基于小核酸药物成骨治疗的骨靶向递送系统及其制备方法

摘要

本发明提供了一种基于小核酸药物成骨治疗的骨靶向递送系统及其制备方法。该骨靶向递送系统包括脂质体、骨靶向分子和小核酸药物，所述骨靶向分子选自双磷酸盐、8个天门冬氨酸多肽重复序列、6个天门冬氨酸-丝氨酸-丝氨酸多肽重复序列和针对成骨样细胞筛选出的适配子中的一种或几种，所述小核酸药物选自具有促进骨形成功能的小干扰核糖核酸、微小核糖核酸的模拟物和微小核糖核酸的阻断剂中的一种或几种。本发明相比传统的骨靶向递送系统具有更强的专属性和特异性，小核酸药物转染效率高，能够达到较高的沉默效率。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种基于小核酸药物成骨治疗的骨靶向 递送系统及其制备方法。

背景技术

骨组织发生的基本过程包括骨组织形成和骨组织吸收两个方面。成骨细胞和 破骨细胞分别负责骨形成和骨吸收，两者之间的平衡保证了成年动物及人类骨 量的恒定。

目前，骨靶向药物递送系统主要运用于小分子药物的递送，通常由骨靶向分 子和小分子药物/高分子化合物组成。常见的骨靶向分子包括四环素类，双磷酸 盐类，以及含有天门冬氨酸重复序列的多肽。这些靶向分子可直接与小分子药 物如雌二醇，布洛芬等共价连接，也可以与高分子化合物如聚乳酸-羟基乙酸共 聚物，聚乙二醇等连接形成载体系统携载药物。这些骨靶向分子介导的骨组织 分布情况有所不同。据报道，双磷酸盐类既靶向骨形成表面又靶向骨吸收表面， 而天门冬氨酸重复序列主要靶向骨吸收表面。然而，能够特异性靶向骨形成表 面的药物递送系统还未见报道。

过去的几年里，骨生物学得到了快速的发展，一系列负调控骨形成且不激活 骨吸收的基因被鉴定出来，这包括酪蛋白激酶相互作用蛋白1(CKIP-1)、WIF-1 和Hoxc8等。这使得通过核糖核酸干扰(RNAi)等技术手段利用小核酸药物沉 默上述负调控骨形成的基因，从而进行骨治疗成为可能。然而，成骨样细胞主 要分布在骨形成表面，而且在使用小核酸药物进行成骨治疗时，成骨样细胞是 主要的作用靶点，所以特异性靶向骨形成表面以及成骨样细胞尤为重要。

另外，由于小核酸药物需要在细胞浆里释放并与mRNA作用，普通的高分 子材料很难确保有较高的转染效率，所以递送小分子药物的骨靶向递送系统并 不适用于小核酸药物。

发明内容

为解决上述问题，本发明通过采用针对骨形成表面以及成骨样细胞的骨靶向 分子、抑制负调控骨形成的小核酸药物和有助于小核酸药物转染的脂质体连接， 提供了一种基于小核酸药物成骨治疗的骨靶向递送系统及其制备方法。本发明 相比传统的骨靶向递送系统具有更强的专属性和特异性，小核酸药物转染效率 高，能够达到较高的沉默效率。

一方面，本发明提供了一种基于小核酸药物成骨治疗的骨靶向递送系统，包 括脂质体、骨靶向分子和小核酸药物，其中，骨靶向分子选自双磷酸盐、SEQ ID NO：1(8个天门冬氨酸多肽重复序列(Asp)₈)、SEQ ID NO：2(6个天门冬氨 酸-丝氨酸-丝氨酸多肽重复序列(Asp-Ser-Ser)₆，即(DSS)₆)和针对成骨样细胞筛 选出的适配子中的一种或几种，小核酸药物选自具有促进骨形成功能的小干扰 核糖核酸(siRNA)、微小核糖核酸(miRNA)的模拟物(microRNAmimic)和 微小核糖核酸的阻断剂(Antagomir)中的一种或几种。

其中，脂质体含有非阳离子脂质，或者含有非阳离子脂质和阳离子脂质的混 合物。优选地，所述脂质体中阳离子脂质占总脂质含量的0％～50％，非阳离子 脂质占总脂质含量的50％～100％。

阳离子脂质为一类带正电荷的磷脂，通常与一种或几种中性脂质组成阳离子 脂质体。阳离子脂质体中使用的中性脂质成分上与常规脂质体相似，如胆固醇 (chol)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)等。优选地，阳离子脂质选 自1，2-二油烯氧基-3-三甲氨基丙烷(DOTAP)、N-[1-(2，3-二油基氧)丙基]-N， N，N，-氯化三甲铵(DOTMA)、和DC-胆固醇(DC-Chol)的一种或几种。

非阳离子脂质包括不带电荷和带负电荷的脂质。优选地，非阳离子脂质选自 二油酰二甲基铵丙烷(DODAP)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰磷 脂酰胆碱(DSPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC) 和DLin-KC2-DMA中的一种或几种。

脂质体中可含有中性脂质胆固醇等辅助脂质和/或聚乙二醇(PEG)等修饰 剂。PEG修饰脂质体具有良好的水溶性、毒性低、无免疫原性等优势。因为PEG 末端可以进行羧酸、胺或马来酰亚胺基团等活性基团修饰，便于进一步与骨靶 向分子连接，所以PEG修饰脂质适合用作于连接反应的起始剂。优选地，PEG 修饰脂质带有甲氧基末端，例如DSPE-mPEG。

优选地，骨靶向递送系统含有二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰 亚胺。优选地，脂质体(PEG修饰脂质)含有二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇 2000-马来酰亚胺(DSPE-PEG-MAL)，末端的活性马来酰亚胺基团有利于在脂 质体表面进行修饰。也优选地，当脂质体中不含有二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙 二醇2000-马来酰亚胺(DSPE-PEG-MAL)时，骨靶向分子可预先与二硬脂酰磷 脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺(DSPE-PEG-MAL)进行共价键连接， 然后以胶束的形式插入脂质双分子层中。

骨靶向分子可以选自双磷酸盐、天门冬氨酸多肽重复序列或针对成骨样细胞 筛选出的适配子中的一种或几种。天门冬氨酸多肽重复序列可以选自SEQ ID NO：1(8个天门冬氨酸多肽重复序列(Asp)₈)和SEQ ID NO：2(6个天门冬氨 酸-丝氨酸-丝氨酸多肽重复序列(DSS)₆)中的一种或几种。

优选地，骨靶向递送系统含有二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰 亚胺以及所述骨靶向分子末端进行巯基修饰。此时，优选地，骨靶向分子直接 连接于所述脂质体表面：骨靶向分子末端的巯基可以与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺- 聚乙二醇2000-马来酰亚胺中的马来酰亚胺基团直接反应。以及优选地，骨靶向 分子与其它分子连接后以胶束的形式插入所述脂质体双分子层：骨靶向分子末 端的巯基可以与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺残端的顺丁 烯二酞亚胺反应，形成硫醚键，骨靶向分子与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇 2000-马来酰亚胺的共价键连接化合物以胶束的形式插入脂质体双分子层(二硬 脂酰磷脂酰乙醇胺部分插入脂质双分子层中)，从而使脂质体具有骨靶向性。

优选地，骨靶向分子为SEQ ID NO：2(6个天门冬氨酸-丝氨酸-丝氨酸多肽 重复序列(DSS)₆)。

优选地，骨靶向分子占脂质体浓度的2～10mol％。

适配子(aptamer)是针对成骨样细胞进行筛选获得的与其具有特异性结合的 单链DNA或者RNA。优选地，和成骨样细胞具有特异性结合地适配子选自： SEQ ID NO：4(5’-GTACTTCCGGCGGGTTCTATGGGCCCTGTCTCCCTTCCC AAAAGTGCACGCTAC-3’)，以及SEQ ID NO：5(5′-GTACTTCCGACTTGGGGC GGGTTTGTTGCTGGCTGTCGGC AAAAGTGCA-3′)。

小核酸药物选自具有促进骨形成功能的小干扰核糖核酸(siRNA)、微小核 糖核酸(miRNA)的模拟物(microRNA mimic)或微小核糖核酸的阻断剂 (Antagomir)。小核酸药物被包封在递送系统中，可作用于靶向目标，抑制负调 控骨形成的基因表达。优选地，小核酸药物与脂质体的脂质质量比为2％～20％。

优选地，小干扰核糖核酸为针对成骨的负调控基因的小干扰核糖核酸。更优 选地，小干扰核糖核酸为针对酪蛋白激酶相互作用蛋白1(CKIP-1)、WIF-1或 Hoxc8的小干扰核糖核酸。以及优选地，小干扰核糖核酸为针对酪蛋白激酶相互 作用蛋白1(CKIP-1)的小干扰核糖核酸。再优选地，针对CKIP-1的小干扰核 糖核酸包含SEQ ID NO：3(5-CCUGAGUGACUAUGAGAAG-3)。

由于微小核糖核酸的模拟物和微小核糖核酸的阻断剂是较短的碱基序列，与 小干扰核糖核酸在化学性质上具有较高的相似性，所以携带小干扰核糖核酸的 骨靶向载体同样适用于微小核糖核酸的模拟物和微小核糖核酸的阻断剂。

第二方面，本发明提供了一种基于小核酸药物成骨治疗的骨靶向递送系统的 制备方法，包括以下步骤：

(1)制备含有小核酸药物的脂质体：取脂质溶解在乙醇中，在搅拌状态下 缓慢加至含有小核酸药物的缓冲液溶液中，采用挤出仪对脂质体进行挤出，透 析去除乙醇，小核酸药物选自具有促进骨形成功能的小干扰核糖核酸、微小核 糖核酸的模拟物和微小核糖核酸的阻断剂中的一种或几种；

(2)连接骨靶向分子和含有小核酸药物的脂质体：将骨靶向分子与含有小 核酸药物的脂质体混合连接，制得骨靶向小核酸药物脂质体，骨靶向分子选自 双磷酸盐、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和针对成骨样细胞筛选出的适配子 中的一种或几种；

(3)纯化骨靶向小核酸药物脂质体。

其中，步骤(1)为制备含有小核酸药物的脂质体。优选地，将脂质按一定 比例溶解在乙醇中，缓慢加入快速搅拌状态下的含有小核酸药物的枸橼酸盐缓 冲液溶液(10～50mM，pH值为3.5～5.5)中；搅拌10～30分钟后，采用挤出仪 对脂质体进行挤出，室温下在pH值为6.8～7.5的磷酸盐缓冲溶液中透析2～4小 时去除乙醇，即得含有小核酸药物的脂质体。优选地，在制备含有小核酸药物 的脂质体时乙醇在总体积中所占比例为30％～40％。高含量的乙醇使得脂质体具 有变形能力，降低脂质体的界面张力，从而使其流动性增加。

优选地，所述脂质体含有非阳离子脂质，或者含有非阳离子脂质和阳离子脂 质的混合物。更优选地，所述脂质体中阳离子脂质占总脂质含量的0％～50％， 非阳离子脂质占总脂质含量的50％～100％。

阳离子脂质为一类带正电荷的磷脂，通常与一种或几种中性脂质组成阳离子 脂质体。阳离子脂质体中使用的中性磷脂成分上与常规脂质体相似，如胆固醇 (chol)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)等。优选地，阳离子脂质选 自1，2-二油烯氧基-3-三甲氨基丙烷(DOTAP)、N-[1-(2，3-二油基氧)丙基]-N， N，N，-氯化三甲铵(DOTMA)和DC-胆固醇(DC-Chol)的一种或几种。

非阳离子脂质包括不带电荷和带负电荷的脂质。优选地，非阳离子脂质选自 二油酰二甲基铵丙烷(DODAP)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰磷 脂酰胆碱(DSPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC) 和DLin-KC2-DMA中的一种或几种。

脂质体中可含有中性脂质胆固醇等辅助脂质和/或聚乙二醇(PEG)等修饰 剂。优选地，PEG修饰脂质体含有二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来 酰亚胺(DSPE-PEG-MAL)，末端的马来酰亚胺基团有利于脂质体的表面修饰。

优选地，小核酸药物与含有小核酸药物的脂质体中脂质的质量比为 2％～20％。小核酸药物选自具有促进骨形成功能的小干扰核糖核酸、微小核糖核 酸的模拟物和微小核糖核酸的阻断剂中的一种或几种。

优选地，小干扰核糖核酸为针对成骨的负调控基因的小干扰核糖核酸。更优 选地，小干扰核糖核酸为针对酪蛋白激酶相互作用蛋白1(CKIP-1)、WIF-1或 Hoxc8的小干扰核糖核酸。以及优选地，小干扰核糖核酸为针对酪蛋白激酶相互 作用蛋白1(CKIP-1)的小干扰核糖核酸。再优选地，针对CKIP-1的小干扰核 糖核酸包含SEQ ID NO：3(5-CCUGAGUGACUAUGAGAAG-3)。

将含有小核酸药物的脂质体通过双层聚碳酸酯膜挤出，从而控制粒径在 50～150nm。

步骤(2)中，骨靶向分子选自双磷酸盐、天门冬氨酸多肽重复序列和针对 成骨样细胞筛选出的适配子中的一种或几种。天门冬氨酸多肽重复序列可以选 自SEQ ID NO：1(8个天门冬氨酸多肽重复序列(Asp)₈)或SEQ ID NO：2(6 个天门冬氨酸-丝氨酸-丝氨酸多肽重复序列(DSS)₆)。

优选地，骨靶向分子末端进行巯基修饰。

优选地，当含有小核酸药物的脂质体中含有聚乙二醇(PEG)修饰脂质体- 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺(DSPE-PEG-MAL)时，骨 靶向分子直接连接于所述脂质体表面。

优选地，当脂质体中不含有聚乙二醇(PEG)修饰脂质体-二硬脂酰磷脂酰 乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺(DSPE-PEG-MAL)时，步骤(2)所述混合 进一步包括加入二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺，预先将骨靶 向分子与DSPE-PEG-MAL进行化学反应，生成骨靶向分子与DSPE-PEG-MAL 的共价键连接化合物，该化合物可在水溶液中形成胶束，与含有小核酸药物的 脂质体孵育4～12小时后插入脂质双分子层，使得骨靶向分子连接于所述脂质体 表面。

优选地，骨靶向分子为SEQ ID NO：2(6个天门冬氨酸-丝氨酸-丝氨酸多肽 重复序列(DSS)₆)。

优选地，骨靶向分子占脂质体浓度的2～10mol％。

适配子(aptamer)是针对成骨样细胞进行筛选获得的与其具有特异性结合的 单链DNA或者RNA。优选地，和成骨样细胞具有特异性结合地适配子选自： SEQ ID NO：4(5’-GTACTTCCGGCGGGTTCTATGGGCCCTGTCTCCCTTCCC AAAAGTGCACGCTAC-3’)，以及SEQ ID NO：5(5′-GTACTTCCGACTTGGGGC GGGTTTGTTGCTGGCTGTCGGC AAAAGTGCA-3′)。

步骤(3)为除去未反应的骨靶向分子以及未插入脂质体的胶束分子。纯化 方法可以为通过Sepharose CL-4B柱进行分子大小排除层析。优选地，步骤(3) 中的纯化的骨靶向脂质体可进一步进行冻干，制成冻干粉末保存。更优选地， 冻干时加入冻干保护剂，选自蔗糖，甘露醇，乳糖，海藻糖，白蛋白，葡糖糖， 右旋糖酐中的一种或几种。

第三方面，本发明提供了另外一种基于小核酸药物成骨治疗的骨靶向递送 系统的制备方法，与本发明第二方面的区别在于，在步骤(1)中先制备空白脂 质体，连接骨靶向分子后冻干，加入小核酸药物磷酸盐缓冲溶液进行水化。具 体包括以下步骤：

(1)制备空白脂质体：将脂质溶解在氯仿中，旋转蒸发除去有机溶剂后， 加缓冲液进行水化，采用挤出仪对多层脂质体进行挤出，制得空白脂质体；

(2)连接骨靶向分子和空白脂质体：取骨靶向分子与空白脂质体混合连接， 反应生成骨靶向空白脂质体，骨靶向分子选自双磷酸盐、SEQ ID NO：1(8个 天门冬氨酸多肽重复序列(Asp)₈)、SEQ ID NO：2(6个天门冬氨酸-丝氨酸-丝氨 酸多肽重复序列(DSS)₆)和针对成骨样细胞筛选出的适配子中的一种或几种；

(3)纯化骨靶向空白脂质体以及冻干；

(4)包封小核酸药物：将小核酸药物溶于经DEPC处理的蒸馏水中，加入 冻干骨靶向空白脂质体进行水化，制得骨靶向小核酸药物脂质体递送系统，小 核酸药物选自具有促进骨形成功能的小干扰核糖核酸、微小核糖核酸的模拟物 和微小核糖核酸的阻断剂中的一种或几种。

步骤(2)中，优选地，骨靶向分子末端进行巯基修饰。优选地，空白脂质 体含有二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺，骨靶向分子直接与空 白脂质体孵化连接于所述空白脂质体表面。

也优选地，当步骤(2)所述空白脂质体不含有二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙 二醇2000-马来酰亚胺时，步骤(2)所述混合进一步包括加入二硬脂酰磷脂酰 乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺，预先将骨靶向分子与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 -聚乙二醇2000-马来酰亚胺进行化学反应，生成骨靶向分子与二硬脂酰磷脂酰乙 醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺的共价键连接化合物，所述化合物在水溶液中形 成胶束，与空白脂质体孵育4～12小时后插入脂质双分子层。

优选地，步骤(2)骨靶向分子为SEQ ID NO：2。

优选地，步骤(2)骨靶向分子占所述空白脂质体中脂质浓度的2～10mol％。

步骤(3)中，先制备小核酸药物缓冲盐溶液，水化所述冻干粉末，孵育20～40 分钟后，制得骨靶向小核酸药物脂质体系统。优选地，小核酸药物缓冲盐溶液 为10～50mM磷酸盐缓冲液，pH值为6.8～7.5。

优选地，小核酸药物与所述空白脂质中脂质质量比为2％～20％。小核酸药物 选自具有促进骨形成功能的小干扰核糖核酸、微小核糖核酸的模拟物和微小核 糖核酸的阻断剂中的一种或几种。

优选地，小干扰核糖核酸为针对成骨的负调控基因的小干扰核糖核酸。更优 选地，小干扰核糖核酸为针对酪蛋白激酶相互作用蛋白1(CKIP-1)、WIF-1或 Hoxc8的小干扰核糖核酸。以及优选地，小干扰核糖核酸为针对酪蛋白激酶相互 作用蛋白1(CKIP-1)的小干扰核糖核酸。再优选地，针对CKIP-1的小干扰核 糖核酸包含SEQ ID NO：3(5-CCUGAGUGACUAUGAGAAG-3)。

其它物质组分、含量和连接过程均同前文所述。

本发明通过采用针对骨形成表面以及成骨样细胞的骨靶向分子、抑制负调控 骨形成的小核酸药物和有助于小核酸药物转染的脂质体连接，提供了一种基于 小核酸药物成骨治疗的骨靶向递送系统及其制备方法，具有以下有益效果：主 要针对骨形成表面以及成骨样细胞进行靶向，具有较强的专属性；可防止小核 酸药物被体内物质降解，可将其特异性传递到靶细胞中，转染效率高，有利于 小核酸药物达到较高的沉默效率。

附图说明

图1为标记FITC的(DSS)₆和Asp₈以及对照组在骨形成表面的荧光分布图；

图2为携带FAM荧光标记的本发明骨靶向小核酸药物脂质体递送系统以及 对照组在体内骨靶向性验证实验中各器官的荧光强度图；

图3～图7为FAM荧光标记的siRNA和相应抗体(anti-RUNX2、COL1A1、 anti-ALP、anti-osteocalcin和OSCAR)标记各种细胞的免疫组化分析结果图。

具体实施方式

以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技 术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这 些改进和润饰也视为本发明的保护范围。下列具体实施方式中如果未注明具体 条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这 种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如Sambrook等人，分子克隆：实验 手册中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例一(DSS)₆能够选择性靶向骨形成表面

选用18只6月龄雌性大鼠(Sprague-dawley)，分成FITC组(异硫氰酸荧 光素，n＝6)、Asp₈组(n＝6)和(DSS)₆组(n＝6)。Asp₈和(DSS)₆均分别标记上 FITC。提前3天对大鼠进行皮下注射，注射Xylenol Orange(XO，30mg/kg)标 记骨形成表面。使用氯胺酮(75mg/kg)和二甲苯胺噻嗪(10mg/kg)麻醉大鼠 后，将FITC、Asp₈-FITC和(DSS)₆-FITC分别通过尾部静脉注射给药，27μ M/kg/0.2ml生理盐水。24小时后杀死大鼠观察未钙化组织部分。用梯度浓度的 乙醇将股骨和胫骨脱水，用改性甲基丙烯酸甲酯包埋(不脱钙)。使用Leica SM2500E mocrotome(Leica Microsystems)将股骨切片成15μm的厚度。然后， 通过共聚焦显微镜(LSM510，Carl Zeiss，Oberkocken，Germany)观察FITC的荧 光分布。

结果如图1所示，FITC自身在切片中没有显示出绿色荧光，表明没有骨靶 向性，然而(DSS)₆-FITC的绿色荧光带与标记骨形成表面的红色荧光带有很好的 重合，表明(DSS)₆主要到达骨形成表面。Asp₈-FITC的绿色荧光带没有与红色荧 光带重合，主要分布在表面呈蚕食状和坑状凹陷的骨吸收表面。

实施例二制备骨靶向小核酸药物脂质体递送系统

(1)制备含有小核酸药物的脂质体：取二油酰二甲基铵丙烷(DODAP)， 二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、胆固醇(Chol)、DSPE-mPEG2000(甲氧基为 末端的PEG)按40∶10∶45∶5的摩尔比溶解在乙醇中，缓慢加入快速搅拌中的 1mg/mL的小干扰核糖核酸随机序列的橼酸盐缓冲液(pH值为4)，乙醇占总体 积的35％，siRNA与脂质的质量比为10％。在室温下搅拌20分钟后采用挤出仪 对脂质体进行挤出，通过孔径为0.08μm的双层聚碳酸酯膜，控制粒径在 50～100nm。在室温下将该脂质体在pH7.4的缓冲盐溶液中透析3小时去除乙醇 和未包封的小干扰核糖核酸。

(2)连接骨靶向分子和含有小核酸药物的脂质体：将二硬脂酰磷脂酰乙醇 胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺(DSPE-PEG-MAL)溶于氯仿中，在氮气环境中 蒸发除去有机溶剂后，取末端带有巯基基团(-SH)的骨靶向分子8个天门冬氨 酸多肽重复序列(Asp)₈，按摩尔比为4∶1与DSPE-PEG-MAL混合，在10mM磷 酸盐缓冲液中4℃孵育过夜。采用高效液相色谱法和Ellman试剂监测反应的进 行。通过磷酸盐分析检测脂质体的脂质浓度，然后取2mol％(相对总脂质浓度) 的DSPE-PEG2000-(Asp)₈以胶束的形式插入到脂质体表面，37℃水浴孵育6小 时后，制得骨靶向小核酸药物脂质体递送系统。

(3)纯化骨靶向小核酸药物脂质体递送系统

通过Sepharose CL-4B柱进行分子大小排除层析，采用磷酸盐缓冲液进行洗 脱，除去未插入脂质体的胶束以未连接的骨靶向分子。

(4)冷冻干燥：取骨靶向小核酸药物脂质体0.5ml，用0.5ml含有乳糖的蒸 馏水稀释(乳糖：脂质体摩尔比为10)后，使用冷冻冻干机(Labconco，Freezezone 6，USA)冻干48小时，制得骨靶向小核酸药物脂质体冻干粉。

实施例三制备骨靶向小核酸药物脂质体递送系统

(1)制备空白脂质体：将N-(1-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基 氯化铵(DOTAP)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、胆固醇(Chol)、二硬脂酰 磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-mPEG2000)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚 乙二醇2000-马来酰亚胺(DSPE-PEG-MAL)按摩尔比42∶15∶38∶3∶2溶解于氯仿 中，采用薄膜分散法，旋转蒸发除去氯仿后，加入10mM磷酸盐缓冲液进行水 化形成多层脂质体，采用挤出仪对多层脂质体进行挤出，制得大单室空白脂质 体；

(2)连接骨靶向分子和空白脂质体：取末端带有巯基的骨靶向分子 (DSS)₆-SH(相对于空白脂质体中DSPE-PEG-MAL摩尔比为3∶1)与空白脂质体混 合，在室温条件下孵化3小时，形成骨靶向空白脂质体。

(3)纯化骨靶向空白脂质体以及冻干：采用Sepharose CL-4B柱进行分子 大小排除层析或者在磷酸盐缓冲液(pH 7.4)透析除去游离的(DSS)₆。取经纯化 后的骨靶向空白脂质体0.5ml，脂质浓度约20umol/ml，采用0.5ml含有蔗糖的 蒸馏水稀释(蔗糖：脂质体摩尔比为8)后，使用冷冻冻干机(Labconco，Freezezone 6，USA)冻干48小时，制得骨靶向空白脂质体冻干粉。

(4)包封小核酸药物：

加入0.75mg/ml的SEQ ID NO：3DEPC水溶液0.5ml水化冻干脂质体， 室温下孵育20分钟，制得骨靶向小核酸药物脂质体递送系统。

实施例四制备骨靶向小核酸药物脂质体递送系统

(1)制备含有小核酸药物的脂质体：取DLin-KC2-DMA，二棕榈酰磷脂酰 胆碱(DPPC)、胆固醇(Chol)、DSPE-mPEG2000(甲氧基为末端的PEG)按 42∶10∶44∶4的摩尔比溶解在乙醇中，缓慢加入快速搅拌中的0.5mg/mL SEQ ID NO：3的橼酸盐缓冲液(pH值为4)，乙醇占总体积的35％，siRNA与脂质的 质量比为8％。在室温下搅拌20分钟后采用挤出仪对脂质体进行挤出，通过孔 径为0.08μm的双层聚碳酸酯膜，控制粒径在50～100nm。在室温下将该脂质体 在pH7.4的缓冲盐溶液中透析3小时去除乙醇和未包封的小干扰核糖核酸。

(2)连接骨靶向分子和含有小核酸药物的脂质体：将二硬脂酰磷脂酰乙醇 胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺(DSPE-PEG-MAL)溶于氯仿中，在氮气环境中 蒸发除去有机溶剂后，取末端带有巯基基团(-SH)的骨靶向分子适配子序列SEQ ID 4，按摩尔比为2∶1与DSPE-PEG-MAL混合，在10mM磷酸盐缓冲液中4 ℃孵育过夜。通过磷酸盐分析检测脂质体的脂质浓度，然后取2mol％(相对总 脂质浓度)的DSPE-PEG2000-适配子以胶束的形式插入到脂质体表面，37℃水 浴孵育6小时后，制得骨靶向小核酸药物脂质体递送系统。

(3)纯化骨靶向小核酸药物脂质体递送系统

通过Sepharose CL-4B柱进行分子大小排除层析，采用磷酸盐缓冲液进行洗 脱，除去未插入脂质体的胶束以未连接的骨靶向分子。

实施例五对骨靶向小核酸药物脂质体递送系统的体内验证

将该骨靶向小核酸药物脂质体递送系统进行体内骨靶向性的验证。将该载体 携带FAM荧光标记的SEQ ID NO：3尾静脉注射于大鼠体内，分别与没有载体 携带的siRNA，市售载体系统(in vivo jetPEI)以及自制的不含有骨靶向分子的载 体系统脂质体(liposome)进行比较。静脉注射2小时后，处死大鼠，收集主要 器官(心，肝，脾，肺，肾和股骨)，采用荧光成像系统(Xenogen Imaging  Technologies，Alameda，CA)观察每个器官中的荧光强度。

由图2可见，该发明中的骨靶向小核酸药物脂质体递送系统能显著提高小核 酸药物在骨组织中的累积，同时降低在肝脏器官中的暴露，减少副作用。

实施例六评价骨靶向载体系统的在体细胞选择性

将(DSS)₆-脂质体(liposome)以及脂质体携载FAM荧光标记的SEQ ID NO： 3和没有载体携带的FAM荧光标记的SEQ ID NO：3尾静脉注射于大鼠体内， 4小时后取出远端股骨和近端胫骨，进行冰冻切片和免疫组化分析。采用 anti-RUNX2和anti-type I collagen α1(COLiAl)抗体对骨源细胞分化早期阶段 的未成熟和成熟骨前体细胞进行标记，anti-ALP和anti-osteocalcin抗体对分化后 期的前成骨细胞和成骨细胞进行标记，以及OSCAR抗体对破骨样细胞(前破骨 细胞和成熟的破骨细胞)进行标记。观察FAM荧光标记的siRNA和相应抗体 标记各种细胞的重合情况以说明骨靶向载体的细胞选择性。

由图3～图7可见，(DSS)₆-脂质体携带的siRNA的绿色荧光与成骨样细胞的 红色荧光有很好的重合，重合机率大于脂质体携带的siRNA，但与破骨样细胞 的红色荧光没有重合，而脂质体携带的siRNA绿色荧光与成骨样细胞和破骨样 细胞的红色荧光都有一定的重合，表明(DSS)₆-脂质体具有细胞选择性，有利于 小核酸靶向对成骨样细胞。DAPI荧光和H&E染色指示被成功转染的成骨样细 胞主要分布于骨形成表面及其周边骨髓区域，进一步证实(DSS)6-脂质体可以特 异靶向骨形成表面，并具有一定的细胞选择性。

综上所述，本发明主要针对骨形成表面以及成骨样细胞进行靶向，具有较强 的专属性；可防止小核酸药物被体内物质降解，可将其特异性传递到靶细胞中， 转染效率高，有利于小核酸药物达到较高的沉默效率。