化时以及当细胞分裂时，发生细胞移动。细胞 移动可以通过计算移动中的细胞的两个连续数字图像之间的差异来定量。 在2006年10月16日提交的名称为“Determination of a change in a cell  population”的未决PCT申请中详细描述了所述定量的示例。然而，可以 设想其它用于测定细胞重心移动和/或细胞质膜位置移动的方法，例如通 过使用FertiMorph软件(ImageHouse Medical,Copenhagen,Denmark)半自 动地勾勒出在穿过胚胎的连续光学横断面中每个卵裂球的边界。

细胞器移动：可以通过显微镜检查法看到胚胎内的内部细胞器和细胞 器膜的移动。在本申请的上下文中，细胞器移动不是细胞移动。

移动：物体的空间重排。通过许多不同的参数来对移动进行表征和/ 或定量和/或描述，所述参数包括(但不限于)：移动程度、移动中所涉及的 面积和/或体积、旋转、平移矢量、移动的取向、移动的速度、大小调整、 膨胀/紧缩等。细胞或细胞器移动的不同量度因此可用于不同目的，这些 量度中的一些反映了移动的程度或幅度，一些反映了移动物体的空间分 布，一些反映了受移动影响的轨迹或体积。

胚胎质量是所述胚胎在移植后成功地在子宫中着床和发育的能力的 量度。相比低质量的胚胎，高质量的胚胎具有更高的在移植后成功地在子 宫中着床和发育的概率。然而，即使高质量的胚胎也不是着床的保证，因 为实际移植和女性的感受性高度影响最终结果。

存活力和质量在本文中可互换使用。胚胎质量(或存活力)量度是旨在 反映胚胎的质量(或存活力)的参数，使得具有高质量参数值的胚胎具有较 高的概率成为高质量(或存活力)的胚胎，而具有较低的概率成为低质量(或 存活力)的胚胎。而具有相关的低质量(或存活力)参数值的胚胎只具有较低 的概率成为高质量(或存活力)的胚胎，而具有较高的概率成为低质量(或存 活力)的胚胎。

附图说明

图1：一直到8卵裂球期的胚胎的分裂模式的命名，其显示了与所获 得的图像有关的卵裂时间(t2-t5)、细胞周期的持续时间(cc1-cc3)和同步时 间(s1-s3)。

图2：一直到胚泡期的胚胎发育。数字是指每个阶段中卵裂球的数目。 字母a到e是指以下动力参数。a：桑椹胚(M)，b：滋养外胚层的初始分 化(IDT)，c：胚泡(Bl)，d：胚泡扩张的开始(EB)，e：孵化中的胚泡(HB)。 如果存在的话，可以在t5与桑椹胚(a)之间观察到初始致密化(IC)，IC通 常在桑椹胚前几分钟到几小时。如果存在的话，在阶段a与c之间可以观 察到部分致密化(PC)。如果存在的话，在阶段a与d+之间可以观察到空 泡形成(VC(X))和收缩(NC(X))。

图3a：在初始致密化即将开始之前的胚胎的照片。

图3b：在初始致密化时的胚胎的照片。致密化是以下过程，其中具 有紧密连接的卵裂球与桥粒之间的接触加强，导致细胞间隙减小和细胞轮 廓变模糊，如图3b中所见。当致密化完成时，在任何卵裂球之间都见不 到质膜，并且胚胎可被定义为桑椹胚。

图4a：完整桑椹胚之前的胚胎的照片。

图4b：图4a中的同一胚胎，在胚胎处于桑椹胚期2.5小时之后。当 致密化完成时，在任何卵裂球之间都见不到质膜，并且胚胎可被定义为桑 椹胚。

图5a：在滋养外胚层的初始分化即将开始之前的胚胎的照片。

图5b：图5中的同一胚胎，在滋养外胚层的初始分化时，这是在桑 椹胚期中识别出明显的滋养外胚层细胞(如由3个箭头所指示)的第一时 间。其描述了滋养外胚层细胞分化的开始。卵裂球逐渐变平变长，从而在 外部环境与桑椹胚的内部细胞部分之间产生屏障。

图6a：在成腔作用即将开始之前的胚胎(早期胚泡)的照片。

图6b：图6a的同一胚胎，在成腔作用开始时，这是可以观察到充满 流体的空腔即胚泡腔(如由两个箭头所指示)的第一时间。与外部环境接 触的桑椹胚外层开始主动地将盐和水泵送到细胞间隙中，因此开始形成空 腔(胚泡腔)。

图7a：在胚泡扩张(EB)即将开始之前的胚泡的照片。

图7b：图7a的同一胚胎，但此时胚泡正在扩张。扩张开始是胚胎充 满卵周隙并且开始移动/扩张透明带的第一时间。EB描述胚胎扩张的起 始。随着胚泡扩张，透明带变得明显更薄。

图8a：在孵化即将开始之前的扩张胚泡的照片。

图8b：图8a的同一胚胎，但此时胚泡正在孵化，这是滋养外胚层细 胞离开/穿透透明带的第一时间。

图9a和图9b是只具有部分致密化的胚胎的照片，所述部分致密化是 其中在致密化中不包括一个或多个卵裂球的不均匀致密化过程，如图中的 标记所图解说明。

图10a、图10b和图10c是图解说明不同的空泡形成程度(1、2和3) 的胚胎照片，所述空泡形成程度是桑椹胚期之后的空泡形成程度。

图11a和图11b是存在20分钟差异的同一胚胎的照片。在图11a中， 胚泡发生扩张，而在图11b中的20分钟后，胚泡显然有明显收缩。收缩 被定义为胚胎横截面的横截面表面积减小超过15％。

图12：基于以下各项的具有参数t5-s2-cc2的分层决策树模型示意图： i)形态学筛选；ii)不存在排除标准；iii)细胞分裂成5个细胞的发生时间(t5)； iv)从2细胞期到4细胞期的分裂同步性s2，即3细胞期的持续时间；v) 第二个细胞周期的持续时间cc2，即分裂到3细胞期与分裂到5细胞期之 间的时间。所述分类产生了预期的着床潜能递增(从右到左)并且每个等级 中的胚胎数目几乎相等的10个等级的胚胎。

图13a和图13b：根据t2被分成四分位数并且每个四分位数均具有预 期值的已知着床数据(参见实施例1)(图13a)。从这些四分位数组，通过具 有类似概率的3个邻近四分位数Q1、Q2和Q3形成了新的目标组(图13b)。

图14：决策树模型的示例。

图15：决策树模型的示例。

图16：显示了351个胚胎的已知着床数据(参见实施例1和3)，其中 将已知结果标绘于具有tEB沿第一轴和tBl沿第二轴(其中tBl被称为“tB”) 的图中。成功的着床用正方形显示，而失败的着床用三角形显示。

具体实施方式

质量的测定

对于预测胚胎发育和体外受精(IVF)治疗结果的预后因素的寻找已经 吸引了相当多的研究关注，因为预计对于所述因素的了解可以改进未来的 IVF治疗。

如以上所讨论，一个有前景的预测因素是早期胚胎发育中的关键事件 的准确发生时间。涉及成像的研究已经局限于对早期发育(例如原核形成 和融合)和到第一次卵裂的时间的测量(Nagy,Z.P.1994,Fenwick,J.2002, Lundin,K.2001,Lemmen,J.G.2008)。缩时分析(time-lapse analysis)的一项 重要发现是到4细胞期的早期卵裂模式与随后向胚泡期的发育之间的相 关性。对于牛胚胎发育的形态动力学分析也已被公开，其中早期胚胎发育 中的细胞卵裂的发生时间、持续时间和细胞卵裂之间的时间间隔成功地预 测了随后向扩张胚泡期的发育(Ramsing 2006,Ramsing 2007)。

本发明人已经进行了一项大型临床研究，所述研究涉及许多人类胚 胎，并且不仅对发育进行监测直到胚泡形成，而且进一步对发育进行监测 直到有胚胎着床的体征。在这项研究中，观察到着床的胚胎(即被移植且 随后成功着床的胚胎)与未着床的胚胎(即被移植但未成功着床的胚胎)之 间在发育的时间模式上的重要差异。通过使用着床作为终点，不仅评估了 胚胎形成胚泡的能力，而且还评估了随后的非常必需的过程，例如孵化和 在子宫中的成功着床。

已经发现表征胚胎细胞分裂的参数存在最佳时间范围。这些观察结果 支持胚胎存活力与在受精时开始的一系列受高度调控的细胞事件有关的 假设。在这项专门针对优质胚胎的临床研究中，已经证实胚胎的着床能力 与许多不同的细胞事件相关。模型中的复杂性、结构和参数必须可适应于 不同的临床情况，如孵育温度、移植时间、培养基以及其它情况。

胚胎发育中早期事件的发生时间与发育成胚泡相关，并且发育成胚泡 是成功着床的必备条件，因此胚泡形成本身就是质量参数。然而，已经发 现发育成胚泡未必与胚胎的成功着床相关。

在第2天的早期着床的支持者认为，将胚胎延长培养到大约第5天的 胚泡期会产生潜在风险，因为培养期被显著延长，这可能破坏胚胎完整性。 然而，培养期延长到胚泡期具有若干优点。被培养的人类胚胎具有仅约 30-50％的平均胚泡形成率，并且通过延长培养期，大部分的低质量胚胎 已通过未形成胚泡而被自动排除。此外，在大约5-8卵裂球期时的EGA 之后，胚胎自身的DNA控制发育。通过评价胚泡期的胚胎，可以较高的 确定程度鉴别高质量胚胎。

因此，所述数据允许针对着床潜能检测胚泡相关发育标准。结果尤其 指示后期事件(例如成腔作用的开始)的发生时间是着床潜能的一贯良好 的指标，并且相对于早期事件(t2、t3和t4)，当使用胚泡质量标准(例如tBl) 时，可以改进在着床胚胎与非着床胚胎之间进行辨别的能力。所呈现的数 据指示将胚胎孵育到胚泡期可以提供将改进对具有高着床潜能的有活力 的胚胎进行选择的能力的另外的重要信息。权利要求书列出了许多可以单 独应用或者成组地组合应用以评估胚胎质量的胚胎质量标准和胚泡质量 标准。

本发明的一个实施方案涉及一种用于确定胚胎质量的方法，其包括将 所述胚胎监测一段时间和测定所述胚胎的一个或多个胚泡质量标准，其中 所述一段时间包括从受精到胚泡期的时间，并且其中测定：1)从受精一直 到母系遗传的mRNA在卵裂球中的翻译完成的第一时间段的持续时间、 和2)从卵裂球自身DNA的转录起始到所述胚泡期的第二时间段的持续时 间，并且其中胚泡质量标准是所述第一时间段与所述第二时间段的比率， 并且基于所述一个或多个胚泡质量标准来确定胚胎质量。

本发明的另一个实施方案涉及一种用于确定胚胎质量的方法，其包括 将所述胚胎监测一段时间，所述一段时间包括从受精到胚泡期的时间，其 中测定：1)从受精到5卵裂球胚胎的第一时间段的持续时间、和2)从5 卵裂球胚胎到所述胚泡期的第二时间段的持续时间，并且其中胚泡质量标 准是所述第一时间段与所述第二时间段的比率，并且基于所述胚泡质量标 准来确定胚胎质量。

从受精到胚泡期的时间因此被划分成两个时间段，并且这些时间段之 间的比率是胚泡质量标准。在5卵裂球期划分的原因是因为这大致是胚胎 基因活化的时间。因此，在本发明的又一个实施方案中，所述时间段包括 从受精到胚泡期的时间，其中测定：1)从受精到母系遗传的mRNA在卵 裂球中的翻译完成的第一时间段的持续时间、和2)从卵裂球自身DNA的 转录起始到所述胚泡期的第二时间段的持续时间，并且其中胚泡质量标准 是所述第一时间段与所述第二时间段的比率。

在本发明的又一个实施方案中，如果第二时间段除以第一时间段的比 率大于预定值，那么所述比率是高胚胎质量的指标。

相应的胚泡质量标准可以通过以下步骤提供：测定：1)从受精到胚泡 的第一时间段的持续时间、和2)从卵裂球自身DNA的转录起始到所述胚 泡期的第二时间段的持续时间，以及获得这些时间段的比率。这个比率提 供了关于以下的信息：在从受精到胚泡的总时间段内有多长时间胚胎自身 的DNA处在控制地位。再次地，如果第二时间段除以第一时间段的比率 大于预定值，那么所述比率是高胚胎质量的指标。这个比率可被视为某段 时间中的相对发育速度相对于直到那个阶段之前的总体发育速度的量度。 因此，相对于总体发育时间，从胚胎自身的基因组在EGA时占主导地位 的时间开始耗用较长时间进行发育的胚胎似乎具有更高的着床概率。或者 类似地，相对于在EGA之前母系遗传的mRNA处在控制地位时的时间， 从胚胎自身的基因组在EGA时占主导地位的时间开始耗用较长时间进行 发育的胚胎具有更高的着床概率。

早期卵裂(即低的t2)长久以来被称为胚胎质量指标。低的t4和t5也 是质量指标，从而显示EGA之前的快速发育是高质量的指标。在本文中 还证实了在大约96小时之前到达胚泡期(胚泡，tBl)的胚胎具有更高的着 床概率，从而显示通常一直到胚泡期的快速发育是质量指标。因此令人惊 讶的是，这个快速发育中的缓慢阶段(即EGA之后的阶段)是质量指标。 通常，EGA的时间没有被明确地测定，其可被定义在例如t4、t5或t8。 也可这样定义：“在EGA之前”是一直到4卵裂球期(即t4)的发育，并且 “在EGA之后”可被定义为在8卵裂球期之后。

上述胚泡期可选自以下组：初始致密化(IC)、桑椹胚(M)、滋养外胚 层细胞的初始分化(IDT)、早期胚泡(ERB)、胚泡(Bl)、胚泡扩张(EB)、第 一次收缩(CPS(1))、第二次收缩(CPS(2))、第三次收缩(CPS(3))、第四次收 缩(CPS(4))、第五次收缩(CPS(5))、第六次收缩(CPS(6))、第七次收缩 (CPS(7))、孵化中的胚泡(HB)和完全孵化的胚泡(FH)。因此，tIC是从受 精到初始致密化的时间，tM是从受精到桑椹胚的时间，以此类推。

又一个胚泡质量标准可以是对胚泡的绝对或相对2D和/或3D扩张的 测定，例如胚泡腔扩张速度，其中举例来说，快速扩张可以是质量指标。 又一个胚泡质量标准可以是胚泡的最大扩张程度，例如相对于扩张的胚泡 的最大胚胎直径的扩张前的直径。因此，胚泡质量标准可以是对扩张开始 时胚胎的直径和/或体积的测定。此外，胚泡质量标准可以是对孵化前的 胚泡的最大直径和/或最大体积的测定。

多个变量

在挑选选择标准时，可以使用多个变量。当使用多个变量时，优势可 能在于对变量进行逐步地选择，使得最初选择出在早期能够以高准确度测 定的一个或多个变量，例如t2、t3、t4或t5。随后，可以使用可能更难以 测定并且与更高的不确定性相关的其它变量。

归一化或相对参数

在本发明的一个实施方案中，胚胎质量标准选自归一化的胚胎形态学 参数的组，例如基于选自t2、t3、t4、t5、t6、t7和t8的组的两个、三个、 四个、五个或更多个参数的归一化的形态学参数的组。通过对参数进行归 一化，可以从胚胎质量评估中“去除”受精时间。此外，归一化的胚胎形 态学参数可以更好地描述具体胚胎的发育速率的均一性和/或规律性而不 依赖于环境条件，因为代替与可能依赖于局部环境条件的“整体上”测定 的绝对时间间隔进行比较，归一化的参数的使用确保了可以将时间间隔的 比率与“整体上”测定的归一化参数进行比较，从而提供关于胚胎发育的 其它信息。

排除标准

可以对胚胎群体应用一个或多个排除标准以从群体中排除具有低着 床成功概率的胚胎，即离群胚胎。这可以是符合许多正向选择标准但是仅 在一个或两个选择标准中显示异常表现的胚胎。排除标准的示例是胚泡的 收缩次数、空泡形成程度和不均匀的致密化。然而，也可以将排除标准应 用于胚胎形态学参数。人们早已知道缓慢发育的胚胎是质量较差的指示， 这反映在t2值很高(>31.8小时)，但是从1个卵裂球直接卵裂成3个卵裂 球也可能是与低着床率相关的较差质量胚胎的指示，虽然存在快速的t3。

指出群体中具有低着床概率的一组胚胎的特定排除标准并不暗示着 所述群体中的剩余胚胎具有高着床概率。排除标准仅指示较差质量的胚 胎。因此，在本发明的一个实施方案中，将所述一个或多个胚泡质量标准 与一个或多个排除标准组合。

监测

定期监测胚胎以获得相关信息，优选地每小时至少一次，例如每小时 至少两次，例如每小时至少三次。优选地在胚胎位于用于培养胚胎的孵化 器中时进行监测。这优选地通过获取胚胎的图像来进行，例如下文关于缩 时方法所讨论。

选择标准的测定可以例如通过目视检查胚胎的图像和/或通过自动化 方法进行，所述自动化方法是例如在2006年10月16日提交的名称为 “Determination of a change in a cell population”的未决PCT申请中详细描 述的自动化方法。此外，测定选择标准的其它方法可以例如通过使用 FertiMorph软件(ImageHouse Medicall Copenhagen,Denmark)所设想的对 细胞质膜的位置进行测定来进行。所描述的方法可以单独使用或与目视检 查胚胎的图像和/或与如上文所述的自动化方法组合使用。

决策树模型

具体来说，可以将标准按如图12、14和15中所示的分层形式(关于 更多信息还参见实施例1)组合，从而产生决策树模型(或分类树模型)以选 择具有较高着床概率的胚胎。在分类树模型中，使用若干变量以通过使用 连续分割规则将胚胎分成具有不同的相关的着床成功概率的组。可以在一 组给定的限制条件下从一组可能的变量中选择用于分割规则中的最佳变 量对分类树模型进行优化。模型中使用的变量可以例如是基于形态学事件 之间的时间间隔的胚胎形态学参数和相应的归一化的胚胎形态学参数以 及离散变量(例如卵裂球的多核性或均匀性)或这些变量的任何组合。这一 类型的模型可以使用ROC曲线下面积(AUC)来评价。如果没有应用分割， 那么AUC是0.5，并且如果AUC>0.5，那么分割改进了预测能力。

在图12中所描绘的决策树中，将12个胚胎细分成从A到F的6个 类别。如图5中所示，这些类别中的四个(A到D)被进一步细分成两个亚 类(+)或(-)，从而得到总共10个类别。分层决策程序起始于对小组内的所 有胚胎进行形态学筛选以排除那些明显无活力的胚胎(即高度异常、闭锁 (attretic)或明显停滞的胚胎)。放弃那些明显没有活力的胚胎并且不考虑将 其用于移植(类别F)。所述模型中的下一个步骤是排除符合以下三个排除 标准中的任一个的胚胎：i)2细胞期的卵裂球大小不均匀，ii)从1个细胞 突然分裂成3个或更多个细胞，或iii)在4细胞期的多核现象(类别E)。所 述模型中的随后层级遵循基于二元发生时间变量t5、s2和cc2的严格分 层结构。首先，如果t5的值落在最佳范围内，那么将胚胎归类为A或B。 如果t5的值落在最佳范围外(或如果在64小时还没有观察到t5)，那么将 胚胎归类为C或D。

如果s2的值落在最佳范围内，那么取决于t5，将胚胎归类为A或C， 并且类似地，如果s2的值落在最佳范围外，那么取决于t5，将胚胎归类 为B或D。

最后，如果cc2的值处在最佳范围内，那么使用额外的加号(+)对胚 胎进行归类(A+/B+/C+/D+)，并且如果cc2的值处在最佳范围外，那么将 胚胎归类为A、B、C、D。

决策树模型可以使用通过多类AUC评价的受试者工作特征(receiver  operator characteristic,ROC)方法来评价。多类AUC表示模型就着床概率 来说分选胚胎的程度如何。AUC处在0.5与1之间，其中0.5是随机模型 (没有模型的影响)的分选能力，并且更高的AUC指示与随机模型相比更 好的分选。

已经基于来自407个人类胚胎的KID数据构建了决策树模型(参见实 施例1)，并且已经测定了多类AUC。图14和图15中的两个决策树是基 于胚胎质量标准、胚泡质量标准和排除标准。对于图14，多类AUC＝0.68， 而对于图15中的决策树，AUC略低，为0.64。借助于这些决策树模型， 已经将407个胚胎分类为具有递减的着床概率的7个质量类别A-G(图15) 和5个类别A-E(图16)。

来自特定女性的特定胚胎的着床概率取决于许多其它参数。然而，这 个数据集提供了极难得的机会来测试本文所呈现的质量标准和排除标准， 以优化IVF胚胎的分类，例如，对取自单个女性的多个胚胎进行分类(在 质量方面)，以选择一或多个用于移植的最佳胚胎。有可能在来自单个女 性的胚胎中没有胚胎符合所有的最佳质量标准，因为所有胚胎的质量都是 中等的或较差的。然而，必须进行移植，并且因此对胚胎进行分类对于选 择最佳胚胎来说是重要的。因此，最高的可能AUC自然是优选的，但是 在胚胎选择领域内，相比于随机模型的任何分选改进都是好的，并且可以 被认为改进了优良胚胎的选择。

逻辑回归模型

还可以将标准按逻辑回归模型的形式组合，所述逻辑回归模型预测胚 胎的着床成功优势(odds)(参见实施例2)。所述模型可以受离散变量和 连续变量两者影响。所使用的连续变量应当对优势具有单调的作用(优势 要么随变量值的增加而增加，要么随变量值的降低而降低)。

与对移动的测量组合

还可以将以上讨论的质量标准与对胚胎移动的测定组合，所述测量例 如i)测定在细胞卵裂期期间细胞或细胞器移动的程度和/或空间分布；和/ 或ii)测定在卵裂间期期间细胞或细胞器移动的程度和/或空间分布，从而 获得胚胎质量的量度。

透明带内没有移动的体积(或类似地，胚胎2D投影图像中保持静止 的面积)是胚胎内的“死”区的指示。这些不动的“死”区越多并且越大， 胚胎成功发育的概率就越低。在一系列的缩时胚胎图像内不存在任何类型 的移动(即既无细胞移动也无细胞器移动)的大面积指示低存活力。即使在 仅对两个或几个连续帧进行比较时，细胞器移动通常也应当可在整个胚胎 中检测到。细胞移动可能更加局部化，特别是在胚胎发育的后期。

细胞位置在细胞卵裂之间通常是相对固定的(即几乎没有细胞移动)， 除了在每次细胞卵裂前后的短时间间隔之外，此时一个细胞卵裂成两个细 胞导致分裂中的细胞以及周围细胞发生短暂但相当大的重排(即显著的细 胞移动)。卵裂之间较少移动是优选的。

在一个实施方案中，为了测定与卵裂期和卵裂间期有关的移动，可以 测定每个卵裂期的长度以及每个卵裂间期的长度。优选地，测定至少两个 卵裂间期中的细胞移动的时段以及至少两个卵裂间期中的细胞移动的程 度。此外，已经发现快速卵裂似乎提高胚胎的质量，其中快速通常意味着 少于2小时。

关于卵裂期和卵裂间期期间的移动，我们还参考了PCT申请WO 2007/144001。

可以使用神经网络或其它定量模式识别算法来评价以上所描述的复 杂细胞运动模式，例如使用不同的数学模型(线性模型、主成分分析模型、 马尔可夫模型(Markov model)等)。

缩时监测

本发明的一个具体用途是评价发育中的胚胎的一系列图像(缩时图 像)。这些缩时图像可以通过差分成像设备来分析(参见例如名称为 “Determination of a change in a cell population”的WO 2007/042044)。得 到的差分图像可用于对在一系列图像中连续帧之间发生的变化的量进行 定量。

本发明可被应用于对差分图像数据进行分析，其中由于细胞移动而使 得细胞边界(即细胞膜)的位置变化，从而引起从差分图像产生的一系列参 数暂时地升高(参见WO 2007/042044)。这些参数包括(但不限于)平均绝对 强度或方差的升高。细胞卵裂和其持续时间以及相关的细胞重排因此可以 通过差分图像中所有像素的标准偏差或WO 2007/042044中所列举的“卵 裂球活动”的任何其它衍生参数的暂时变化(即增加或降低)来检测。然而， 选择标准还可被应用于对缩时图像和与胚胎相关的其它时间分辨的数据 (例如代谢物的排泄或摄取、物理或化学外观的变化、衍射、散射、吸收 等)进行目视观察和分析。

尤其关注细胞卵裂的开始、幅度和持续时间，其可以被定量成衍生参 数值的峰或谷。这些极限值(峰或谷)经常表示细胞卵裂事件。就像峰的大 小一般可以提供另外的信息，每个峰的形状也提供了另外的信息。峰还可 以表示卵裂球的突然瓦解和同时发生的细胞死亡。然而，有可能通过在事 件之前和之后的峰形状和基值的变化来区分细胞卵裂事件与细胞死亡事 件。大多数参数的基线通常不受细胞卵裂的影响，而细胞溶解经常伴有基 线值的显著变化(大多数参数在发生溶解后降低)。

总之，本发明证实了在临床环境中对胚胎发育进行常规的缩时监测 (即在不受干扰的受控孵育环境中进行自动的图像获取)提供关于在着床 胚胎与非着床胚胎之间存在差异的发育参数的新颖信息。

胚胎

在一些情况下，术语“胚胎”用于描述在子宫中着床后直到受精后第 8周(在此阶段受精的卵母细胞变成胎儿)的受精的卵母细胞。根据该定义， 受精的卵母细胞在着床发生前通常被称为前期胚胎(pre-embryo)。然而， 在整个本专利申请中，我们将使用术语胚胎的更广定义，其包括前期胚胎 期。其因此涵盖了从卵母细胞受精到桑椹胚、胚泡期孵化和着床的所有发 育阶段。

胚胎是大致球形的并且由被明胶状外壳(被称为透明带的非细胞基质) 包围的一个或多个细胞(卵裂球)构成。透明带执行各种功能直到胚胎孵化 为止，并且是用于胚胎评价的良好标志。透明带是球形和半透明的，并且 应当可以与细胞碎片明显区分。

当通过融合或注射精细胞(精子)使卵母细胞受精时，形成胚胎。传统 上在孵化(即透明带破裂)和随后的着床后也使用该术语。对于人类来说， 受精的卵母细胞在前8周传统上被称为胚胎。此后(即在8周后以及在已 经形成所有主要器官时)，其被称为胎儿。然而，胚胎与胎儿之间的区别 一般并不是界限分明的。

因此，在下文使用术语胚胎表示以下的各个阶段：受精的卵母细胞、 合子、2细胞期、4细胞期、8细胞期、16细胞期、桑椹胚、胚泡、扩张 的胚泡和孵化的胚泡以及其间的所有阶段(例如3细胞期或5细胞期)。

其它测量

最后的分析步骤可以包括比较所进行的观察结果与具有不同质量和 发育能力的胚胎的类似观察结果，以及比较给定胚胎的参数值与对同一胚 胎所作的其它定量测量。这可以包括与例如卵裂球运动性、呼吸率、氨基 酸摄取等在线测量进行比较。卵裂球运动性分析、呼吸率和其它定量参数 的组合数据集有可能改进胚胎选择并且使胚胎学家能够可靠地选择用于 移植的最佳胚胎。

因此，在一个实施方案中，根据本发明的方法可以与其它测量组合， 以评价所讨论的胚胎，并且可以用于选择用于移植给受体的有能力的胚 胎。

所述其它测量可以选自以下组：呼吸率、氨基酸摄取、运动性分析、 卵裂球运动性、形态、卵裂球大小、卵裂球粒化、碎裂、卵裂球颜色、极 体取向、成核作用、纺锤体形成和完整性以及许多其它定性测量。可以如 PCT公开号WO 2004/056265中所述进行呼吸测量。

培养基

在优选实施方案中，在细胞群体的培育期间，例如在细胞群体被放入 培养基中的情况下，进行观察。用于培养细胞群体的方式在所属领域中是 已知的。PCT公开号WO 2004/056265中描述了培养胚胎的示例。

数据载体

本发明进一步涉及一种数据载体，其包括可直接加载在数字处理装置 的存储器中的计算机程序并且包括计算机代码部分，所述计算机代码部分 构成了用于执行如上文所述的本发明方法的方式。

数据载体可以是磁盘或光盘或者呈例如EEPROM或Flash类型的电 子卡的形状，并且被设计成加载到现有的数字处理装置中。

胚胎的选择或鉴别

本发明进一步提供一种选择用于移植的胚胎的方法。该方法必然包括 已经如上文所讨论监测了胚胎以确定细胞卵裂何时已经发生。

选择或鉴别方法可以与如上文所述的其它测量组合，以评价胚胎质 量。胚胎的形态学评价中的重要标准是：(1)胚胎形状，包括卵裂球数目 和碎裂程度；(2)透明带的存在和质量；(3)大小；(4)颜色和质地；(5)对于 与胚胎发育阶段有关的胚胎年龄的了解；和(6)卵裂球膜的完整性。

然后可以通过所属领域技术人员已知的任何合适方法进行移植。

实施例1-基于已知着床数据的数据分析

这项分析是基于在不同条件(患者特征、临床实践以及规则和条例)下 孵育的407个胚胎的已知着床数据(KID)。KID胚胎均是具有已知着床情 况的经过移植的胚胎。在移植多个胚胎的情况下，只使用着床完全失败或 完全成功。丢弃着床情况为着床的胚胎少于移植的胚胎的所有多胎移植以 确保具体胚胎的着床成功。如果经移植的胚胎能够成功着床，那么着床成 功取值1，而如果不能成功着床，那么着床成功取值0。对于不同变量来 说，用于计算目标组和非目标组的预期值(成功概率)的胚胎数目(N)是不 同的。

单个变量

针对单个连续变量(例如t5)将数据分成四分位数，并且计算每个四分 位数的预期值(在一次试验中获得成功的概率)。从这些四分位数，通过具 有最高预期值的四分位数或者通过两个或三个具有类似概率的相邻四分 位数形成新的组(目标组)(参见图13a和图13b中的实施例)。使用费歇尔 精确检验(Fisher’s exact test)来检验以下假设：目标组内胚胎的着床概率 (KID数据的预期值)与该组外的胚胎的着床概率是相等的。如果p值<0.1， 那么该假设被拒绝，指示存在组间差异，否则将被视为不显著。

两个具有相关概率(p_i和p_j)的组的优势比(odds ratio,OR)计算如下

${\mathrm{OR}}_{\mathrm{ij}}=\frac{\frac{p_i}{1-p_i}}{\frac{p_j}{1-p_j}}$

第一组的优势是并且第二组的优势是可以使用提供p 值的费歇尔检验来检验两组的着床优势比。优势比提供处于目标组内的 “优势”。对于特定参数，目标组的高优势比较佳。对于H0来说，优势 比是1。

表1：该分析中使用的连续胚泡变量

变量 描述 tIC 从受精到初始致密化的时间 tM 从受精到桑椹胚的时间 tIDT 从受精到滋养外胚层细胞的初始分化的时间 tERB 从受精到早期胚泡的时间 tBl 从受精到胚泡的时间 tEB 从受精到胚泡扩张的时间 tCPS(1) 从受精到第一次收缩的时间 tCPS(2) 从受精到第二次收缩的时间 tCPS(3) 从受精到第三次收缩的时间 tHB 从受精到孵化的时间 tFH 从受精到完全孵化的时间

表2：该分析中使用的离散胚泡变量

变量 描述 六十小时细胞 60小时后的卵裂球数目 M前的细胞 桑椹胚前的细胞数目(取值4、5、6、7、8和9+) CPS_no 胚泡收缩次数 VC_grade 空泡形成(取值0、1、2、3)，0表示没有记录到空泡形成 UC 不均匀的致密化(取值真、假)

表3：对于目标组的时间变量的四分位数分析，涉及目标组以内和以 外的四分位数、目标组时间间隔、目标组的优势比(以内比以外)和费歇尔 检验的p值。

对于几乎所有的时间变量来说，第一个四分位数均具有最高的着床 率，表明胚胎快速发育到胚泡期指示高着床率。只有在桑椹胚的情况下这 才是不同的，因为就tM来说，第一个四分位数与第二个四分位数之间没 有显著差异。就tBl来说并且还就H0假设的最显著拒绝来说，OR是最 高的。这可能与以下事实有关：这是重要的形态学特征，但是其还可反映 容易从缩时图像确定该阶段。

表4：对于目标组的质量变量的四分位数分析，涉及目标组以内和以 外的胚胎数目、目标组的优势比(以内比以外)和费歇尔检验的p值。括号 内的值是不显著的(ns)。

从表4可以看出，收缩次数不应超过2并且空泡形成程度不应超过1。 不均匀的致密化也是显著的。这三个标准适用于排除具有相对低的着床率 的胚泡(OR>3)，即它们是合适的排除标准。

表5：对于目标组的时间段变量的四分位数分析，涉及目标组以内和 以外的四分位数、目标组时间间隔、目标组的优势比(以内比以外)和费歇 尔检验的p值。

在8细胞期与桑椹胚期之间的时间段较短的情况下，存在略微显著较 低的着床率。这可能与培养基改变有关。从胚泡到第二次收缩(如果这发 生的话)的时间需要较长。另外前两次收缩之间的间隔应当较长。这支持 较少和较晚的收缩可以用作质量指标。

表6：对于目标组的归一化/相对的时间段变量的四分位数分析，涉 及目标组以内和以外的四分位数、目标组时间间隔、目标组的优势比(以 内比以外)和费歇尔检验的p值。

包括来自胚胎发育的早期部分的变量和胚泡变量两者的变量的相对 变量都倾向于在具有高相对变量值的组中的概率较高。仅在胚泡期之间具 有差异的相对变量具有不太明显的指示。然而，请注意这些变量仅基于来 自407个KID胚胎的数据。

实施例2-逻辑回归模型

逻辑回归通常用于建立描述连续变量(例如tBl)和离散变量(例如UC) 对二项结果(例如KID值(着床/无着床))的作用的模型。该模型将对数转换 的优势(p_i/(1-p_i))拟合成连续变量和离散变量的线性组合Xj。

其中p_i是观察结果的概率i，X_i,j是第i个观察结果的第j个变量的值， β₀是截距参数，β_j是斜率参数，并且ε是随机误差。该模型是乘法型和 指数型的。β_j的负值意味着随着连续变量值的增加，该变量对模型输出 的作用降低。对于离散变量来说，不同的变量值具有不同的相关β_j，并 且如果该变量取这个值，那么Xj的值为1。

本文呈现了描述所述数据的逻辑回归模型的两个示例。第一个模型只 包括可以在胚泡期观察到的变量，并且第二个模型还包括更早期的特征。

使用赤池信息准则(Akaike information criterion，AIC)来评价模型的相 对拟合优度和选择模型中包括哪些变量。AIC是模型精确度和模型复杂度 两者的量度。如果在模型中包括变量的作用时AIC增加，那么就不包括 这个作用。

AIC＝2k-2ln(L)

其中k是估计参数的数目并且L是模型似然性。

表7：逻辑回归模型A：使用因变量KID值和连续自变量tBl和离散 自变量CPS_no的逻辑回归模型的具有标准误差和显著性的估计参数。还 显示了排除有疑问的变量的简化模型的赤池信息量准则(AIC)。该模型的 多类AUC是0.63。

LR模型A具有tBl(显著的)、收缩次数(三次收缩与无收缩显著不同) 和不均匀的致密化(几乎显著的)的作用。还包括来自更早期阶段的变量形 成了LR模型B，其具有tBl(显著的)、收缩次数(第2次和第3次收缩与 无收缩显著不同，并且在4细胞期的多核性存在稍微显著的作用)和不均 匀的致密化的作用。

表8：逻辑回归模型B：使用因变量KID值和连续自变量tBl和离散 自变量CPS_no和MN4_full(4细胞期的多核性)的逻辑回归模型的具有标 准误差和显著性的估计参数。还显示了排除有疑问的变量的简化模型的赤 池信息量准则(AIC)。模型的多类AUC是0.65。

实施例3-非整倍体胚胎的预测

与实施例1一样，这项分析是基于在不同条件(患者特征、临床实践 以及规则和条例)下孵育的407个胚胎的已知着床数据(KID)。在这个实施 例中选择了351个胚胎，因为它们具有针对tBl和tBE的注释。KID胚胎 均是具有已知着床情况的移植胚胎。在移植多个胚胎的情况下，只使用着 床完全失败或完全成功。丢弃着床情况为着床的胚胎少于移植的胚胎的所 有多胎移植以确保具体胚胎的着床成功。已经将着床成功(方块)和着床失 败(三角形)标绘于具有tEB沿第一轴和tB沿第二轴(其中tBl被称为“tB”) 的图16中。

图16中的图形已经被tEB＝120.3小时处的垂直线和tBl＝96.5小时 处的水平线分成3个部分“1”、“2”和“3”。因此，

·在部分“1”中，tEB处于80小时到120.3小时的范围内，并且tBl 处于70小时到96.5小时的范围内。

·在部分“2”中，tEB处于80小时到120.3小时的范围内，并且tBl 处于96.5小时到140小时的范围内。

·在部分“3”中，tEB处于120.3小时到150小时的范围内，并且tBl 处于70小时到140小时的范围内。

这3个部分的胚胎的结果非常不同。落在部分“1”内的胚胎的着床 比率是0.59，落在部分“2”内的胚胎的着床比率是0.37，而落在部分“3” 内的胚胎的着床比率是0.14。这也可在图16中看出，在部分“3”中三角 形占优势，而在部分“1”中正方形占优势。所观察到的这些着床比率的 大差异可能是由非整倍性的不同出现率引起的，其中部分“1”中的最佳 着床类别具有低非整倍性出现率，部分“3”中的最差着床类别具有高程 度的非整倍性，而部分“2”中的中等类别则位于这两者之间。因此，tEB 和tBl是胚泡质量标准的极好候选物。而且tEB和tBl还可用于区分整倍 体胚胎与非整倍体胚胎，并且因此通过测量胚胎形态学参数，可以提供用 于区分非整倍体胚胎与整倍体胚胎的无创性方法。

参考文献

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本发明的其它细节

现在将参考以下项目来进一步详细地描述本发明：

1.一种用于确定胚胎质量的方法，其包括将所述胚胎监测一段时间， 和测定所述胚胎的一个或多个质量标准，以及基于所述一个或多个质量标 准来确定所述胚胎质量。

2.一种用于确定胚胎质量的方法，其包括将所述胚胎监测一段时间， 所述一段时间包括胚胎从初始致密化或桑椹胚转化成胚泡，和测定所述胚 胎的一个或多个胚泡质量标准，以及基于所述一个或多个胚泡质量标准来 确定所述胚胎质量。

3.根据前述项目中任一项的方法，其中所述胚胎质量是从多个所述质 量标准和/或所述胚泡质量标准确定的，例如通过组合多个所述质量标准 和/或所述胚泡质量标准来确定。

4.根据前述项目中任一项的方法，其中所述胚泡质量标准是与从5 卵裂球胚胎到胚泡期的阶段有关的标准。

5.根据前述项目中任一项的方法，其中所述胚泡质量标准是与其中只 转录卵裂球自身的DNA的阶段有关的标准。

6.根据前述项目中任一项的方法，其中监测胚胎群体。

7.根据前述项目中任一项的方法，其中所述胚胎质量是与着床成功有 关的质量。

8.根据前述项目中任一项的方法，其中将所述一个或多个胚泡质量标 准与一个或多个排除标准组合用于淘汰和/或排除具有低着床成功概率的 胚胎。

9.根据前述项目中任一项的方法，其中所述胚泡期选自由以下组成的 组：

初始致密化(IC)、桑椹胚(M)、滋养外胚层细胞的初始分化(IDT)、早期 胚泡(ERB)、胚泡(Bl)、胚泡扩张(EB)、第一次收缩(CPS(1))、第二次收缩 (CPS(2))、第三次收缩(CPS(3))、第四次收缩(CPS(4))、第五次收缩(CPS(5))、 第六次收缩(CPS(6))、第七次收缩(CPS(7))、孵化(HB)和完全孵化(FH)。

10.根据前述项目中任一项的方法，其中所述一段时间包括从受精 到转化成胚泡的时间，并且其中相对于从5-8卵裂球胚胎缓慢发育到胚泡 期，从受精快速发育成5-8卵裂球胚胎是高胚胎质量的指标。

11.根据前述项目中任一项的方法，其中所述一段时间包括从受精 到胚泡期的时间，并且其中相对于所述胚胎在转录卵裂球自身DNA时的 缓慢发育，所述胚胎在翻译母系遗传的mRNA时的快速发育是高胚胎质 量的指标。

12.根据前述项目中任一项的方法，其中所述一段时间包括从受精 到胚泡期的时间，其中质量标准是测定：1)其中只翻译母系遗传的mRNA 的第一时间段的持续时间、和2)其中只转录卵裂球自身DNA的第二时间 段的持续时间。

13.根据前述项目中任一项的方法，其中所述一段时间包括从受精 到胚泡期的时间，其中质量标准是测定：1)从受精到5卵裂球胚胎的第一 时间段的持续时间、和2)从所述5卵裂球胚胎到所述胚泡期的第二时间 段的持续时间。

14.根据前述项目中任一项的方法，其中所述一段时间包括从受精 到胚泡期的时间，其中质量标准是测定：1)从受精到在母系遗传的mRNA 在卵裂球中的翻译完成的第一时间段的持续时间、和2)从卵裂球自身 DNA的转录起始到所述胚泡期的第二时间段的持续时间。

15.根据前述项目12到14中任一项的方法，其中胚泡质量标准是 所述第一时间段与所述第二时间段的比率。

16.根据项目15的方法，其中如果所述第二时间段除以所述第一时 间段的比率大于预定值，那么所述比率是高胚胎质量的指标。

17.根据前述项目12到16中任一项的方法，其中相对于所述第二 时间段的短持续时间，所述第一时间段的长持续时间是高胚胎质量的指 标。

18.根据前述项目12到17中任一项的方法，其中所述第一时间段 被定义为t5并且所述第二时间段被定义为tEB。

19.根据项目18的方法，其中所述第一时间段小于所述第二时间段 是高胚胎质量的指标。

20.根据前述项目18到19中任一项的方法，其中如果所述比率大 于或等于1.08，那么所述胚泡质量标准是高胚胎质量的指标。

21.根据前述项目18到19中任一项的方法，其中如果所述比率大 于1，或大于1.01，或大于1.02，或大于1.02，或大于1.03，或大于1.04， 或大于1.05，或大于1.06，或大于1.07，或大于1.08，或大于1.09，或大 于1.10，或大于1.11，或大于1.12，或大于1.13，或大于1.14，或大于 1.15，或大于1.16，那么所述胚泡质量标准是高胚胎质量的指标。

22.根据前述项目中任一项的方法，其中所述一段时间包括从受精 到转化成胚泡的时间，并且其中从受精快速发育到胚泡期以及从5-8卵裂 球胚胎缓慢发育到胚泡期是高胚胎质量的指标。

23.根据前述项目中任一项的方法，其中所述一段时间包括从受精 到胚泡期的时间，其中质量标准是测定：1)从受精到胚泡的第一时间段的 持续时间，和2)从卵裂球自身DNA的转录起始到所述胚泡期的第二时间 段的持续时间。

24.根据前述项目22到23中任一项的方法，其中质量标准是所述 第一时间段与所述第二时间段的比率。

25.根据前述项目中任一项的方法，其中胚泡质量标准是对tB_i-t_i的测定，其中tB_i选自{tM、tBl、tEB}的组，并且t_i选自{t5、t6、t7和t8} 的组。

26.根据项目25的方法，其中如果tM-t8大于或等于27.3小时， 那么所述胚泡质量标准是高胚胎质量的指标。

27.根据项目25的方法，其中如果tM-t8大于24小时，或大于 24.5小时，或大于24.5小时，或大于25小时，或大于25.5小时，或大于 26小时，或大于26.5小时，或大于27小时，或大于27.3小时，或大于 27.6小时，或大于28小时，或大于28.5小时，或大于29小时，或大于 29.5小时，或大于30小时，那么所述胚泡质量标准是高胚胎质量的指标。

28.根据前述项目中任一项的方法，其中胚泡质量标准是对(tB_i-t_i) /t_i的测定，其中tB_i选自{tM、tBl、tEB}的组，并且t_i选自{t5、t6、t7和 t8}的组。

29.根据项目28的方法，其中如果(tB_i-t_i)/t_i大于预定值，那么所 述胚泡质量标准是高胚胎质量的指标。

30.根据项目28的方法，其中如果(tEB-t5)/t5大于或等于1.08， 那么所述胚泡质量标准是高胚胎质量的指标。

31.根据前述项目中任一项的方法，其中胚泡质量标准是对(tB_i-t_i) /tB_i的测定，其中tB_i选自{tM、tBl、tEB}的组，并且t_i选自{t5、t6、t7 和t8}的组。

32.根据项目31的方法，其中如果(tB_i-t_i)/tB_i大于预定值，那么 所述胚泡质量标准是高胚胎质量的指标。

33.根据项目31的方法，其中如果(tEB-t5)/tEB大于或等于0.52， 那么所述胚泡质量标准是高胚胎质量的指标。

34.根据项目31的方法，其中如果(tEB-t5)/tEB大于0.45，或大 于0.46，或大于0.47，或大于0.48，或大于0.49，或大于0.5，或大于0.51， 或大于0.52，或大于0.53，或大于0.54，或大于0.55，或大于0.56，或大 于0.57，或大于0.58，或大于0.59，或大于0.6，那么所述胚泡质量标准 是高胚胎质量的指标。

35.根据前述项目中任一项的方法，其中胚泡质量标准是对从受精 到胚泡期的时间的测定。

36.根据前述项目中任一项的方法，其中胚泡质量标准是对一个或 多个以下胚泡形态学参数的测定：

tIC＝从受精到初始致密化的时间，

tM＝从受精到桑椹胚的时间，

tIDT＝从受精到滋养外胚层细胞的初始分化的时间，

tERB＝从受精到早期胚泡/成腔作用开始的时间，

tBl＝从受精到胚泡的时间，

tEB＝从受精到胚泡扩张的时间，

tCPS(1)＝从受精到第一次收缩的时间，

tCPS(2)＝从受精到第二次收缩的时间，

tCPS(3)＝从受精到第三次收缩的时间，

tHB＝从受精到孵化的时间，和

tFH＝从受精到完全孵化的时间。

37.根据前述项目中任一项的方法，其中胚泡质量标准是对tIC的 测定，并且其中如果tIC是72.4小时到79小时，那么所述胚泡质量标准 是高胚胎质量的指标。

38.根据前述项目中任一项的方法，其中胚泡质量标准是对tIC的 测定，并且其中如果tIC大于70小时，或大于70.5小时，或大于71小 时，或大于71.5小时，或大于72小时，或大于72.2小时，或大于72.4 小时，或大于72.6小时，或大于72.8小时，或大于73小时，或大于73.5 小时，或大于74小时，或大于74.5小时，或大于75小时，那么所述胚 泡质量标准是高胚胎质量的指标。

39.根据前述项目中任一项的方法，其中胚泡质量标准是对tIC的 测定，并且其中如果tIC小于81小时，或小于80.5小时，或小于80小 时，或小于79.5小时，或小于79小时，或小于78.5小时，或小于78小 时，或小于77.5小时，或小于77小时，那么所述胚泡质量标准是高胚胎 质量的指标。

40.根据前述项目中任一项的方法，其中胚泡质量标准是对tM的 测定，并且其中如果tM小于85.6小时，那么所述胚泡质量标准是高胚胎 质量的指标。

41.根据前述项目中任一项的方法，其中胚泡质量标准是对tM的 测定，并且其中如果tM小于88小时，或小于87.5，或小于87小时，或 小于86.5小时，或小于86小时，或小于85.8小时，或小于85.6小时， 或小于85.4小时，或小于85.2小时，或小于85小时，或小于84.5小时， 或小于84小时，或小于83.5小时，或小于83小时，那么所述胚泡质量 标准是高胚胎质量的指标。

42.根据前述项目中任一项的方法，其中胚泡质量标准是对tIDT 的测定，并且其中如果tIDT小于88.9小时，那么所述胚泡质量标准是高 胚胎质量的指标。

43.根据前述项目中任一项的方法，其中胚泡质量标准是对tIDT 的测定，并且其中如果tIDT小于91小时，或小于90.5小时，或小于90 小时，或小于89.5小时，或小于89小时，或小于88.9小时，或小于88.8 小时，或小于88.5小时，或小于88小时，或小于87.5小时，或小于87 小时，那么所述胚泡质量标准是高胚胎质量的指标。

44.根据前述项目中任一项的方法，其中胚泡质量标准是对tBl的 测定，并且其中如果tBl小于96.3小时，那么所述胚泡质量标准是高胚胎 质量的指标。

45.根据前述项目中任一项的方法，其中胚泡质量标准是对tBl的 测定，并且其中如果tBl小于99小时，或小于98.5小时，或小于98小时， 或小于97.5小时，或小于97小时，或小于96.7小时，或小于96.5小时， 或小于96.3小时，或小于96小时，或小于95.5小时，或小于95小时， 或小于94.5小时，或小于94小时，或小于93.5小时，或小于93小时， 那么所述胚泡质量标准是高胚胎质量的指标。

46.根据前述项目中任一项的方法，其中胚泡质量标准是对tEB的 测定，并且其中如果tEB小于101.3小时，那么所述胚泡质量标准是高胚 胎质量的指标。

47.根据前述项目中任一项的方法，其中胚泡质量标准是对tEB的 测定，并且其中如果tEB小于104小时，或小于103小时，或小于102.5 小时，或小于102小时，或小于101.5小时，或小于101.3小时，或小于 101小时，或小于100.5小时，或小于100小时，或小于99.5小时，或小 于99小时，或小于98.5小时，或小于98小时，那么所述胚泡质量标准 是高胚胎质量的指标。

48.根据前述项目中任一项的方法，其中胚泡质量标准是对tEB的 测定，并且其中如果tEB小于130小时，或小于129小时，或小于128 小时，或小于127小时，或小于126小时，或小于125小时，或小于124.5 小时，或小于124小时，或小于123.5小时，或小于123小时，或小于122.5 小时，或小于122小时，或小于121.5小时，或小于121小时，或小于120.5 小时，或小于120.3小时，或小于120.1小时，或小于120小时，或小于 119.5小时，或小于119小时，或小于118.5小时，或小于118小时，或 小于117.5小时，或小于117小时，或小于116.5小时，或小于116小时， 或小于115.5小时，或小于115小时，或小于114.5小时，或小于114小 时，或小于113.5小时，或小于113小时，或小于112.5小时，或小于112 小时，或小于111.5小时，或小于111小时，或小于110.5小时，或小于 110小时，或小于109.5小时，或小于109小时，或小于108.5小时，或 小于108小时，或小于107.5小时，或小于107小时，或小于106.5小时， 或小于106小时，或小于105.5小时，或小于105小时，那么所述胚泡质 量标准是高胚胎质量的指标。

49.根据前述项目中任一项的方法，其中胚泡质量标准是对tEB和 tBl的测定。

50.根据前述项目中任一项的方法，其中胚泡质量标准是对tEB和 tBl的测定，并且其中如果tEB小于120.3小时并且tBl小于96.5小时， 那么所述胚泡质量标准是高胚胎质量的指标。

51.根据前述项目中任一项的方法，其中胚泡质量标准是对tEB和 tBl的测定，并且其中如果

tEB小于130小时，或小于129小时，或小于128小时，或小于127小 时，或小于126小时，或小于125小时，或小于124.5小时，或小于124 小时，或小于123.5小时，或小于123小时，或小于122.5小时，或小于 122小时，或小于121.5小时，或小于121小时，或小于120.5小时，或 小于120.3小时，或小于120.1小时，或小于120小时，或小于119.5小 时，或小于119小时，或小于118.5小时，或小于118小时，或小于117.5 小时，或小于117小时，或小于116.5小时，或小于116小时，或小于115.5 小时，或小于115小时，或小于114.5小时，或小于114小时，或小于113.5 小时，或小于113小时，或小于112.5小时，或小于112小时，或小于111.5 小时，或小于111小时，或小于110.5小时，或小于110小时，或小于109.5 小时，或小于109小时，或小于108.5小时，或小于108小时，或小于107.5 小时，或小于107小时，或小于106.5小时，或小于106小时，或小于105.5 小时，或小于105小时，或小于104小时，或小于103小时，或小于102.5 小时，或小于102小时，或小于101.5小时，或小于101.3小时，或小于 101小时，或小于100.5小时，或小于100小时，或小于99.5小时，或小 于99小时，或小于98.5小时，或小于98小时，并且

tBl小于99小时，或小于98.5小时，或小于98小时，或小于97.5小时， 或小于97小时，或小于96.7小时，或小于96.5小时，或小于96.3小时， 或小于96小时，或小于95.5小时，或小于95小时，或小于94.5小时， 或小于94小时，或小于93.5小时，或小于93小时，那么所述胚泡质量 标准是高胚胎质量的指标。

52.根据前述项目中任一项的方法，其中胚泡质量标准是对tCPS(1) 的测定，并且其中如果tCPS(1)小于104小时，那么所述胚泡质量标准是 高胚胎质量的指标。

53.根据前述项目中任一项的方法，其中胚泡质量标准是对tCPS(1) 的测定，并且其中如果tCPS(1)小于107小时，或小于106小时，或小于 105.5小时，或小于105小时，或小于104.5小时，或小于104小时，或 小于103.5小时，或小于103小时，或小于102.5小时，或小于102小时， 或小于101小时，那么所述胚泡质量标准是高胚胎质量的指标。

54.根据前述项目中任一项的方法，其中胚泡质量标准是对tHB的 测定，并且其中如果tHB小于109.5小时，那么所述胚泡质量标准是高胚 胎质量的指标。

55.根据前述项目中任一项的方法，其中胚泡质量标准是对tHB的 测定，并且其中如果tHB小于113小时，或小于112小时，或小于111.5 小时，或小于111小时，或小于110.5小时，或小于110小时，或小于109.5 小时，或小于109小时，或小于108.5小时，或小于108小时，或小于107.5 小时，或小于107小时，或小于106.5小时，或小于106小时，那么所述 胚泡质量标准是高胚胎质量的指标。

56.根据前述项目中任一项的方法，其中胚泡质量标准是对一个或 多个以下胚泡形态学参数的测定：

tBl-tM，

tEB-tBl，

tHE-tEB，

tEB-tM

tBl-tCPS(1)，

tBl-tCPS(2)，

tEB-tCPS(1)，

tEB-tCPS(2)，

tCPS(2)-tCPS(1)，

tCPS(3)-tCPS(2)。

57.根据前述项目中任一项的方法，其中胚泡质量标准是对tBl- tCPS(2)的测定，并且其中如果tBl-tCPS(2)大于或等于10.4小时，那么所 述胚泡质量标准是高胚胎质量的指标。

58.根据前述项目中任一项的方法，其中胚泡质量标准是对tBl- tCPS(2)的测定，并且其中如果tBl-tCPS(2)大于8小时，或大于8.5小时， 或大于9小时，或大于9.5小时，或大于10小时，或大于10.2小时，或 大于10.4小时，或大于10.6小时，或大于10.8小时，或大于11小时， 或大于11.5小时，或大于12小时，或大于12.5小时，或大于13小时， 那么所述胚泡质量标准是高胚胎质量的指标。

59.根据前述项目中任一项的方法，其中胚泡质量标准是对tEB- tCPS(1)的测定，并且其中如果tEB-tCPS(1)大于-3.3小时并且小于2.2小 时，那么所述胚泡质量标准是高胚胎质量的指标。

60.根据前述项目中任一项的方法，其中胚泡质量标准是tEB- tCPS(1)的测定值，并且其中如果tEB-tCPS(1)大于-5小时，或大于-4.5 小时，或大于-4小时，或大于-3.5小时，或大于-3.3小时，或大于-3.1小 时，或大于-3小时，或大于-2.5小时，或大于-2小时，或大于-1.5小时， 或大于-1小时，那么所述胚泡质量标准是高胚胎质量的指标。

61.根据前述项目中任一项的方法，其中胚泡质量标准是对tEB- tCPS(1)的测定，并且其中如果tEB-tCPS(1)小于4小时，或小于3.5小时， 或小于3小时，或小于2.8小时，或小于2.5小时，或小于2.2小时，或 小于2小时，或小于1.5小时，或小于1小时，那么所述胚泡质量标准是 高胚胎质量的指标。

62.根据前述项目中任一项的方法，其中胚泡质量标准是对tCPS(2) -tCPS(1)的测定，并且其中如果tCPS(2)-tCPS(1)大于或等于7.76小时， 那么所述胚泡质量标准是高胚胎质量的指标。

63.根据前述项目中任一项的方法，其中胚泡质量标准是对tCPS(2) -tCPS(1)的测定，并且其中如果tCPS(2)-tCPS(1)大于5小时，或大于6 小时，或大于6.5小时，或大于7小时，或大于7.3小时，或大于7.6小 时，或大于7.8小时，或大于8小时，或大于8.2小时，或大于8.5小时， 或大于9小时，或大于9.5小时，或大于10小时，那么所述胚泡质量标 准是高胚胎质量的指标。

64.根据前述项目中任一项的方法，其中胚泡质量标准选自归一化 的胚泡形态学参数的组。

65.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准选自与从5或8 卵裂球胚胎到转化成胚泡的阶段有关的归一化的胚泡形态学参数的组。

66.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准是基于两个时间 间隔的比率，所述时间间隔中的每一个都被测定为胚胎发育中的两个形态 学和/或动力学事件之间的时间段的持续时间。

67.根据项目66的方法，其中所述质量标准是归一化的胚胎形态学 参数。

68.根据前述项目中任一项的方法，其中胚泡质量标准是对所述胚 泡的绝对或相对2D和/或3D扩张的测定。

69.根据前述项目中任一项的方法，其中胚泡质量标准是对所述胚 胎在扩张开始时的直径和/或体积的测定。

70.根据前述项目中任一项的方法，其中胚泡质量标准是对所述胚 泡在孵化前的最大直径和/或最大体积的测定。

71.根据前述项目中任一项的方法，其中排除标准是对所述胚泡的 收缩次数CPS_no的测定，并且其中超过2的CPS_no是低胚胎质量的指 标。

72.根据前述项目中任一项的方法，其中排除标准是对所述胚泡的 空泡形成程度VC_grade的测定，并且其中超过1的VC_grade是低胚胎 质量的指标。

73.根据前述项目中任一项的方法，其中排除标准是对不均匀致密 化的测定，并且其中不均匀致密化是低胚胎质量的指标。

74.根据前述项目中任一项的方法，其中测定卵裂成5卵裂球胚胎 所用的时间。

75.根据前述项目中任一项的方法，其中测定卵裂成8卵裂球胚胎 所用的时间。

76.根据前述项目中任一项的方法，其中卵裂成2卵裂球胚胎、3 卵裂球胚胎、4卵裂球胚胎、5卵裂球胚胎、6卵裂球胚胎、7卵裂球胚胎 和/或8卵裂球胚胎所用的时间。

77.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准是对卵裂成2卵 裂球胚胎、3卵裂球胚胎、4卵裂球胚胎、5卵裂球胚胎、6卵裂球胚胎、 7卵裂球胚胎和/或8卵裂球胚胎的时间的测定。

78.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准选自归一化的胚 胎形态学参数的组。

79.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准选自与从2卵裂 球胚胎到8卵裂球胚胎的阶段有关的归一化的胚胎形态学参数的组。

80.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准是基于选自t2、 t3、t4、t5、t6、t7、t8和t9的组的两个、三个、四个、五个或更多个参 数的归一化的胚胎形态学参数。

81.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准是基于选自t2、 t3、t4、t5、t6、t7、t8和t9的组的四个参数的归一化的胚胎形态学参数。

82.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准是基于两个时间 间隔的比率，所述时间间隔中的每一个都被测定为胚胎发育中的两个形态 学事件之间的时间段的持续时间。

83.根据项目66的方法，其中所述质量标准是归一化的胚胎形态学 参数。

84.根据前述项目66到67中任一项的方法，其中所述形态学事件 选自受精、卵裂球卵裂起始和卵裂球卵裂完成的组。

85.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准是的 的测定，其中CCi是一个细胞周期的持 续时间。

86.根据项目85的方法，其中低CC_归一化值指示高胚胎质量和/或高 CC_归一化值指示差胚胎质量。

87.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准是对 的测定，其中Si是分裂同步时间。

88.根据项目87的方法，其中低S_归一化值指示高胚胎质量和/或高S _归一化值指示差胚胎质量。

89.根据前述项目56到84中任一项的方法，其中所述归一化的胚 胎形态学参数选自以下组

cc2/cc2_3＝(t3-t2)/(t5-t2)，

cc3/cc2_3＝(t5-t3)/(t5-t2)，

cc3/t5＝1-t3/t5，

s2/cc2＝(t4-t3)/(t3-t2)，

s3/cc3＝(t8-t5)/(t5-t3)，和

cc2/cc3＝(t3-t2)/(t5-t3)。

90.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准是对cc2/cc2_3＝ (t3-t2)/(t5-t2)的测定。

91.根据项目90的方法，其中如果cc2/cc2_3＝(t3-t2)/(t5-t2)是0.38 到0.5，或0.39到0.49，或0.4到0.48或0.41到0.47，那么所述质量标准 是高胚胎质量的指标。

92.根据前述项目中任一项的方法，其中所述质量标准是对t3/t5的 测定。

93.根据项目92的方法，其中如果t3/t5大于0.6，或大于0.62，或 大于0.64，或大于0.66，或大于0.68，或大于0.7，或大于0.72，或大于 0.74，那么所述质量标准是高胚胎质量的指标。

94.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准是对s2/cc2＝ (t4-t3)/(t3-t2)的测定。

95.根据项目94的方法，其中如果s2/cc2＝(t4-t3)/(t3-t2)小于0.03， 或小于0.029，或小于0.028，或小于0.027，或小于0.026，或小于0.025， 或小于0.024，或小于0.023，或小于0.022，或小于0.021，或小于0.02， 那么所述质量标准是高胚胎质量的指标。

96.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准是对s3/cc3＝ (t8-t5)/(t5-t3)的测定。

97.根据项目94的方法，其中如果s3/cc3＝(t8-t5)/(t5-t3)小于0.25， 或小于0.23，或小于0.21，或小于0.2，或小于0.19，或小于0.18，或小 于0.17，或小于0.16，或小于0.15，那么所述质量标准是高胚胎质量的指 标。

98.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准是对cc2/cc3＝ (t3-t2)/(t5-t3)的测定。

99.根据项目98的方法，其中如果cc2/cc3＝(t3-t2)/(t5-t3)是0.7到 0.9，或0.71到0.89，或0.72到0.88，那么所述质量标准是高胚胎质量的 指标。

100.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准是对当所述胚胎 从4卵裂球发育到8卵裂球时细胞分裂的发生时间的无规律程度的测定。

101.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准是对当所述胚胎 从4卵裂球发育到8卵裂球时每个卵裂球的最大卵裂时间的测定。

102.根据项目101的方法，其中如果所述最大卵裂时间小于1.5小 时，那么所述质量标准是高胚胎质量的指标。

103.根据项目101的方法，其中如果所述最大卵裂时间小于2.5小 时，或小于2.3小时，或小于2.1小时，或小于2小时，或小于1.9小时， 或小于1.8小时，或小于1.7小时，或小于1.65小时，或小于1.6小时， 或小于1.55小时，或小于1.5小时，或小于1.45小时，或小于1.4小时， 或小于1.35小时，或小于1.3小时，或小于1.25小时，或小于1.2小时， 或小于1.15小时，或小于1.1小时，或小于1小时，那么所述质量标准是 高胚胎质量的指标。

104.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准是对当所述胚胎 从4卵裂球发育到8卵裂球时每个卵裂球的最大卵裂时间与从4卵裂球到 8卵裂球的总时间段的持续时间的比率max(s3a,s3b,s3c)/s3的测定。

105.根据项目104的方法，其中所述质量标准是归一化的胚胎形态 学参数。

106.根据前述项目104到105中任一项的方法，其中如果所述比率 小于0.5，那么所述质量标准是高胚胎质量的指标。

107.根据前述项目104到105中任一项的方法，其中如果所述比率 小于0.8，或小于0.75，或小于0.7，或小于0.65，或小于0.6，或小于0.58， 或小于0.56，或小于0.54，或小于0.52，或小于0.5，或小于0.48，或小 于0.46，或小于0.44，或小于0.42，或小于0.4，那么所述质量标准是高 胚胎质量的指标。

108.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准是对卵裂成5卵 裂球胚胎所用的时间的测定。

109.根据项目108的方法，其中如果t5小于58小时，或小于57小 时，或小于56.5小时，或小于56.3小时，或小于56.2小时，或小于56.1 小时，或小于56小时，或小于55.9小时，或小于55.8小时，或小于55.7 小时，或小于55.6小时，或小于55.5小时，或小于55小时，或小于54.5 小时，那么所述质量标准是高胚胎质量的指标。

110.根据前述项目108到109中任一项的方法，其中如果t5大于 46小时，或大于47小时，或大于47小时，或大于48小时，或大于48.5 小时，或大于48.7小时，或大于48.9小时，或大于49小时，或大于49.1 小时，或大于49.2小时，或大于49.3小时，或大于49.4小时，或大于49.5 小时，或大于49.6小时，或大于49.7小时，或大于49.8小时，或大于49.9 小时，或大于50小时，或大于51小时，或大于52小时，或大于53小时， 那么所述质量标准是高胚胎质量的指标。

111.根据项目108的方法，其中如果t5是48.7小时到55.6小时， 那么所述质量标准是高胚胎质量比率的指标。

112.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准是对卵裂成8卵 裂球胚胎所用的时间t8的测定。

113.根据项目108的方法，其中如果t8小于60小时，或小于59小 时，或小于58小时，或小于57.8小时，或小于57.6小时，或小于57.4 小时，或小于57.2小时，或小于57小时，或小于56.8小时，或小于56.6 小时，或小于56.4小时，或小于56.2小时，或小于56小时，或小于55 小时，那么所述质量标准是高胚胎质量的指标。

114.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准是对第二个细胞 周期长度cc2的测定。

115.根据项目114的方法，其中如果cc2＝t3-t2小于14小时，或小 于13.5小时，或小于13小时，或小于12.9小时，或小于12.8小时，或 小于12.7小时，或小于12.6小时，或小于12.5小时，或小于12.4小时， 或小于12.3小时，或小于12.1小时，或小于12小时，或小于11.9小时， 或小于11.9小时，或小于11.8小时，或小于11.7小时，或小于11.6小时， 或小于11.5小时，或小于11.4小时，或小于11.3小时，或小于11.2小时， 或小于11.1小时，或小于11小时，或小于10.9小时，或小于10.8小时， 或小于10.7小时，或小于10.6小时，或小于10.5小时，或小于10小时， 那么所述质量标准是高胚胎质量的指标。

116.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准是对cc2b＝t4-t2 的测定。

117.根据项目116的方法，其中如果cc2b＝t4-t2小于14小时，或 小于13.9小时，或小于13.8小时，或小于13.7小时，或小于13.6小时， 或小于13.5小时，或小于13.4小时，或小于13.3小时，或小于13.2小时， 或小于13.1小时，或小于13小时，或小于12.9小时，或小于12.8小时， 或小于12.7小时，或小于12.6小时，或小于12.5小时，或小于12.4小时， 或小于12.3小时，或小于12.1小时，或小于12小时，或小于11.9小时， 或小于11.9小时，或小于11.8小时，或小于11.7小时，或小于11.6小时， 或小于11.5小时，或小于11.4小时，或小于11.3小时，或小于11.2小时， 或小于11.1小时，或小于11小时，或小于10.9小时，或小于10.8小时， 或小于10.7小时，或小于10.6小时，或小于10.5小时，或小于10小时， 那么所述质量标准是高胚胎质量的指标。

118.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准是对第三个细胞 周期长度cc3的测定。

119.根据项目118的方法，其中如果cc3＝t5-t3小于19小时，或小 于18.5小时，或小于18小时，或小于17.9小时，或小于17.8小时，或 小于17.7小时，或小于17.6小时，或小于17.5小时，或小于17.4小时， 或小于17.3小时，或小于17.2小时，或小于17.1小时，或小于17小时， 或小于16.9小时，或小于16.8小时，或小于16.7小时，或小于16.6小时， 或小于16.5小时，或小于16.4小时，或小于16.3小时，或小于16.2小时， 或小于16.1小时，或小于16小时，或小于15.8小时，或小于15.6小时， 或小于15.5小时，或小于15.4小时，或小于15.3小时，或小于15.1小时， 或小于15小时，或小于14.9小时，或小于14.9小时，或小于14.8小时， 或小于14.7小时，或小于14.6小时，或小于14.5小时，或小于14.4小时， 或小于14.3小时，或小于14.2小时，或小于14.1小时，或小于14小时， 或小于13小时，那么所述质量标准是高胚胎质量的指标。

120.根据项目118到119中任一项的方法，其中如果cc3＝t5-t3大 于11小时，或大于11.5小时，或大于12小时，或大于12.2小时，或大 于12.4小时，或大于12.5小时，或大于12.6小时，或大于12.7小时，或 大于12.8小时，或大于12.9小时，或大于13小时，或大于13.1小时， 或大于13.2小时，或大于13.3小时，或大于13.5小时，或大于14小时， 那么所述质量标准是高胚胎质量的指标。

121.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准是对cc2_3＝t5-t2 的测定。

122.根据项目121的方法，其中如果cc2_3＝t5-t2小于32小时，或 小于31小时，或小于30小时，或小于29.8小时，或小于29.6小时，或 小于29.5小时，或小于29.4小时，或小于29.3小时，或小于29.2小时， 或小于29.1小时，或小于29小时，或小于28.9小时，或小于28.8小时， 或小于28.7小时，或小于28.6小时，或小于28.5小时，或小于28.4小时， 或小于28.2小时，或小于28小时，或小于27.5小时，或小于27小时， 或小于26小时，那么所述质量标准是高胚胎质量的指标。

123.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准是对从2卵裂球 胚胎分裂成4卵裂球胚胎的同步时间s2＝t4-t3的测定。

124.根据项目123的方法，其中如果s2＝t4-t3小于3小时，或小于 2.8小时，或小于2.6小时，或小于2.4小时，或小于2.3小时，或小于2.2 小时，或小于2.1小时，或小于2小时，或小于1.8小时，或小于1.6小 时，或小于1.4小时，或小于1.2小时，或小于1小时，或小于0.9小时， 或小于0.8小时，或小于0.7小时，或小于0.6小时，或小于0.5小时，或 小于0.45小时，或小于0.4小时，或小于0.39小时，或小于0.38小时， 或小于0.37小时，或小于0.36小时，或小于0.35小时，或小于0.34小时， 或小于0.33小时，或小于0.32小时，或小于0.31小时，或小于0.3小时， 或小于0.29小时，或小于0.28小时，或小于0.27小时，或小于0.26小时， 或小于0.25小时，或小于0.24小时，或小于0.22小时，或小于0.2小时， 那么所述质量标准是高胚胎质量的指标。

125.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准是对从4卵裂球 胚胎分裂成8卵裂球胚胎的同步时间s3＝t8-t5的测定。

126.根据项目125的方法，其中如果s3＝t8-t3小于5小时，或小于 4.5小时，或小于4.3小时，或小于4.2小时，或小于4.1小时，或小于4 小时，或小于3.9小时，或小于3.8小时，或小于3.7小时，或小于3.6 小时，或小于3.5小时，或小于3.4小时，或小于3.3小时，或小于3.2 小时，或小于3.1小时，或小于3小时，或小于2.9小时，或小于2.8小 时，或小于2.7小时，或小于2.6小时，或小于2.55小时，或小于2.53 小时，或小于2.51小时，或小于2.5小时，或小于2.4小时，或小于2.3 小时，或小于2.2小时，或小于2.1小时，或小于2小时，或小于1.8小 时，或小于1.6小时，或小于1.4小时，或小于1.2小时，或小于1小时， 那么所述质量标准是高胚胎质量的指标。

127.根据前述项目中任一项的方法，其中将所述质量标准与对第二 个细胞周期长度的测定组合。

128.根据前述项目中任一项的方法，其中将所述质量标准与对从2 卵裂球胚胎分裂成4卵裂球胚胎的同步性的测定组合。

129.根据前述项目中任一项的方法，其中所述质量标准是对分裂成 5卵裂球胚胎所用的时间的测定与对第二个细胞周期长度的测定的组合。

130.根据项目9的方法，其中将所述质量标准进一步与对从2卵裂 球胚胎分裂成4卵裂球胚胎的同步性的测定组合。

131.根据前述项目中任一项的方法，其中对胚胎质量的测定进一步 包括i)测定细胞卵裂期期间细胞或细胞器移动的程度和/或空间分布；和/ 或ii)测定卵裂间期期间细胞或细胞器移动的程度和/或空间分布，从而获 得胚胎质量量度。

132.根据前述项目中任一项的方法，其中将所述胚胎监测包括至少 三个细胞周期例如至少四个细胞周期的一段时间。

133.根据前述项目中任一项的方法，其中测定每个卵裂期的长度。

134.根据前述项目中任一项的方法，其中测定每个卵裂间期的长度。

135.根据前述项目中任一项的方法，其中测定至少两个卵裂间期中 的细胞移动的时间段。

136.根据前述项目中任一项的方法，其中测定至少两个卵裂间期中 的细胞移动的程度。

137.根据前述项目中任一项的方法，其中所述质量量度包括至少一 个排除标准。

138.根据前述项目中任一项的方法，其中所述排除标准包括t2时卵 裂球均匀性的信息、二卵裂球期和/或四卵裂球期时的多核性的信息和/或 从一个卵裂球直接卵裂成三个卵裂球的信息。

139.根据前述项目中任一项的方法，其中排除标准是cc2和/或cc3 小于10小时，或小于9.5小时，或小于9小时，或小于8.5小时，或小于 8小时，或小于7.5小时，或小于7小时，或小于6.5小时，或小于6小 时，或小于5.5小时，或小于5小时，或小于4.5小时，或小于4小时， 或小于3.5小时，或小于3小时，或小于2.5小时，或小于2小时，或小 于1.5小时，或小于1小时。

140.根据前述项目中任一项的方法，其中排除标准是t2大于28小 时，或大于28.5小时，或大于29小时，或大于29.5小时，或大于30小 时，或大于30.5小时，或大于31小时，或大于31.25小时，或大于31.5 小时，或大于31.75小时，或大于32小时，或大于32.5小时，或大于33 小时，或大于33.5小时，或大于34小时。

141.根据前述项目中任一项的方法，其中排除标准是cc2b大于11 小时，或大于11.5小时，或大于12小时，或大于12.5小时，或大于12.75 小时，或大于13小时，或大于13.1小时，或大于13.25小时，或大于13.5 小时，或大于14小时，或大于14.5小时，或大于15小时。

142.根据前述项目中任一项的方法，其中排除标准是cc3大于15 小时，或大于15.5小时，或大于16小时，或大于16.5小时，或大于17 小时，或大于17.25小时，或大于17.5小时，或大于17.6小时，或大于 17.75小时，或大于18小时，或大于18.5小时，或大于19小时，或大于 19.5小时。

143.根据前述项目中任一项的方法，其中排除标准是s2大于1小时， 或大于1.1小时，或大于1.2小时，或大于1.3小时，或大于1.4小时，或 大于1.5小时，或大于1.6小时，或大于1.7小时，或大于1.8小时，或大 于1.9小时，或大于2小时，或大于2.1小时，或大于2.2小时，或大于 2.3小时，或大于2.4小时，或大于2.5小时，或大于2.6小时，或大于2.7 小时，或大于2.8小时，或大于2.9小时，或大于3小时。

144.根据前述项目中任一项的方法，其中排除标准是s3大于2小时， 或大于2.2小时，或大于2.4小时，或大于2.6小时，或大于2.8小时，或 大于3小时，或大于3.1小时，或大于3.2小时，或大于3.3小时，或大 于3.4小时，或大于3.5小时，或大于3.6小时，或大于3.7小时，或大于 3.8小时，或大于3.9小时，或大于4小时，或大于4.1小时，或大于4.2 小时，或大于4.3小时，或大于4.4小时，或大于4.5小时，或大于4.6 小时，或大于4.7小时，或大于4.8小时，或大于4.9小时，或大于5小 时，或大于5.25小时，或大于5.5小时，或大于6小时。

145.一种用于检测胚胎中的非整倍性的方法，其包括：

-将所述胚胎监测一段时间，所述一段时间至少包括所述胚胎从初始 致密化或桑椹胚转化成胚泡期，

-测量所述胚胎的一个或多个胚胎形态学参数，和

-基于所述一个或多个胚胎形态学参数确定所述人类胚胎是否是非 整倍体。

146.根据项目145的方法，其中所述一段时间包括从受精到所述胚 泡期的时间。

147.根据项目145到146中任一项的方法，其中所述一个或多个胚 胎形态学参数是前述项目4到144中任一项的质量标准中的一个或多个， 例如前述项目4到144中任一项的胚泡质量标准中的一个或多个。

148.根据项目145到147中任一项的方法，其中所述一个或多个胚 胎形态学参数选自以下组：

tIC＝从受精到初始致密化的时间，

tM＝从受精到桑椹胚的时间，

tIDT＝从受精到滋养外胚层细胞的初始分化的时间，

tERB＝从受精到早期胚泡的时间，

tBl＝从受精到胚泡的时间，

tEB＝从受精到胚泡扩张的时间，

tCPS(1)＝从受精到第一次收缩的时间，

tCPS(2)＝从受精到第二次收缩的时间，

tCPS(3)＝从受精到第三次收缩的时间，

tHB＝从受精到孵化的时间，和

tFH＝从受精到完全孵化的时间。

149.根据项目148的方法，其中如果一个或多个所述参数落在其正 常范围外，那么检测到非整倍性。

150.根据项目145到149中任一项的方法，其中所述胚胎形态学参 数是

tBl＝从受精到胚泡的时间，和

tEB＝从受精到胚泡扩张的时间。

151.根据项目145到150中任一项的方法，其中如果tBl和tEB两 者都落在其正常范围外，那么检测到非整倍性。

152.根据项目151的方法，其中tBl的正常范围小于96.5小时，并 且tEB的正常范围小于120.3小时。

153.根据项目151的方法，其中tBl的正常范围是75小时到96.5 小时，并且tEB的正常范围是80小时到120.3小时。

154.根据项目1到144中任一项的方法，其中根据项目145到153 项任一项的方法检测到的非整倍性是排除标准。

155.根据前述项目中任一项的方法，其中在孵化器中监测所述胚胎。

156.根据前述项目中任一项的方法，其中借助缩时显微设备监测所 述胚胎。

157.根据前述项目中任一项的方法，其中通过分析借助缩时显微设 备获得的一系列缩时图像来测定所述胚胎和胚泡形态学参数。

158.根据前述项目中任一项的方法，其中在放置于培养基中的所述 胚胎的培育期间监测所述胚胎。

159.根据前述项目中任一项的方法，其中所述胚胎是人类胚胎。

160.根据前述项目中任一项的方法，其进一步包括以下步骤：选择 具有最高胚胎质量量度的胚胎并将所述胚胎移植到受体中。

161.一种用于确定胚胎质量的系统，其包括用于将所述胚胎监测一 段时间的装置，所述系统进一步具有用于测定所述胚胎的质量标准的装 置，并且具有用于基于所述质量标准确定所述胚胎质量的装置。

162根据项目161的系统，其包括用于测定如项目1到160中任一 项所定义的一个或多个特征的装置。