具有抗脂质累积活性的枳壳组分制备方法及用途

摘要

本发明涉及具有抗脂质累积活性的枳壳组分制备方法及用途。具体地，本发明涉及一种枳壳提取物，其中含有柚皮苷和新橙皮苷，并且其中柚皮苷的含量为20%-42%，新橙皮苷的含量为20%-48%。本发明的枳壳提取物，其是通过以下方法制备得到的：将枳壳药材粉碎后加入20%~90%的乙醇，加热回流提取1~3次，合并滤液得提取液，将提取液浓缩成浸膏，并将其与大孔树脂进行拌样，用大孔树脂柱对其进行纯化，收集60~80%乙醇洗脱液，浓缩，经聚酰胺柱纯化，收集20%乙醇洗脱液，经浓缩干燥，即得。该枳壳提取物可用于制备非酒精性脂肪肝治疗药物。

说明书

技术领域

 本发明属中药化学领域，具体地说涉及一种从枳壳中提取的有效组分及其制备方法，以及该组分在制备非酒精性脂肪肝治疗药物中的应用。

背景技术

肝损伤是由多种病因引起且有多种因素参与的复杂过程。肝损伤引发的肝脏疾病已成为常见病、多发病，更为严重的是其引发的肝功能衰竭和肝性脑病等，发病率和死亡率高，极大地威胁着人类健康。很多因素可引起肝损伤。非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD），又称非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver，NAFL），是一种无过量饮酒史，以肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征的临床病理综合征。非酒精性脂肪肝包含一系列的肝脏疾病，从单一的脂肪变性到不同程度的脂肪变性联合坏死和纤维化。而肝细胞内脂质异常累积则是脂肪肝疾病发生的最主要因素。油酸是人体内最为丰富的脂肪酸之一，它参与形成肝脏中的三酸甘油酯并能促进脂滴的形成，油酸诱导HepG2脂肪累积是一种常用的脂质累积细胞模型，可用于评价药物的抗脂质累积作用。

目前，非酒精性脂肪肝治疗方法有很多，且均有一定疗效，但也存在着明显的不足。首先，西药具有较大的毒副作用，且疗效并不确切。而另一方面，实验和临床研究证实，中药在改善肝功能、抗氧化、改善微循环、调节免疫功能以及抗肝纤维化等方面显示出良好的疗效，安全、可靠、有效，进一步显示出中医辨证论治的合理性，突显了中药在治疗称非酒精性脂肪肝方面的良好前景。

枳壳是为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种的干燥未成熟果实，其性味苦、酸，性微寒，主治胸隔痞满、胁肋胀痛、食积不化、脘腹胀满等。现代药理学研究表明，枳壳对胃肠平滑肌呈双向作用，既可兴奋胃肠道平滑肌，又可降低胃肠平滑肌张力；能预防大鼠幽门结扎溃疡形成，具有显著减少胃液分泌量及降低胃蛋白酶活性的作用；此外还具有增加冠脉流量和肾血流血，降低心肌氧耗量等作用。但枳壳组分是否具有抑制肝细胞脂质累积的活性尚不清楚。

发明内容

本发明的目的是提供一种枳壳有效组分，该有效组分主要含有A柚皮苷，B新橙皮苷两种化合物，其中A的含量为20%-42%，B的含量为20%-48%。

优选A的含量为30~40%，B的含量为30~40%。

本发明的另一目的是提供该枳壳有效组分的制备方法，通过以下步骤实现：将枳壳药材粉碎后加入20%~90%的乙醇，加热回流0.8~1.2小时，提取1~3次，合并滤液得提取液，将提取液浓缩成浸膏，并将其与大孔树脂进行拌样，用大孔树脂柱对其进行纯化，收集70%乙醇洗脱液，浓缩后经聚酰胺柱纯化后收集20%乙醇洗脱液，经浓缩干燥后得到有效组分。

本发明的再一个目的是提供该枳壳有效组分在制备非酒精性脂肪肝治疗药物中的应用。

具体地：

本发明第一方面提供了一种枳壳提取物(在本发明中亦可称为枳壳有效组分)，其中含有柚皮苷和新橙皮苷，并且其中柚皮苷的含量为20%-42%，新橙皮苷的含量为20%-48%。在一个实施方案中，柚皮苷的含量为30~40%，新橙皮苷的含量为30~40%。在一个实施方案中，柚皮苷的含量为25~35%，新橙皮苷的含量为20~30%。

本发明第一方面还提供了一种枳壳提取物(在本发明中亦可称为枳壳有效组分)，其中含有柚皮苷和新橙皮苷，并且其中含有20-42重量份的柚皮苷，和含量为20-48重量份的新橙皮苷。在一个实施方案中，该枳壳提取物中含有30-40重量份的柚皮苷，和含量为30-40重量份的新橙皮苷。在一个实施方案中，该枳壳提取物中含有25-35重量份的柚皮苷，和含量为20-30重量份的新橙皮苷。

根据本发明第一方面的枳壳提取物，其是通过以下方法制备得到的：将枳壳药材粉碎后加入20%~90%(例如60-80%，例如65-75%)的乙醇，加热回流提取1~3次，合并滤液得提取液，将提取液浓缩成浸膏，并将其与大孔树脂进行拌样，用大孔树脂柱对其进行纯化，收集60~80%乙醇洗脱液，浓缩，经聚酰胺柱纯化，收集20%乙醇洗脱液，经浓缩干燥，即得。

根据本发明第一方面的枳壳提取物，其是通过以下方法制备得到的：将1500g枳壳加4200ml 70%乙醇提取2h，再加3500ml 70%乙醇提取1.5h，最后加2800ml 70%乙醇提取1h，合并三次提取液，抽滤后浓缩。浓缩液过大孔树脂(D101)，先用水洗脱后，再用20%乙醇洗脱，最后以70%乙醇洗脱。收集70%乙醇洗脱液，浓缩至150ml左右，抽滤，过聚酰胺柱，用20%乙醇洗脱4个柱体积，收集洗脱液；再用40%乙醇洗脱5个柱体积，分10段收集洗脱液，每段500ml。将20%乙醇洗脱段旋蒸，冷冻干燥后称重，即得。

本发明第二方面提供了制备枳壳提取物的方法，其包括以下步骤：将枳壳药材粉碎后加入20%~90%(例如60-80%，例如65-75%)的乙醇，加热回流提取1~3次，合并滤液得提取液，将提取液浓缩成浸膏，并将其与大孔树脂进行拌样，用大孔树脂柱对其进行纯化，收集60~80%乙醇洗脱液，浓缩，经聚酰胺柱纯化，收集20%乙醇洗脱液，经浓缩干燥，即得。

根据本发明第二方面的方法，其包括以下步骤：将1500g枳壳加4200ml 70%乙醇提取2h，再加3500ml 70%乙醇提取1.5h，最后加2800ml 70%乙醇提取1h，合并三次提取液，抽滤后浓缩。浓缩液过大孔树脂(D101)，先用水洗脱后，再用20%乙醇洗脱，最后以70%乙醇洗脱。收集70%乙醇洗脱液，浓缩至150ml左右，抽滤，过聚酰胺柱，用20%乙醇洗脱4个柱体积，收集洗脱液；再用40%乙醇洗脱5个柱体积，分10段收集洗脱液，每段500ml。将20%乙醇洗脱段旋蒸，冷冻干燥后称重，即得。

根据本发明第二方面的方法，其所得枳壳提取物中含有柚皮苷和新橙皮苷，并且其中柚皮苷的含量为20%-42%，新橙皮苷的含量为20%-48%。在一个实施方案中，柚皮苷的含量为30~40%，新橙皮苷的含量为30~40%。在一个实施方案中，柚皮苷的含量为25~35%，新橙皮苷的含量为20~30%。

根据本发明第二方面的方法，其所得枳壳提取物中含有柚皮苷和新橙皮苷，并且其中含有20-42重量份的柚皮苷，和含量为20-48重量份的新橙皮苷。在一个实施方案中，该枳壳提取物中含有30-40重量份的柚皮苷，和含量为30-40重量份的新橙皮苷。在一个实施方案中，该枳壳提取物中含有25-35重量份的柚皮苷，和含量为20-30重量份的新橙皮苷。

本发明第三方面提供了本发明第一方面的枳壳提取物在制备非酒精性脂肪肝治疗药物中的应用。

本发明第四方面提供了一种药物组合物，其中包括本发明第一方面的枳壳提取物以及药学可接受的载体或赋形剂。

本发明的枳壳有效组分可以作为活性部位，加入药剂学上接受的药物赋形剂或载体，按照药剂学上记载的方法制成制剂。

所述药物的制剂形式包括液体制剂、固体制剂、胶囊剂、胶丸剂。包括注射液、滴注液、粉针剂、颗粒剂、片剂、冲剂、散剂、口服液、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口含剂、颗粒剂、丸剂、膏剂、丹剂、喷雾剂、滴丸剂 、崩解剂、口崩片、微丸等。

在本发明中，术语“枳壳组分”可称为“枳壳提取物”或者“枳壳有效组分”等，这些术语可以互换使用。

本发明的有益效果为：

1. 本发明的提取分离工艺简单，能快速准确地得到有效组分。

2. 本发明提供的枳壳有效组分化学成分简单明确，在药理研究上更易于阐明其作用机制，在生产中更易于药物的质量控制。

3. 本发明首次在油酸诱导HepG₂脂肪累积模型上，评价了枳壳提取物对抗脂质累积降脂作用，得到较好的药理活性。

附图说明

图1为本发明枳壳提取物的HPLC分析图。

图2显示了不同浓度枳壳提取物对500uM油酸诱导的HepG2细胞脂质累积的影响。

图3描绘了不同浓度柚皮苷和新橙皮苷对500uM油酸诱导的HepG2细胞脂质累积的影响。

具体实施方式

本发明结合附图和下面实施例进一步详细说明本发明的实质内容，该实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。

实施例一 枳壳有效组分的制备

将1500g枳壳加4200ml 70%乙醇提取2h，再加3500ml 70%乙醇提取1.5h，最后加2800ml 70%乙醇提取1h，合并三次提取液，抽滤后浓缩。浓缩液过大孔树脂(D101)，先用水洗脱后，再用20%乙醇洗脱，最后以70%乙醇洗脱。收集70%乙醇洗脱液，浓缩至150ml左右，抽滤，过聚酰胺柱，用20%乙醇洗脱4个柱体积，收集洗脱液；再用40%乙醇洗脱5个柱体积，分10段收集洗脱液，每段500ml。将20%乙醇洗脱段旋蒸，冷冻干燥后称重，得枳壳组分47.5608g。其用于下文的生物学试验。

实施例二　枳壳有效组分的分析

色谱条件  Agilent 1100型高效液相色谱仪，色谱柱为SB-C₁₈色谱柱；以乙腈-水(20:80)(用磷酸调节pH值至3)为流动相；检测波长为283nm；液相色谱流速为1ml/min，进样量10μl。

供试品溶液的制备  称取本品，用甲醇溶液溶解在容量瓶中，稀释至2mg/ml，摇匀，即得。

测定方法  精密吸取供试品溶液，注入液相色谱仪，依色谱分析条件测定，即得。

分析结果  枳壳有效组分的高效液相色谱分析谱图见图1，两图中保留时间分别为16min和11.5min的色谱峰分别是A、B两个化合物。使用相同色谱条件，分析了柚皮苷和新橙皮苷标准品，发现化合物A与柚皮苷保留时间相同，发现化合物与新橙皮苷保留时间相同，所以鉴定化合物A和B分别是柚皮苷和新橙皮苷。含量测定结果表明，柚皮苷和新橙皮苷在提取物中含量分别为31.2%和25.8%。出人意料地发现，在实施例1中，如果用浓度低于60%的乙醇提取，或者用浓度高于80%的乙醇提取，或者改用其它型号的大孔树脂进行洗脱，化合物A和B获得量分别比实施例1的获得量低33%和30%以上。用65-75%乙醇并且用D101大孔树脂制备时，化合物A和B获得量是实施例1的获得量的93%~115%，并且提取物中化合物A的含量在25-35%之间，化合物B的含量在20-30%之间。

实施例三 枳壳有效组分制剂

取实施例1所得的枳壳有效组分0.5g与10.5g聚乙二醇-6000混合均匀，加热熔融，化料后移至滴丸滴灌中，药液滴至6~8℃液体石蜡中，除油，制得滴丸400粒。

实施例四 枳壳有效组分制剂

取实施例1所得的枳壳有效组分0.5g，磨成细粉，与约1/3的淀粉混匀，加淀粉浆混匀制成软材，16目筛制粒，70℃干燥，干粒过14目筛整粒，加剩余淀粉（预先在100－105 ℃干燥）与吸附有液状石蜡的滑石粉（将轻质液状石蜡喷于滑石粉中混匀），再通过14目筛，压片，即得   实施例五 枳壳有效组分抗脂质累积活性评价

溶待测组分于DMSO中，得50 mg·mL-1储备液，与细胞孵育的终浓度为50 μg·mL-1，在油酸诱导的HepG₂肝细胞模型评价其抑制脂质累积活性。

将生长良好的HepG2细胞以每孔20万细胞的密度接种于24孔细胞培养板中，每孔培养液1ml。待细胞贴壁后（约24小时），分对照组和给药组处理，平行三次实验，对照组中加入0.5mM油酸，给药组中加入0.5mM油酸及75、100、150、200 ug/ml实施例1所得枳壳提取物，于37℃、5%CO₂的条件下培养24h后，弃去每孔上清，酶法测定甘油三酯、总胆固醇含量。测定方法为24孔细胞培养板用预冷PBS500ul洗两次，每孔加入200ul细胞裂解液裂解30min，取裂解总液于1.5ml离心管中，离心10min（12000rpm，4℃），分别取上清液80ul加100ul甘油三酯酶剂测每孔甘油三酯（TG）含量，80ul加100ul胆固醇酶剂测每孔胆固醇（TC）含量，10ul用BCA法测蛋白含量，计算每孔单位蛋白的TG和TC含量（ug/mg蛋白质）。

结果表明，实施例1所得枳壳提取物在50ug/ml，100ug/ml，200ug/ml浓度下有明显的抑制油酸诱导HepG2细胞中甘油三酯累积的作用，并呈量效关系。具体见图2，其描绘了不同浓度枳壳提取物对500uM油酸诱导的HepG2细胞脂质累积的影响，其中纵坐标表示对照的%“枳壳黄酮”即本发明的枳壳提取物。

实施例六 枳壳组分中主要成分的抗脂质累积活性评价

将枳壳组分中主要成分柚皮苷和新橙皮苷配制成10、25、50、100、150、200μmol·L^-1溶液，在油酸诱导的HepG₂肝细胞模型评价其抑制脂质累积活性。结果表明，新橙皮苷在浓度100uμmol·L^-1以上时有明显的抑制油酸诱导HepG₂细胞TG和TC累积的作用，并呈一定的浓度依赖性；柚皮苷在浓度为200μmol·L^-1时有明显的抑制油酸诱导HepG2细胞TG和TC累积的作用。具体见图3，其描绘了不同浓度柚皮苷和新橙皮苷对500uM油酸诱导的HepG2细胞脂质累积的影响，其中纵坐标表示对照的%。