定量分析循环肿瘤细胞的试剂及试剂盒

摘要

本发明涉及定量分析循环肿瘤细胞的试剂及试剂盒。本发明人设计了适宜检测循环肿瘤细胞的探针，从而可配合流式细胞技术，快速、灵敏、准确地获得循环肿瘤细胞的测定结果。所述的探针可被制备成试剂盒，方便人们应用。

说明书

技术领域

本发明术语生物技术和医学领域；更具体地，本发明涉及定量分析循环肿瘤细胞的试剂及试剂盒。

背景技术

最新的研究表明，癌症从发病起就向血液循环中散播肿瘤细胞，即循环肿瘤细胞(CTC)。由于癌症的病情发展与CTC密切相关，所以检测血液中CTC的浓度可以用来诊断癌症、对癌症进行分期、动态地监控癌症及指导临床用药。

以往的文献表明，一个正在生长的肿瘤每天向血循环中释放10⁵-3×10⁶个肿瘤细胞。因此，这些循环肿瘤细胞(CTC)是一个灵敏的临床指标。最新的研究表明，CTC可以用来对多种癌症进行预后，包括乳腺癌、前列腺癌、直肠癌、肺癌等。所以，对CTC检测技术的研究和开发也越来越多。1869年，Ashworth解剖晚期癌症病人，偶然发现其血样中含有CTC。此后，他的研究激发了学术界对CTC和肿瘤生长、恶化和扩散的研究。基于Ashworth的研究，Paget于1889年提出了癌症界著名的种子和土壤学说(seed and soil hypothesis)。此学说成功地阐释了癌症复发和转移的机理。癌症病人在用药时，病情虽然减轻或稳定，但是原发的肿瘤组织释放出来的CTC会以癌症干细胞的形式休眠于骨髓中。停药后，这些癌症干细胞又会生成新的CTC，释放于血液循环中，从而造成复发或转移。1975年，Bulter等发现一个由于治疗而逐步萎缩的乳癌肿瘤在24小时内向血循环中释放了1.0⁵×10⁷个CTC。这么大量的CTC足以造成远程扩散和次发肿瘤的生长。此发现说明CTC是癌症复发和治疗监控的重要指标。1998年，Racila等用亲和性磁子法从乳腺癌病人血样中分离了CTC并加以分析。这是第一个系统性的针对CTC进行诊断的研究。此研究发现在13个健康人的血样中的CTC数量平均为1.5个/mL，局部肿瘤的患者(早期)平均为15.9个/mL，淋巴结扩散的患者(中期)平均为47.4个/mL，而远程扩散的患者(晚期)平均为122个/mL。此后，科学家相继在直肠癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌、卵巢癌等的CTC研究中得到了相似的结果。

以上这些研究表明CTC的数量可以用来动态地监控癌症病情的发展，然而目前本领域中，检测CTC的手段复杂，耗时长，准确性也有待提高，目前还缺乏实时、快速地检测CTC的方法和试剂。

发明内容

本发明的目的在于提供定量分析循环肿瘤细胞的试剂及试剂盒。

在本发明的第一方面，提供一种检测循环肿瘤细胞的探针，结构如下：

A-B-C；

其中，A代表特异性结合循环肿瘤细胞的结合分子；

B为无，或代表亲水性化学小分子，用于优化A与细胞表面抗原的结合；

C代表可检测的标记分子；

“-”代表A、B和C之间的共价连接、偶联或偶合的关系。

在一个优选例中，A选自针对循环肿瘤细胞特异性的抗体、配体、化学小分子或多肽；A对于循环肿瘤细胞的平衡解离常数(Kd)小于10^-6mol/L。

在另一优选例中，A选自：抗乳癌的抗体，LHRH多肽或叶酸；或者

B选自：2～100聚(较佳地为4～16聚；更佳地为4～8聚)的聚氧乙烯双胺；半胱氨酸(较佳地为1～5个；更佳地1～3个)；或者

C选自为荧光标记。

在另一优选例中，所述的荧光标记选自：Alexa Fluor 488琥珀酰亚胺酯，Alexa Fluor 647琥珀酰亚胺酯，FITC，PE，Cy3，Cy5，PE-Cy5等。

在另一优选例中，所述的荧光标记是Alexa Fluor 488琥珀酰亚胺酯。

在另一优选例中，A为抗乳癌的抗体；以及B为无。

在另一优选例中，A为变异型黄体生成素释放激素(Luteinizing HormoneReleasing Hormone，LHRH)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；以及B为四聚氧乙烯双胺。

在另一优选例中，A为γ叶酸；以及B为半胱氨酸。

在另一优选例中，半胱氨酸的个数是1～3个；更佳地为2个。

在本发明的另一方面，提供所述的探针的用途，用于制备检测循环肿瘤细胞的试剂盒。

在本发明的另一方面，提供一种检测循环肿瘤细胞的试剂盒，其中包含所述的探针。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包含：对照品、参照品和/或使用说明书。

在本发明的另一方面，提供一种检测循环肿瘤细胞的方法(较佳地，为非诊断性的方法)，所述方法包括：

将所述的探针加入到待测样品中，检测标记分子的含量，从而得知循环肿瘤细胞的量。

在另一优选例中，所述的标记分子是荧光标记，通过流式细胞术来检测标记分子的含量。

在另一优选例中，所述的待测样品是富集了循环肿瘤细胞的样品。较佳地，通过密度梯度离心实施富集。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、CTC检测的线性和检测限分析结果。

图2、Alexa Fluor 488偶联的Herceptin抗体标记的乳癌CTC。黄绿色的细胞为癌细胞。蓝色背景色是为了更清楚地显示荧光的癌细胞。左下角标尺大小为10μm。

图3、Alexa Fluor 488偶联的LHRH标记的前列腺癌CTC。黄绿色的细胞为癌细胞。蓝色背景色是为了更清楚地显示荧光的癌细胞。左下角标尺大小为10μm。

图4、Alexa Fluor 488偶联的叶酸探针标记的肺癌CTC。绿色的细胞为癌细胞。左下角标尺大小为10μm。

图5、采用荧光标记的叶酸探针分别标记病例1(肺癌患者)的阳性肺癌CTC(左图)和外参Fluospheres(右图)，流式细胞术对CTC含量的定量分析。

图6、采用荧光标记的Herceptin抗体标记病例3(乳腺癌患者)的阳性癌细胞(左图)和外参Fluospheres(右图)，流式细胞术对CTC含量的定量分析。

图7、采用荧光标记的叶酸探针标记病例4(肺癌患者)的阳性癌细胞(左图)和外参Fluospheres(右图)，流式细胞术对CTC含量的定量分析，其中上排图为化疗前的检测结果，下图为化疗后的检测结果。

图8、用Alexa Fluor 647标记的LHRH-四聚氧乙烯双胺探针染色的前列腺癌细胞的结果。

具体实施方式

为了改进循环肿瘤细胞的测定技术，本发明人作了大量的工作，设计了适宜检测的探针，从而可配合流式细胞技术，快速、灵敏、准确地获得循环肿瘤细胞的测定结果。所述的探针可被制备成试剂盒，方便人们应用。

术语

如本文所用，所述的“循环肿瘤细胞(CTC)”是指存在于血液(外周血)中的癌症(肿瘤)细胞，CTC的浓度可以诊断癌症、对癌症进行分期、预后等。

如本文所用，所述的“癌症”或“肿瘤”没有特别的限制，只要该“癌症”或“肿瘤”自发病起会向血液循环中散播癌症细胞或肿瘤细胞。例如选自(但不限于)：鼻咽癌、食管癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、肺癌、宫颈癌、白血病、口腔癌、唾液腺肿瘤、鼻腔与鼻旁窦恶性肿瘤、喉癌、耳部肿瘤、眼部肿瘤、甲状腺肿瘤、纵隔肿瘤、胸壁、胸膜肿瘤、小肠肿瘤、胆道肿瘤、胰腺与壶腹周围肿瘤、肠系膜与腹膜后肿瘤、肾脏肿瘤、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、前列腺癌、睾丸肿瘤、阴茎癌、子宫内膜癌、卵巢恶性肿瘤、恶性滋养细胞肿瘤、外阴癌与阴道癌、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、软组织肿瘤、骨肿瘤、皮肤及附件肿瘤、恶性黑色素瘤、神经系统肿瘤、小儿肿瘤。

作为本发明的优选实施方式，所述的“癌症”或“肿瘤”选自：乳(腺)癌、肺癌、前列腺癌。

如本文所用，所述的“平衡解离常数(equilibrium dissociation constant，Kd)”指占据半数细胞上特定的受体所需的配体、抗体、化学小分子或多肽的浓度。Kd值与受体亲和力呈反向关系，Kd值愈小，表明亲和力愈高；反之Kd值愈大，表明亲和力愈低。

如本文所用，所述的“特异性”是指是抗体、配体、多肽或化学小分子能识别和/或结合于循环肿瘤细胞表面的特定分子(如表面抗原、受体)上，但不识别和结合于其它非相关分子。

探针

本发明人合成了一系列癌症特异性的纳米探针。这些探针主要是基于以下三联体理念：

A-B-C；

其中，A代表一个特异性的针对癌症的高亲和性分子(通常Kd＜10^-6mol/L)，比如抗体、高亲和性的多肽片段、高亲和性化学小分子等，用于特异性地结合目标癌症细胞的表面抗原；B用于优化A与细胞表面抗原的结合，例如可以是亲水性的化学小分子，B有时候也可以设置为无；C代表可检测的标记分子，用于目标癌症细胞的定量检测。

A是发挥导向作用的关键分子，其是用于识别和/或结合循环肿瘤细胞的，因此，其通常根据所需检测的肿瘤的类型而设，例如抗Her2的单克隆抗体可以识别和结合于乳癌细胞表面的Her2抗原；LHRH多肽可以识别和结合前列腺癌细胞表面的黄体生成素释放激素受体(LHRH receptor)；叶酸可以识别和结合肺癌细胞表面的叶酸受体(folate receptor)。

目前，针对存在于各种肿瘤表面的特定分子，已经有深入的研究，也开发出了各种针对这些表面分子的结合分子，包括抗体、配体、多肽、化学小分子等。本发明对结合分子没有特别的限制，这些结合分子均可被应用于本发明的方法中，从而设计出各种针对肿瘤细胞的检测探针。

B的设计取决于A的结合分子的种类。当在不需要B的情况下A也能很好地与循环肿瘤细胞实现结合时，则B可以不存在。B通常是亲水性的分子，优化A与循环肿瘤细胞表面的结合，B例如是一种Spacer，更特别的例如是化学小分子。

C是发挥指示作用的分子，其的存在是可以被检测到的。当采用流式细胞技术来实施检测时，C优选的是荧光分子。可用于流式细胞检测的荧光分子是很多的，它们也可以是具有不同的检测波长的。多种荧光分子均可应用于本发明，本领域技术人员了解各种荧光分子所特定的检测波长，可以方便地作出选择。

作为本发明的优选方式，本发明人在反复研究后，开发了检测乳癌的探针，其中A为抗乳癌的抗体；B为无；C为荧光分子。其中所述的抗乳癌的抗体优选的是抗Her2的单克隆抗体。该探针识别性能良好，结合流式细胞技术，检测CTC的准确率和灵敏度非常理想。

作为本发明的优选方式，本发明人在反复研究后，开发了检测前列腺癌的探针，其中A为变异型LHRH多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；B为聚氧乙烯双胺；C为荧光标记。本发明人意外地发现，该变异型的LHRH多肽的亲和性非常理想，比天然的多肽的平衡解离常数(Kd)显著小了5倍。并且，为了优化该变异型LHRH与CTC的结合，本发明人还将该变异型的LHRH与聚氧乙烯双胺相偶联。经过上述优化后的检测前列腺癌的探针，可以良好地识别和结合前列腺癌地CTC细胞，准确率和灵敏度非常理想。

作为本发明的优选方式，本发明人在反复研究后，还开发了检测肺癌的探针，其中，A为γ叶酸；B为半胱氨酸；C为荧光分子。本发明人意外地发现，γ叶酸与半胱氨酸的偶合物与天然叶酸相比较，提高了与叶酸受体的亲和力；并且，将γ叶酸与半胱氨酸相连，可以显著地增加叶酸的溶解性，从而提高与循环肿瘤细胞接触的叶酸的量。半胱氨酸的个数优选的是1～3个，该范围内的半胱氨酸可为叶酸提供良好的亲水环境。

试剂盒

本发明开发的任一种探针可被包含在试剂盒中，从而便于本领域技术人员的操作。所述的试剂盒中，所述探针被装于合适的容器中，更佳地所述探针还被配制成合适的用量或浓度。

所述的试剂盒中还可包含其它试剂，例如是用于流式细胞术的试剂、缓冲液(如PBS)、洗涤液等。

所述试剂盒还可包括：试剂盒使用说明书，以指导技术人员的操作。

应用

本发明还涉及利用所述的探针来检测循环肿瘤细胞的方法，所述的方法可以是以诊断疾病为目的的，例如对患者进行预后，或判断疑似人群是否罹患疾病；或以非诊断疾病为目的的，例如，纯粹的科学研究，或纯粹的细胞分型(区分肿瘤细胞的类别)。

CTC在临床中的应用如下：

监控复发：通常，癌症即使治愈后，仍有55％的几率复发。而且复发的病例中80％是远程扩散。所以，密切监控患者愈后的复发十分重要。CTC诊断系列正是在最早期检测这种癌细胞。从而便于医生在早期用药，防止远程扩散。因此临床意义重大。

治疗评价：CTC检测可以实时的监控治疗方案的效果，避免过度治疗或错过最佳治疗时间。目前肿瘤患者在接受了治疗(手术，放、化疗)后，医生要等数个月后才可根据影像学或活检的方法做出治疗方案的调整。相比之下，CTC检测可以在影像学和活检检出病征之前就能指示残余肿瘤的活动状态，从而提醒医生进行早期用药。另一方面，通过监控CTC数量的变化，医生还可实时监控化疗的效果，从而及时调整用药或提早结束治疗避免化药的毒副作用。更重要的是，医生往往通过影像学观察肿瘤的大小来判断是否停止化疗。但是，病人往往在停药后的几个月内复发。以往的文献表明，一个治疗后萎缩的肿瘤仍旧往血循环中释放大量肿瘤细胞，这些肿瘤细胞就是导致复发的潜在原因。因此，在指导用药上，CTC可以作为独立于CT的另一标准。新的临床用药指导原则应是：肿瘤在CT上萎缩和CTC下降到安全浓度以下(以往的文献表明在某一浓度下，CTC将不能导致扩散)。

临床分期：CTC检测可提高临床分期的准确性。目前的临床分期主要基于影像学或病理学的检查结果，难以准确、及时的反映转移灶对患者治疗和预后的影响。最近的研究表明CTC的存在与肿瘤分期具有明显的相关性，因此可以为癌症分期提供一个新的临床指标。因此检测CTC可进一步提高肺癌TNM分期的准确性，有利于医生制定最佳的治疗方案。

临床诊断：CTC检测可以为不明肺部病变的诊断提供可靠依据。当发现肺部肿物或结节性病变时或影像学难以判断是否是恶性肿瘤时，CTC诊断可以作为影像学的辅助证据以便医生确诊。此外，最新研究发现在无临床转移病灶的I期肺癌中也可以检测到CTC，这说明在肺癌发病的早期就有肺癌微转移的发生。此发现为CTC作为肺癌早期诊断的靶标提供了临床依据。

作为本发明的优选方式，根据循环肿瘤细胞所具有的特性，可先富集该种细胞。富集细胞的方法是本领域技术人员熟知的，例如通过密度梯度离心的方法，现有技术中也已经存在商业化的密度梯度离心试剂。

在本发明的优选实施例中，本发明人用密度梯度离心技术从癌症患者的血样中将CTC分离出来；其次，用特异性的纳米探针将这些CTC进行荧光标记；然后，用流式细胞仪对这些标记的CTC进行分析定量。

应用本发明的方法，本发明人分别从卵巢癌患者、前列腺癌患者、肺癌患者、肾癌、乳腺癌、胃癌等中检测出CTCs。但是在健康人对照组中，没有检测到CTCs。因此，本发明的探针及检测方法可以作为简单、准确和灵敏地定量检测CTC的工具或途径，并为临床肿瘤治疗和愈后监控提供有效的诊断依据。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

I、材料和方法

试剂

抗Her2单克隆抗体购自日本东京的Chugai药业有限公司。Alexa Fluor 488琥珀酰亚胺酯购自美国的Invitrogen公司。PD-10柱(Sephadex G-25M)和FicollPaque(简称Ficoll)购自美国的General Electrical Healthcare。其余所有试剂均购自美国的Sigma Aldrich。所有细胞培养液、Vybrant DID(简称DID)和FluoSpheres均购自美国的Invitrogen公司。

细胞

乳癌细胞(SK-Br-3)购自中科院细胞库。鼻咽癌细胞KB和前列腺癌细胞LNCaP获自美国Purdue大学。

CTC的分离富集和定量检测

为了检验本发明的产品的分析性能，本发明人将一定数量(8，40，200，1000个癌细胞)培养的癌细胞(SK-Br-3、KB和LNCaP)加入健康人的血样当中来模拟癌症患者的血样。根据生产厂家提供的方法，用Ficoll对血液进行密度梯度离心。离心后，将血清下和Ficoll上的单核细胞富集层转移到另一个管子中，然后加入本发明所制备的癌症特异性的纳米探针，孵育30分钟。然后将细胞用PBS洗涤后重悬并加入1000个FluoSpheres，再用流式细胞仪定量分析：

待检测样品中细胞的数量＝(FL1阳性细胞数/FL4阳性细胞数)×1000。

临床样品的检测

为了证实本发明在临床癌症检测中的应用，本发明人从乳腺癌、肺癌、前列腺癌患者抽取了4mL血样。这些血样在如上所述的CTC分离和富集处理后，在这些富集的癌细胞中加入本发明的癌症特异性的纳米探针进行标记，各种纳米探针的加入量分别是：10μg/mL(乳癌特异性的Alexa Fluor 488荧光标记的Trastuzumab(Herceptin)抗体)、100nM(前列腺癌特异性的Alexa Fluor 488荧光标记的LHRH多肽探针)、50nM(肺癌特异性的Alexa Fluor 488荧光标记的叶酸探针)。然后，用荧光显微镜检测CTC及用流式细胞仪定量分析CTC在4mL血样中的含量。实验的结果和其它临床证据(CT、血清检测、病理等)对比。

II、实施例

实施例1、对乳癌特异性的Alexa Fluor 488荧光标记的Trastuzumab(Herceptin)抗体的制备

首先，在1mL浓度为2mg/mL的抗Her2单克隆抗体中加入100μL浓度为1M的pH＝8.0碳酸氢钠缓冲液。其次，加入1mg的Alexa Fluor 488琥珀酰亚胺酯并在室温孵育1小时。然后，在4℃孵育过夜。反应后的产物用PD-10柱(Sephadex G-25M)去除。Alexa Fluor 488偶联的抗体用磷酸缓冲液洗脱并于4℃保存。

实施例2、对前列腺癌特异性的Alexa Fluor 647荧光标记的LHRH多肽探针的制备

天然的LHRH多肽序列(N端至C端)为：Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly(SEQ ID NO：2)。本发明人对天然LHRH进行了改造，改造为Gln-His-Trp-Ser-Tyr-DLys-Leu-Arg-Pro-Gly(SEQ ID NO：1；以上序列，DLys代表抗降解修饰，用Lys取代原来的Gly)，称为变异型LHRH多肽。改造后将Kd值降低约5倍并且抗降解，天然的LHRH多肽Kd＝1×10^-9mol/L，本发明人改造过的LHRH多肽的Kd＝2×10^-10mol/L。

由美国Prelude公司的多肽合成仪合成该改造后的多肽LHRH，将之与Fmoc保护的四聚氧乙烯双胺(Sigma)通过EDC Coupling方法偶联。首先，1mg将Fmoc保护的四聚氧乙烯双胺和10倍量的碳化二亚胺(Sigma)加入100uL二硫甲砜中，反应2h。然后将3倍量的多肽加入反应体系反应3h。反应后的产物以脂键(CO-NH)键联。

获得的LHRH(Gln-His-Trp-Ser-Tyr-DLys-Leu-Arg-Pro-Gly)-四聚氧乙烯双胺的偶联产物由高效液相色谱纯化。5mg纯化的LHRH-四聚氧乙烯双胺在二硫甲砜中溶解，用1mL 10％的吡啶切去Fmoc保护基团，然后加入0.5mg的AlexaFluor 647(Invitrogen)琥珀酰亚胺酯并在室温孵育4小时。反应后的产物用高效液相色谱纯化。

实施例3、对肺癌特异性的Alexa Fluor 488荧光标记的叶酸探针的制备

首先，需要合成叶酸的衍生物(叶酸的γ-异构体)-半胱氨酸偶合物。将441mg的叶酸慢慢溶入20mL二硫甲砜，然后加入1.2mmol的二环己基碳二亚胺和2mmol的N-羟基硫代琥珀酰亚胺于50℃反应6小时。此反应得到的叶酸-N-羟基硫代琥珀酰亚胺和10倍等摩尔量的半胱氨酸加入50微升吡啶在25℃反应5小时。粗产物(其中包含叶酸的γ-异构体-半胱氨酸和α-异构体-半胱氨酸)用20mL乙腈沉淀并离心收集。随后产物用乙醚洗三遍。收集的产物最后用真空干燥，并称量，重量为390mg。此粗产物用美国Agilent Technologies的Microsorb碳-18制备型反相高效液相色谱柱(250mm×21mm)分离纯化。叶酸的γ-异构体(γ叶酸)-半胱氨酸和α-异构体(α叶酸)-半胱氨酸的洗脱时间分别为7.6分钟和10.3分钟。分离的γ叶酸-半胱氨酸(此为脂键CO-NH连接的偶合物，含2个半胱氨酸)为58mg，得率为12％。然后，将纯化后的1.5mg偶合物在100μL的二硫甲砜中溶解，并加入1.0mg的Alexa Fluor 488琥珀酰亚胺酯并在室温孵育4小时。反应后的产物用高效液相色谱纯化。

天然叶酸的Kd＝5×10^-10mol/L，本发明人改造后的偶合物的Kd＝1.4×10^-10mol/L。

实施例4、CTC分离富集的可行性

(a)CTC分离富集精确度和可重复性

本发明人分别将100个和1,000个DID染色的癌细胞加入4mL健康人的血样中配制成标准样品。在此后的连续7天中，每天分别进行测试，测试结果的平均值如表1。

表1

(b)CTC检测的准确度和回收率

本发明人从健康人抽取4mL血样，然后将所有血样放到一起并混匀。然后分别将8，40，200，1,000个DID染色的癌细胞加入4mL血样中配制细胞浓度梯度标准样品。另外的4mL未加癌细胞的作为阴性对照品。然后用流式细胞术对这些样品进行定量分析(Fluospheres作为外参)。数据如表2。

表2

(c)CTC检测的线性和检测限

本发明人对上述数据做了线性回归分析。将标准品中的细胞数量作为独立变量，平均检出的细胞数量作为依赖变量，可以得到纵轴截距为-1.5，R²＝0.9968及R＝0.9984，如图1。因此，排除癌细胞在分离富集中的人为损失后，此分析说明本发明的探针的检测范围为0到1000个细胞每4mL血样。

实施例5、荧光显微方法CTC的检测

(1)荧光标记的Trastuzumab(Herceptin)抗体

本发明人验证了实施例1制备的带有荧光标记的Trastuzumab(Herceptin)抗体的准确性。检测方法如前述“临床样品的检测”。

结果如图2所示，在一个乳腺癌患者处理过的样品中，可以检测到Her2阳性的癌细胞，而其它的杂细胞(未除尽的红、白细胞)均无荧光信号。这个数据为此抗体探针的特异性提供了直接证据。

(2)带有荧光标记的LHRH多肽

本发明人验证了实施例2制备的带有荧光标记的LHRH多肽的准确性，检测方法如前述“临床样品的检测”。

结果如图3所示，在一个前列腺癌患者处理过的样品中，本发明人可以检测到LHRH阳性的癌细胞，而其它的杂细胞(未除尽的红、白细胞)均无荧光信号。这个数据为LHRH多肽探针的特异性提供了直接证据。

(3)荧光标记的叶酸探针

本发明人验证了实施例3制备的带有荧光标记的叶酸探针的准确性，检测方法如前述“临床样品的检测”。

结果如图4所示，在一个肺癌患者处理过的样品中，可以检测到叶酸受体阳性的癌细胞，而其它的杂细胞(未除尽的红、白细胞)均无荧光信号。这个数据为叶酸探针的特异性提供了直接证据。

实施例6、流式细胞术对CTC的定量分析

本发明人从若干乳癌(病例3)、前列腺癌(病例5)和肺癌(病例1、病例2、病例4)患者中各取4mL血样，用如上所述的方法进行分离富集。在处理后的样品中加入Fluospheres作为外参，然后，将样品用BD公司的FACSCalibur流式细胞仪分析。

(1)病例1

患者为肺癌，组织亚型为腺癌，胸内切除手术后1个月。CT阴性，血清检测CEA明显高于正常水平。并且，此患者有其它相关临床表征，如背痛、咳嗽、胸痛等。用药后症状明显减轻。

用流式细胞术对CTC含量的定量分析如图5所示。左图R2中的信号(89个)为荧光标记的叶酸探针标记的阳性肺癌CTC，而右图R3中的信号(596个)为外参Fluospheres。用方法中的计算公式，可以计算出此患者4mL血中的CTC量：89/596×1,000＝149个。

(2)病例2

患者为肺癌，组织亚型为鳞癌，胸内切除手术后1个月。

采用本发明的荧光标记的叶酸探针标记后用流式细胞术检测，此病人CTC含量为0。随访跟踪到6个月，患者无复发临床表征。

(3)病例3

患者为乳腺癌，组织亚型为管状A型，一线治疗前。CA15-3血清检测阳性(120U/mL)，病理分期IIA。

采用本发明制备的荧光标记的Herceptin(Trastuzumab)抗体标记后用流式细胞术对CTC含量的定量分析如图6所示。左图R2中的信号(15个)为Herceptin抗体探针标记的阳性乳癌CTC，而右图R3中的信号(712个)为外参Fluospheres。根据流式细胞定量分析的计算公式，可以计算此患者4mL血中的CTC含量：15/712×1,000＝21个。

(4)病例4

患者为肺癌，组织亚型为腺癌，一线治疗前。CT阳性，血清检测CA125阳性。用药后症状明显减轻。

采用本发明制备的荧光标记的叶酸探针标记后用流式细胞术对化疗前后患者血液中CTC的含量分析图7所示。上图为一线化疗前，下图为化疗后。左上角R2中的信号(123个)和左下角R2中的信号(18个)为叶酸探针标记的阳性肺癌CTC，而右上角R3中的信号(512个)和右下角R3中的信号(756个)为外参Fluospheres。根据流式细胞定量分析的计算公式，可以计算此患者在化疗前4mL血中的CTC含量：123/512×1,000＝236个；而化疗后CTC含量下降到：18/756×1,000＝24个。

(5)病例5

患者为确诊为前列腺癌的病例。采用本发明制备的变异型LHRH-四聚氧乙烯双胺探针标记该病例，以证明该探针的效果。

结果如图8，图中红色标记的为因结合Alexa Fluor 647标记的LHRH-四聚氧乙烯双胺探针而显色的前列腺癌细胞。

结论

如上所述，本发明人的研究数据表明肿瘤特异性探针加上定量流式细胞术的平台可以用来定量分析CTC在患者血样中的含量。因此，此技术对临床肿瘤诊断有如下应用：a)早期诊断癌症，b)动态监控病情，c)监控复发，d)用于判断化疗疗效和指导用药。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。