产多杀菌素刺糖多孢菌及其培养和应用

摘要

本发明公开了一株产多杀菌素的刺糖多孢菌，属于微生物领域，刺糖多孢菌BCSsBFSg5-006(Saccharopolyspora spinosa)菌种编号CGMCC No.5546；多杀菌素的刺糖多孢菌用发酵培养基组成为：40g/L葡萄糖，30g/L可溶性淀粉，15g/L玉米浸液，20g/L棉籽浓缩粉，20g/L酵母粉，1g/L碳酸钙，蒸馏水配置，用1mol/L的NaOH调pH7.0～7.2。本发明的诱变菌株BCSsBFSg5-006与常规多杀菌素生产菌相比，其多杀菌素生产能力更为高，并由此能够有效提高多杀菌素的产率，降低生产成本。

说明书

技术领域

本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一株大量产生多杀菌素的刺糖多孢菌及其培养方法。 

背景技术

多杀菌素[spinosad]，又称刺糖菌素，是由刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)通过有氧发酵聚酮合成途径合成的大环内酯类抗生素。该种抗生素，兼有化学农药的速效性和生物农药的安全性，不会对环境产生污染，对鱼类、人类安全系数高，近年来这种绿色农药的开发研究得到了飞速发展。多杀菌素，作为一种生物农药，具有一些独特的物理、化学和生物学特性，如杀虫谱广、作用方式独特、杀虫活性高、半衰期短、残留低、无抗药性、对人畜无害、环境污染少等特性，是一种具有触杀及摄食毒性的新型微生物源杀虫剂，于1999年获得美国“总统绿色化学品挑战奖(Presidential Green Chemistry Challenge Award)”。这些特性决定了多杀菌素在农牧业生产中具有广阔的应用前景，该产品的开发具有良好的经济效益和社会效益。 

刺糖多孢菌，属于糖多孢菌属(Saccharopoly)，是迄今发现的唯一可以通过好氧发酵产生多杀菌素的菌株。1982年，EliLilly and Company(礼来公司)天然产物研究部门一位化学家在加勒比海度假时顺便从废弃的甘蔗制甜酒厂附近采集来一些土壤样品，随后该部门的人员对样品进行筛选、分离和发酵。Boeck等人首次从刺糖多孢菌QYLZ 88912培养液中分离出了多杀菌素组分A、B、C、D、E、F、H、J，其主要活性成分是A组分(spinosynA)和D组分(spinosyn D)，其中A组分约占85-90％，D组分约占10-15％，其混合物命名为Spinosad， 中文名为多杀菌素。1986年，多杀菌素产生菌被确定属于Saccharopoly属，英文全名为Saccharopolyspora Mertz & Yao。1989年，陶氏化学公司和礼来公司合并了他们的作物科学部门，成为美国陶氏益农公司，后又转而成为陶氏农业科学公司(Dow AgroSciences Company)来共同开发和研究多杀菌素。1994年，美国陶氏益农公司将这种新型的生物农药提交到美国环保总局(EPA)，鉴于该药剂不滞留于环境中，并且对哺乳动物和水生生物的毒性相当低，美国环保总局于1997年给予优先登记注册。随即美国陶氏益农公司将该生物农药成功实施商业化，商品名为Tracer(催杀)，登记用于防治棉花田的鳞翅目害虫。1999年在24个国家超过100多种作物上登记注册，商品名还有用于蔬菜类的Success(菜喜)，Conserve和Spintor。目前，多杀菌素已经在60多个国家登记用于防治200多种作物害虫上使用，年销售额约2亿美元。在我国登记的多杀菌素主要用于棉花上的“催杀”(多杀菌素48％悬浮剂)和用于蔬菜上的“菜喜”(多杀菌素2.5％悬浮剂)。2007年，多杀菌素的第二代产品(商品名DELEGATETM WG)在新西兰通过评价，获得了第一个全球登记，该产品用量少，在环境中降解更快，用于控制苹果蠹蛾(果树上的一种棘手的主要害虫)。目前，国外多杀菌素的研究领域已延伸到开发杀虫活性更高，生物安全性更好的多杀菌素衍生物上，而我国尚无工业化的报道。尽管国内对发酵生产多杀菌素的研究起步较晚，虽然最近几年内也取得了很大的进展，但较国外研究水平还有很大的差距。因此加强多杀菌素的研究，为我国农药领域开辟一种新型绿色产品，对我国农牧业生产具有重要的应用价值和环境效益。 

目前合成多杀菌素的主要方法是微生物液态发酵法和微生物固态发酵法。微生物固态发酵法用于多杀菌素的合成，面临的主要问题是发酵工艺较难控制、产量低、提取成本高，难以规模化生产，因此，该方法不具备应用价值。多杀 菌素的制备方法主要集中在微生物液体发酵合成，生物合成多杀菌素具有突出的优点，工艺条件较易控制、产品质量稳定、提取较为方便，但微生物液态发酵生产多杀菌素产量很低，而且较长的发酵周期未能实现大规模工业化生产，以致影响了该物质的应用。 

发明内容：

本发明解决的技术问题是提供一株产多杀菌素的刺糖多孢菌及其培养方法； 

本发明利用复合诱变技术筛选获得一株多杀菌素高产菌株刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)BCSsBFSg⁵-006，菌种编号CGMCC No.5546。 

该菌株于2011年12月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名：刺糖多孢菌；保藏单位地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所内。CGMCC No.5546提高了多杀菌素的产量，有效降低了生产成本，实现了多杀菌素的工业化生产。 

诱变菌株刺糖多孢菌BCSsBFSg⁵-006(Saccharopolyspora spinosa)CGMCC No.5546)是以从我国广西废弃的甘蔗制甜酒厂附近的土壤样品中筛选出的刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)菌株QYLZ 88912为出发菌株经紫外线诱变后得到的。 

本发明诱变菌株刺糖多孢菌BCSsBFSg⁵-006(Saccharopolyspora spinosa)CGMCC No.5546)的诱变过程如下： 

1.采用多组复合诱变技术选育多杀菌素高产菌株 

(1)选择生长良好的刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)菌株QYLZ 88912斜面菌种，用无菌生理盐水洗下孢子，制做10⁶个/mL的孢子悬浮液，于30W紫外灯下，30cm处，分别照射5s、10s、15s、20s、25s、30s、35s、40s、45s、 50s，将孢子悬液梯度稀释涂平板，避光培养，计算致死率； 

(2)根据(1)中致死率选择高、中、低三个不同剂量的照射时间分别对菌株QYLZ 88912的孢子悬浮液进行紫外照射处理； 

(3)然后把(2)中三个不同照射时间的菌悬液混合均匀，梯度稀释涂平板，避光培养； 

(4)将(3)中的诱变菌株接种到含有10mg/L磺胺胍的种子培养基中培养； 

(5)将(4)中的种子液以10％接种量接种到含有10mg/L链霉素的种子培养基中培养； 

(6)将(5)中的种子液以10％接种量接种到含有35mg/L红霉素的种子培养基中培养； 

(7)将(6)中的种子液以10％接种量接种到含有10g/L鼠李糖的种子培养基中培养； 

(8)将(7)中的种子液以10％接种量接种到含有30g/L丙酸钠的种子培养基中培养； 

(9)取(8)中的种子液接种到发酵培养基的固体平板上培养，筛选培养基上菌落为梅花状，菌落边缘为锯齿状，正面白色，干燥，中间凹陷明显的抗性菌株； 

(10)取(9)中得到的多株菌株分别接种到种子培养基中，在29℃下，200r/m振荡培养4d，以10％的接种量接入发酵培养基中，29℃、240r/m下发酵7d，将发酵液用等体积甲醇室温震荡浸提2h，5000r/m离心10min，取上清液，用HPLC测定上清液中多杀菌素的质量浓度，复筛出多杀菌素高产菌株BCSsBFSg⁵-006。 

2.刺糖多孢菌BCSsBFSg⁵-006的培养方法为： 

(1)菌种活化：将斜面菌种——刺糖多孢菌BCSsBFSg⁵-006(Saccharopolyspora spinosa)转接斜面培养基，29℃活化培养5d； 

(2)种子培养：选取生长良好的斜面作为种子，加入8mL无菌水洗下斜面孢子，吸取4mL孢子悬液接入种子培养基中，于29℃，180～200r/m下培养36～54h，制得种子液； 

(3)发酵培养：将(2)中的种子培养液以8～10％(v/v)接种量接种于发酵培养基中，在29℃下，240r/m振荡培养7～8d； 

3.刺糖多孢菌QYLZ 88912所用到的培养基为： 

(1)保藏分离培养基：可溶性淀粉20g/L，葡萄糖5g/L，酵母提取物3g/L，玉米浆10g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，琼脂20g/L，pH6.5～6.7，121℃高压蒸汽灭菌30min； 

(2)种子培养基：可溶性淀粉20g/L，葡萄糖5g/L，酵母提取物3g/L，玉米浆10g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，pH6.5～6.7，121℃高压蒸汽灭菌30min； 

(3)发酵培养基：40g/L葡萄糖，30g/L可溶性淀粉，15g/L玉米浸液，20g/L棉籽浓缩粉，20g/L酵母粉，1g/L碳酸钙，pH7.0～7.2，121℃高压蒸汽灭菌30min； 

(4)选择培养基： 

①磺胺胍10mg/L，可溶性淀粉20g/L，葡萄糖5g/L，酵母提取物3g/L，玉米浆10g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，pH6.5～6.7，121℃高压蒸汽灭菌，用1mol/L NaOH调pH 6.5～6.7，121℃灭菌30min。 

②链霉素10mg/L(灭菌后单独加入)，可溶性淀粉20g/L，葡萄糖5g/L，酵母提取物3g/L，玉米浆10g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，用1mol/L NaOH调pH 6.5～6.7，121℃灭菌30min。 

③红霉素35mg/L(灭菌后单独加入)，可溶性淀粉20g/L，葡萄糖5g/L，酵母提取物3g/L，玉米浆10g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，用1mol/L NaOH调pH 6.5～6.7，121℃灭菌30min。 

④鼠李糖10g/L(灭菌后单独加入)，可溶性淀粉20g/L，葡萄糖5g/L，酵母提取物3g/L，玉米浆10g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，用1mol/L NaOH调pH 6.5～6.7，121℃灭菌30min。 

⑤丙酸钠30g/L(灭菌后单独加入)，可溶性淀粉20g/L，葡萄糖5g/L，酵母提取物3g/L，玉米浆10g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，用1mol/L NaOH调pH 6.5～6.7，121℃灭菌30min。 

本发明与现有技术相比，有益效果是：本发明的诱变菌株BCSsBFSg⁵-006与常规多杀菌素生产菌相比，其多杀菌素生产能力更为高，并由此能够有效提高多杀菌素的产率，降低生产成本。产量为1200±56.7mg/L，比原始菌株提高783.5％. 

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限制性的，不能以此限定本发明的保护范围。 

实施例1原始的生产多杀菌素的菌株刺糖多孢菌QYLZ 88912 

1.菌体形态：菌体为单细胞，革兰氏染色为阳性，在固体培养基上以无性孢子的方式进行繁殖，在液体培养基中形成菌丝球，主要通过基内菌丝片段来繁殖新个体。刺糖多孢菌气生菌丝分隔成以镰刀状和开环状排列的长孢子链，也可以观察到较短而且不完整的螺旋状的菌丝。孢子形状为椭圆形，平均大小约为1.1×1.5μm。气生孢子群的颜色主要为浅粉黄色，在某些培养基上也产生白色孢子。 

2.菌落形态：在平板上，当培养基潮湿时，菌落大体上呈草帽状，表面干燥， 正面白色，周围相对较为整齐，菌落不透明，中间凸起；当培养基干燥时，菌落粗糙皱褶，中间较为凹陷，边缘多呈放射状。 

3.培养特征：此菌为高耗氧菌，最适生长温度为15～37℃，最适生长pH6-8，对溶菌酶敏感，能在高渗条件下(11％NaCl)生长，在大多数培养基(如ISP2、ATCC172)上都能生长良好，并形成良好的气生菌丝体；在摇床转速220～240r/min，培养6～8d，pH 6.7～8.0，发酵液有淡土腥味，镜检下多为菌丝片段时，多杀菌素产量最高。发酵过程中溶氧对多杀菌素的产生具有显著作用。 

4.可以利用的碳源：葡萄糖、麦芽糖、核糖、木糖、果糖、半乳糖、甘露糖、甘露醇、可溶性淀粉、糊精、油酸甲酯、油类等，上述碳源一般混合使用，不常用单一碳源。 

实施例2以刺糖多孢菌QYLZ 88912为出发菌株采用多组复合诱变技术筛选得到菌株BCSsBFSg⁵-006。 

1.诱变菌株的获得 

(1)选择生长良好的多杀菌素生产菌株QYLZ 88912斜面菌种，用无菌生理盐水洗下孢子，制做10⁶个/mL的孢子悬浮液，于30W紫外灯下，30cm处，分别照射5s、10s、15s、20s、25s、30s、35s、40s、45s、50s，将孢子悬液梯度稀释涂平板，于29℃避光培养，计算致死率； 

(2)选择5s、20s、33s三个不同剂量的照射时间分别对菌株QYLZ 88912的孢子悬浮液进行紫外照射处理； 

(3)然后把三个不同照射时间的孢子悬液混合均匀，进行10倍系列稀释10^-1～10^-6，取10^-4、10^-5、10^-6三个稀释度的孢子悬浮液涂布平板，29℃避光培养9～12d； 

(4)将(3)中的诱变菌株接种到含有10mg/L磺胺胍的种子培养基中培养； 将种子液置于29℃恒温摇床，200r/m，振荡培养3～4d； 

(5)将(4)中的种子液以10％接种量(v/v)接种到含有10mg/L链霉素的种子培养基中培养； 

(6)将(5)中的种子液以10％接种量(v/v)接种到含有35mg/L红霉素的种子培养基中培养； 

(7)将(6)中的种子液以10％接种量(v/v)接种到含有10g/L鼠李糖的种子培养基中培养； 

(8)将(7)中的种子液以10％接种量(v/v)接种到含有30g/L丙酸钠的种子培养基中培养； 

(9)取(8)中的种子液进行10倍系列稀释，取10^-4、10^-5、10^-6三个稀释度的孢子悬浮液涂布斜面培养基平板，29℃培养9～12d，筛选培养基中正面白色，菌落边缘为锯齿状，表面干燥，中间凹陷明显的抗性标记菌株； 

(10)取(9)中得到的多株菌株分别接种到种子培养基中，在29℃下，200r/m振荡培养4d，以10％的接种量接入发酵培养基中，29℃、240r/m下发酵7d，将发酵液用等体积甲醇室温震荡浸提2h，5000rpm离心10min，取上清液，用HPLC测定上清液中多杀菌素的质量浓度，筛选出多杀菌素高产菌株BCSsBFSg⁵-006。 

发酵培养基成分为：40g/L葡萄糖，30g/L可溶性淀粉，15g/L玉米浸液，20g/L棉籽浓缩粉，20g/L酵母粉，1g/L碳酸钙，pH7.0～7.2，121℃高压蒸汽灭菌30min。 

培养条件：500mL摇瓶，装液量50mL，29℃，240r/m，振荡培养7d. 

2.诱变菌株BCSsBFSg⁵-006的特性 

(1)菌体形态：菌体为单细胞，革兰氏染色为阳性，在固体培养基上以无 性孢子的方式进行繁殖，在液体培养基中形成菌丝球，主要通过基内菌丝片段来繁殖新个体.刺糖多孢菌气生菌丝分隔成以镰刀状和开环状排列的长孢子链，也可以观察到较短而且不完整的螺旋状的菌丝。孢子形状为椭圆形，平均大小约为1.1×1.5μm。气生孢子群的颜色主要为浅粉黄色，在某些培养基上也产生白色孢子。 

(2)菌落形态：在平板上，培养基潮湿时菌落呈梅花状，表面干燥，正面白色，边缘波状且较厚，不透明，中间凸起；当培养基干燥时，菌落中间凹陷。 

(3)培养特征：29℃，220～240rpm下震荡培养7d，发酵液有土腥味较浓，镜检下菌丝染色弱、有少量断裂现象，pH6.7～7.5。 

(4)可以利用的碳源：葡萄糖、麦芽糖、核糖、木糖、果糖、半乳糖、甘露糖、甘露醇、可溶性淀粉、糊精、油酸甲酯、油类等，上述碳源一般混合使用，不常用单一碳源。 

(5)可以分别在10mg/L的磺胺胍、10mg/L链霉素、35mg/L红霉素、10g/L鼠李糖、30g/L丙酸钠的抗性平板上进行生长，并生长良好 

1.培养基的配置 

保藏分离培养基：可溶性淀粉20g/L，葡萄糖5g/L，酵母提取物3g/L，玉米浆10g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，琼脂15～20g/L，蒸馏水配置，用1mol/L的NaOH调pH6.5～6.7，121℃高压蒸汽灭菌30min。 

种子培养基：可溶性淀粉20g/L，葡萄糖5g/L，酵母提取物3g/L，玉米浆10g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，蒸馏水配置，用1mol/L的NaOH调pH6.5～6.7，121℃高压蒸汽灭菌30min，培养温度29℃。 

发酵培养基：40g/L葡萄糖，30g/L可溶性淀粉，15g/L玉米浸液，20g/L棉籽浓缩粉，20g/L酵母粉，1g/L碳酸钙，蒸馏水配置，用1mol/L的NaOH调 pH7.0～7.2，121℃高压蒸汽灭菌30min，培养温度29℃。 

2.菌种活化 

将刺糖多孢菌转接BCSsBFSg⁵-006种子斜面培养基，于恒温培养箱中，29℃培养4～5d； 

3.种子培养 

选择生长良好的活化斜面菌种接种于装有上述1中制得的种子培养基的三角瓶(500mL三角瓶内装50mL的培养基)中，于29℃，200r/m下培养2～3d； 

4.发酵培养 

将3中制得的种子培养液以10％(v/v)接种量接种于发酵培养基中(500mL内装50mL的培养基)，于29℃，240r/m下发酵7d； 

检测结果：刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)BCSsBFSg⁵-006在发酵培养基发酵生产多杀菌素产量为1200±56.7mg/L。