治疗HIV感染及AIDS相关症状的融合蛋白及方法

摘要

本发明公开了使用融合蛋白的药物组合物和方法，所述融合蛋白包括一种超氧化物歧化酶和一种转导肽。本发明还公开了药物组合物和方法，其使用所述融合蛋白联合其它抗逆转录病毒药物治疗AIDS或HTV感染病人。

说明书

技术领域

此发明主要涉及蛋白转导结构域(PTD)和超氧化物歧化酶的融合蛋 白以及它们在阻止病毒感染，尤其是人类免疫缺陷病毒(HIV)对哺乳动 物细胞的感染，降低或阻止CD4+T细胞的耗损以及改善病人症状，提高 病人生活质量方面的应用。

背景技术

导致艾滋病(AIDS，获得性免疫缺陷综合症)的人类免疫缺陷病毒 (HIV)感染虽然是一种相对较新的人群感染，但已经迅速成为世界首要 的健康问题。HIV/AIDS在非洲撒哈拉沙漠以南地区是导致死亡的主要原 因，也是世界第四大疾病杀手。虽然一些好的治疗方法能延长HIV感染者 的生命，但是治愈此疾病的方法却仍然没有。

HIV侵染CD4+细胞，导致CD4+细胞进行性损耗，引起机会性感染而 发病，甚至死亡。AIDS的具体发病机理虽然众说纷纭，但是现在一种比 较公认的观点是病毒感染引发的伴随着过量氧自由基产生的氧化应激能 激活人体免疫系统(称为免疫激活，immune activation)，继而导致CD4+ 细胞的进行性损耗(Wanchu等，2009，AIDS Research and Human  Retroviruses 25(12)：1307-1311；Polyakov等，Int Conf AIDS，1992 Jul 19-24； 8：32(文摘no.PuA 6129))。还有报道，氧自由基和HIV病毒复制有关 (Oxidative stress and HIV infection：target pathways for novel therapies？ Future HIV Therapy，2(4)：327-338，2008)。超氧化物歧化酶(SOD)是最重 要的抗氧化酶，它能够催化超氧阴离子自由基歧化生成毒性较低的过氧化 氢和分子氧。因而，它被用来治疗各种与氧自由基相关的疾病(Winterbourn， 1993，Free Radical Biology & Medicine，14：85-90)。研究表明，感染HIV 病毒tat基因的HeLa细胞的SOD基因表达受到明显抑制；抗氧化酶的减 少导致血浆巯基迅速耗尽(Flores et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1993；90； 7632-7636)。卵磷脂化SOD(PC-SOD)被发现能够抑制MT-4细胞中的人 HIV-1和HIV-2型病毒(Premanathan，et al.AIDS research and human  retroviruses，13(4)，1997)。

当前的抗HIV药物以HIV病毒生活周期的几个不同时期以及HIV复 制及存活所需要的一些酶为靶点。一些常用的抗HIV药物包括核苷类逆转 录酶抑制剂(如ddi、AZT、d4T、3TC和替诺福韦)，非核苷逆转录酶抑 制剂(如奈韦拉平、施多宁和地拉韦啶)，蛋白酶抑制剂(如沙奎那韦、安瑞 那韦、洛匹那韦和茚地那韦)。然而，对于很多HIV感染者，这些抗病毒 药单独或联合作用均不能有效阻止慢性感染或治疗急性AIDS。HIV病毒 的高突变率以及随之出现的HIV毒株的耐药性是导致无法有效治疗HIV 感染的一个重要因素。而且，现代的抗HIV药物售价高昂。另外，当前可 用的HIV抗病毒药物大多数显示线粒体毒性(Lewis，1995，Mitochondrial  toxicity of antiviral drugs，Nature Med 1：417-422)。例如，AZT(齐多夫定) 的线粒体毒性是由于氧自由基导致线粒体DNA发生突变而引起的 (Hayakawa et al.，Biochem Biophys Res Commun，1991，176：87-93)。

尽管氧自由基被报道与HIV复制和CD4+T细胞破坏有关，一些抗氧 化剂的临床试验发现需要进一步的试验来确定它们是否对HIV感染者有 益(Effect of N-acetylcysteine(NAC)treatment on HIV-1infection：a  double-blind placebo-controlled trial，European Journal of Clinical  Pharmacology，50(6)：457-461，1996；Improvement of immune functions in HIV  infection by sulfur supplementation：Two randomized trials，Journal of  Molecular Medicine，78(1)：55-62，2000；Restoration of Blood Total Glutathione  Status and Lymphocyte Function Following α-Lipoic Acid Supplementation in  Patients with HIV Infection，The Journal of Alternative and Complementary  Medicine，14(2)：139-146，2008)。

因此，我们需要一种针对HIV感染的便宜且有效的治疗和预防措施。 此措施应该易于对那些易感染和已感染人群实施。本发明用于解决这些问 题以及现有技术存在的问题。

发明概述

本发明涉及蛋白转导结构域(PTD)和超氧化物歧化酶(SOD)融合 蛋白及任选地作为融合蛋白一部分的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的组合物 和使用方法的发现，还有它们在抑制哺乳动物细胞的病毒感染，尤其是人 HIV感染中的应用。特别是，本发明涉及包含融合蛋白的组合物及利用这 些组合物抑制哺乳动物细胞和病人中HIV-1感染的方法。

因此，本发明一方面提供了一种治疗或抑制人类患者的人免疫缺陷病 毒(HIV)感染或获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的方法。此方法涉及治 疗有效量的一种融合蛋白或其药物组合物的给药，所述融合蛋白包括超氧 化物歧化酶(SOD)和转导肽。此转导肽的羧基端与SOD的氨基端相连， 反之转导肽的氨基端与SOD的羧基端相连。实验显示，经过融合蛋白或 其药物组合物治疗的人类患者与未经治疗的人类患者相比，其HIV RNA 产量和CD4+T细胞损耗均减小，并且症状和体征及生活质量得到改善。 SOD可为含铜/锌SOD(Cu-Zn-SOD)，含锰SOD(Mn-SOD)或含铁SOD (Fe-SOD)。在一个实施方案中，SOD为Cu-Zn-SOD。所用转导肽具有以 下序列：YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO.3)，YGRKKKKQRR(SEQ ID  NO.4)，YGRKKR(SEQ ID NO.5)，RKKRRQRRR(SEQ ID NO.6)， RRRRRRRRR(SEQ ID NO.7)及其他多聚精氨酸(含5-30个氨基酸残基)， AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO.8)，AVLLPVLLAAP(SEQ ID NO.9)， VTVLALGALAGVGVG(SEQ ID NO.10)，GALFLGFLGAAGS TMGA(SEQ  ID NO.11)，WGLGLHLLVLAAALQGAMGLGLHLLLAAALQGA(SEQ ID  NO.12)，WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA(SEQ ID  NO.13)，WEAALAEALAEALAEHLAEALALEALAA(SEQ ID NO.14)， LARLLARLLARLLRALLRALLRAL(SEQ ID NO.15)， KLLKLLLKLWKLLLKLLK(SEQ ID NO.16)，RQIKIWFQRRMKKWK (SEQ ID NO.17)，DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASPPRRPVE (SEQ ID NO.18)，GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL(SEQ ID  NO.19)，KETWWETWWTEWSOPKKKRKV(SEQ ID NO.20)或其他多 聚赖氨酸(含5-30个氨基酸残基)。此融合蛋白能进一步包含谷胱甘肽-S- 转移酶(GST)。在一个实施方案中，GST的羧基端与转导肽的氨基端相 连。在特别优选实施方案中，这种融合蛋白是具有如图3所示的氨基酸序 列的PS1，或具有图4所示氨基酸序列的PS2。此融合蛋白或含有融合蛋 白的药物组合物能在药用载体中经口服、颊粘膜途径、舌下粘膜途径、直 肠途径和非肠道途径给药。

在本发明的一个实施方案中，治疗有效量的用于治疗AIDS或HIV感 染的至少一种其它抗逆转录病毒药物，包括其药学上可接受的盐，能同融 合蛋白一起给药。这至少一种的其它抗逆转录病毒药物可为核苷类HIV逆 转录酶抑制剂、非核苷类HIV逆转录酶抑制剂和HIV蛋白酶抑制剂。融 合蛋白的剂量范围为0.01-10.00MU(百万SOD活力单位)，较优范围为 0.10-2.50MU。人类患者可能会对抗转录病毒治疗(ART)有抗性，但将 会出现HIVRNA产量及CD4+T细胞消耗降低。

本发明另一方面提供了包含谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、蛋白转导域 (PTD)和超氧化物岐化酶(SOD)融合蛋白或仅PTD和SOD的融合蛋 白的药用组合物。此融合蛋白可在药用载体中。在一个实施方案中，药用 载体适用于舌下含服给药。包含了药物组合物的试剂盒也是本发明的一部 分。在优选实施方案中，试剂盒包括了图3或图4所示融合蛋白的其中一 种。

以上这些以及本发明涉及的其它方面将在下面更加详细地描述。

附图简述

图1显示了各种包含谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、蛋白转导域(PTD) 和超氧化物歧化酶(SOD)的融合蛋白的示意图。

图2显示了各种包含PTD及SOD的融合蛋白的示意图。

图3显示了GST-PTD-SOD融合蛋白，即PS1的氨基酸序列(SEQ ID  NO.1)。

图4显示了SOD-PTD融合蛋白，即PS2的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)。

发明详述

本发明主要涉及蛋白转导结构域(PTD)和超氧化物岐化酶(SOD) 融合蛋白及其在抑制病毒感染上的应用，特别是针对人免疫缺陷病毒 (HIV)对哺乳动物细胞的感染和减少或防止CD4+T细胞消耗及改善症 状和体征及生活质量方面。本发明提供了一类抑制/治疗HIV感染的融合 蛋白，此蛋白包含了至少一个全长SOD和至少一个PTD及可选谷胱甘肽 -S-转移酶(GST)。PTD是一种能在蛋白转导过程中促进高效穿过细胞膜 的蛋白质结构域，它能将与其共价连接的蛋白质和DNA等分子跨膜导入 几乎所有的组织和细胞，甚至可以通过血脑屏障，转导效率很高而且对细 胞没有损伤。SOD酶的跨膜递送可通过融合PTD成功达到。它能有效去 除超氧阴离子及其引起的氧化应激，保护CD4+T细胞免受HIV损害且抑 制感染细胞内的HIV病毒复制。这些融合蛋白可有效消除感染细胞及遭受 感染风险的细胞内的氧化应激，从而达到减少病毒复制并提高CD4+T细 胞水平的治疗效果。

本发明的融合蛋白(GST-PTD-SOD融合蛋白和SOD-PTD融合蛋白) 能抑制HIV感染，且有利于对HIV感染及随之发生的如AIDS的病理状 态的治疗。如后面实例部分所示，这些融合蛋白本身或与其它多种制剂的 联合都具有活性，尤其是那些有利于HAART(高效抗逆转录病毒治疗) 及其它新组合成分和疗法的制剂。

如本技术领域专业人员所知，根据活性中心金属辅基的不同共有3种 不同类型的SOD：含铜和锌的SOD(Cu-Zn-SOD)；含镁SOD(Mn-SOD) 或含铁SOD(Fe-SOD)。本发明预期的SOD可以为其中任意SOD。此外， 例如，它可为人源或牛源Cu/Zn-SOD，可为重组体，脂质SOD和植物来 源SOD。人Cu-Zn-SOD为首选。超氧阴离子通常在分子氧获得一个额外 电子时形成，这发生于氧遭受电离辐射时。超氧化物歧化酶(SOD)催化 超氧阴离子歧化成为分子氧和过氧化氢。

SOD岐化酶活性的测定可在505nm处由分光光度法测出，一活力单位 SOD表示50％抑制甲臜显色(505nm)的蛋白量，该方法根据Irvin Fridovich 描述的方法(Superoxide Radical：An Endogenous Toxicant，Annual Review  of Pharmacology and Toxicology，Vol.23：239-257)用黄嘌呤和黄嘌呤氧化 酶在37℃、pH 7.8条件下产生超氧阴离子自由基。

本发明需要PTD作为融合蛋白的一部分。PTD是一种能在蛋白转导过 程中促进蛋白质高效穿过细胞膜的蛋白质结构域，它能将与其共价连接的 蛋白质(货物蛋白、肽或SODs)和DNA等分子跨膜导入几乎所有的组 织和细胞，甚至可以通过血脑屏障，转导效率高且对细胞无损伤。本发明 涉及递送SOD进入细胞和组织，甚至是通过血脑屏障进入大脑的方法及 物质。根据此发明，SOD(货物蛋白)的递送通过使用合适的PTD(转导 肽或转导域)来完成。此转导肽允许C-端或N-端连接或融合的货物蛋白 (SOD)转运进入哺乳动物细胞、组织和/或通过血脑屏障。在本发明的一 个实施方案中，SOD连接到本发明的YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO.3) 转导肽。在另一个实施方案中，货物化合物连接于本发明的 YGRKKKKQRR(SEQ ID NO.4)或YGRKKR(SEQ ID NO.5)转导肽。 RKKRRQRRR(SEQ ID NO.6)，RRRRRRRRR(SEQ ID NO.7)， AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO.8)，AVLLPVLLAAP(SEQ ID NO.9)， VTVLALGALAGVGVG(SEQ ID NO.10)，GALFLGFLGAAGS TMGA(SEQ  ID NO.11)，WGLGLHLLVLAAALQGAMGLGLHLLLAAALQGA(SEQ ID  NO.12)，WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA(SEQ ID  NO.13)，WEAALAEALAEALAEHLAEALALEALAA(SEQ ID NO.14)， LARLLARLLARLLRALLRALLRAL(SEQ ID NO.15)， KLLKLLLKLWKLLLKLLK(SEQ ID NO.16)，RQIKIWFQRRMKKWK (SEQ ID NO.17)，DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASPPRRPVE (SEQ ID NO.18)，GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL(SEQ ID  NO.19)，KETWWETWWTEWSOPKKKRKV(SEQ ID NO.20)氨基酸序 列或一段多聚赖氨酸(含5-30个氨基酸残基)，或一段多聚精氨酸(含5-30 个氨基酸残基，如：RRRRRRRRR(SEQ ID NO.7))代替YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO.3)，YGRKKKKQRR(SEQ ID NO.4)或YGRKKR(SEQ ID  NO.5)同样能作为PTD使用。SOD可连接于转导肽的C-端或N-端。在 一些实施方案中，一种给定转导肽的N-端与谷胱甘肽-S-转移酶(GST) 相连。在此所提词语“连接”、“复合”或“融合”是指连接的蛋白或氨基酸组 件之间化学缔合(如在GST-PTD-SOD融合蛋白或SOD-PTD融合蛋白中)。 在一些例子中，这种缔合可能不是直接的，但可能由一个连接基团或其他 成分介导。这些组件之间的化学缔合由共价键结合。融合位点或连接位点 可能被设计成对酶降解敏感。

PTD可能是天然的、化学合成的或由重组技术制得。这种天然合成或 重组的转导肽可用于运输连接的“货物”(CARGO)进入哺乳动物细胞、组 织和/或跨过血脑屏障。在此所用词语“多肽”、“肽”和“蛋白”可交换使用以 指一种氨基酸残基的聚合物。这些词语适用于天然氨基酸聚合物。这些词 语同样适用于另一些氨基酸聚合物——其中一个或多个氨基酸残基是类 似天然氨基酸的人工化学类似物。词语“多肽”、“肽”和“蛋白”同时还包含 各种修饰，包括但不限于糖基化、脂质粘附、硫酸化、谷氨酸残基的γ- 羧化、羟基化和ADP-核糖基化。值得一提的是多肽并不总是全部线性的。 例如，多肽可能由于泛素化而具有分支，它们也可能成为环状(具或不具 分支)，这主要由于翻译后修饰(包括自然过程中发生的和由非自然过程中 人为的)。环状、分支和分支的环状多肽可能由非自然翻译过程及完全合成 途径合成。特别是，这些保持抑制活性的肽序列能根据众所周知的方法合 成制备，例如：固相或液相肽合成。或者本发明的肽可为重组合成。

例如编码GST-PTD-SOD融合蛋白的融合基因或核酸序列能由DNA 重组技术构建并插入表达载体pGEX-2T中。接着将带有GST-PTD-SOD的 表达载体pGEX-2T转化进入合适的细菌宿主细胞，如E.coli(BL21，DH5α)。 pGEX-2T克隆载体的全序列(GenBank：U13850.1)(FASTA和图样)(此 序列通过在本文中引用而成为本文的一部分)可从美国国家生物技术信息 中心(NCBI)(美国马里兰州贝塞斯达市派克洛克维尔8600号美国国立 医学图书馆，20894)得到。此GST-PTD-SOD融合蛋白能经IPTG诱导 在E.coli中表达，并且通过亲和色谱纯化以治疗或抑制人类患者体内HIV 感染/AIDS。

编码SOD-PTD的融合基因或核酸序列可由PCR技术构建并通过穿梭 载体(如任意pPICZαA，B或C)插入巴斯德毕赤酵母的染色体。这些载 体的细节及载体序列可由英杰公司(Invitrogen Corporation，美国加州卡尔 斯巴德市法拉第大街1600号，92008)获得。同时可见英杰公司用户手册， 其题为《EasySelect^TM Pichia Expression Kit For Expression of Recombinant  Proteins Using pPICZ and pPICZαin Pichia pastoris，Cat.No.K1740-01，June  18，2010，Manual Part No.25-0172》。载体pPICZαA，B和C为3.6kb大小 的载体，用于在巴斯德毕赤酵母中表达和分泌重组蛋白。重组蛋白以N端 融合于编码酿酒酵母α因子分泌信号肽的形式表达出来。相关研究领域专 业技术人员可知这些载体允许高水平甲醇诱导表达毕赤酵母内的目的基 因，并且能用于包括X-33、SMD1168H和KM71H在内的任意毕赤酵母系 统。这些载体一般包括了以下元件：严格调控甲醇诱导表达目的基因的 AOX1启动子；指导分泌表达重组蛋白的α因子分泌信号；用于在E.coli 和毕赤酵母中筛选的博来霉素抗性基因；用于检测和纯化重组融合蛋白 的、包含c-myc表位和多组氨酸(6xHis)标签的C-端肽。这些商业可用 载体(A，B，C载体)备有阅读框以促进框内C-端肽克隆。由宿主细胞(酵 母或大肠杆菌)分泌的融合蛋白可经过滤、乙醇沉降和离子交换色谱纯化 以用于治疗或抑制人类患者体内HIV感染/AIDS。“患者”是指在AIDS和 HIV感染领域从业者所了解的感染HIV病毒且需要治疗的人。

此含有GST、PTD和SOD融合蛋白或PTD和SOD融合蛋白的活性 制剂或含有活性制剂的组合物可以通过任何合适的途径向人类患者给药， 例如口服、颊粘膜、舌下、直肠或肠胃外(包括静脉、肌肉、皮下和冠状 动脉给药)途径。含本发明组合物的药物组合物能以传统方式按配方制出， 此方法利用一种或多种生理可接受载体或赋形剂或辅助剂以帮助组合物、 活性制剂或食品添加剂、或其混合物制成可治疗用制剂。在各种实施方案 中，此组合物包括载体和赋形剂(包括但不限于缓冲剂、糖类、甘露醇、 蛋白、多肽或氨基酸，如甘氨酸，抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂、悬浮剂、 增稠剂和/或防腐剂)、水、油、盐溶液、水性葡萄糖和甘油溶液，其他药 用可受性辅助剂物质以获得近似生理条件，如缓冲剂、渗透压调整剂、润 湿剂及类似物。可确认的是，即使那些普通专业技术人员所知的任何合适 载体都可能用于此发明组合物的给药，载体的类型会因为给药方式的不同 而变化。

本发明的融合蛋白一般将会作为一种药用组合物提供，这种组合物的 活性成分可能包括本发明融合蛋白本身(也就是GST-PTD-SOD或 SOD-PTD本身)或融合蛋白和至少一种其它治疗AIDS或HIV感染的药 剂。此组合物一般与药用可受性载体或赋形剂制成，并可能包含传统赋形 剂。此组合物利用普通配方技术制得。本发明涵盖所有传统形式。固体和 液体组合物为优先选择。一些固体形式包括了散剂、片剂、胶囊和锭剂。 片剂包括咀嚼、缓释和控释。胶囊包括肠衣胶囊和缓释胶囊。散剂可口服 和冲调服用。散剂包括冻干粉。

本发明的组合物及其药用配方能按任何有效剂量给药以达到预期目 的。为了在宿主或宿主细胞内抑制人免疫缺陷病毒(HIV)病毒性感染、 治疗AIDS和/或减少或者预防CD4+T细胞损耗而给药时，此组合物按治 疗有效量给药。“治疗有效量”指提供有意义的患者益处——遏制病毒量、 遏制CD4+T细胞损耗，恢复和保持免疫功能，提高生活质量，和/或降低 HIV相关发病率和死亡率一一所需的药剂量。对各种货物化合物的剂量和 给药计划的指导可从许多参考书目中收集，这些参考书目描述了此类化合 物在治疗和诊断上的用法，例如：《医师案头参考》(PDR)，或者按此 领域专业技术人员确定的剂量和计划进行。

药物的适合剂量可能取决于多种因素，例如，人类患者个体、给药方 式、诊断和治疗状况的特性和剧烈程度。然而，此发明的一种具体实施方 法在人体中产生了满意的治疗结果，该方法的日给药、周给药、月给药和 /或持续给药的每日剂量范围从约0.1MU到约2.5MU(百万单位的SOD活 力)。每日剂量可以每天间断给药1到12次或更多。药物可选择隔天一次、 三天一次、四天一次、五天一次、六天一次、一周一次，类似递增到30 天或更多。服药可以是连续的、间断的或者单次服药，使用任何可应用的 给药剂型，包括片剂、溶液、贴剂、静脉注射和其它类似的方式。更具体 地说，该组合物是给予治疗有效量。尽管本发明包括了上述提到的所有传 统给药方式，但优选口服、舌下含服和直肠给药。然而，特殊的剂量范围 将会经医师使用合理的医学评判标准确定。

此发明也包含了给予发明中融合蛋白与其它治疗方法联合使用的方 法。即此融合蛋白可以与其它抗逆转录病毒制剂联合但分别有效治疗 AIDS和HIV感染。“联合”、“同时服用”、“同时发生”以及涉及本发明的 融合蛋白与至少一种其它抗HIV制剂同时给药的类似词语是指该组分(融 合蛋白和其它抗逆转录病毒制剂)是联合抗逆转录病毒治疗或者高效抗逆 转录病毒治疗(HAART)的一部分。HAART被本研究领域专业技术人员 所熟知。它是一种许多抗逆转录病毒药物联合治疗的方法。这些药物抑制 病毒在体内繁殖的能力，并且减缓AIDS发展。HAART被定义为利用3 种或更多抗逆转录病毒药物，其中一种必须为蛋白酶抑制剂(PI)，NNRTI (非核苷逆转录酶抑制剂)，核苷或核苷酸逆转录酶抑制剂(NRTIs)(如 阿巴卡韦或泰诺福韦)，整合酶抑制剂(如雷特格韦)，或进入抑制剂(如 马拉维诺或恩夫韦肽)(WIHS出版物，2008)。

本发明的融合蛋白与其它抗逆转录病毒制剂或目前的抗病毒药物联合 使用预期会有效清除线粒体内的氧自由基，达到协同治疗效果。这些其它 抗逆转录病毒制剂中包括HIV核苷逆转录酶抑制剂，如：ddI、AZT、d4T、 3TC和泰诺福韦；HIV非核苷逆转录酶抑制剂，如：奈韦拉平、依法韦仑 和地拉韦啶；HIV蛋白酶抑制剂，如：沙奎那韦、安瑞那韦、洛匹那韦、 利托那韦和茚地那韦；HIV整合酶抑制剂，如：雷托格韦；HIV进入和融 合抑制剂，如：恩夫韦肽和马拉维若。然而，本发明不仅限于和这些特别 的抗逆转录病毒制剂进行联合治疗。在这些联合治疗方式中， GST-PTD-SOD或SOD-PTD与其它制剂联合使用中一般日用药量为SOD 活力1000U-2,500,000U范围内。这些其它抗逆转录病毒制剂的一般用药单 位范围与此类制剂在临床或治疗上的用法相似。通常此范围为0.25-1000 毫克/单位。然而此特定药剂的给药方案将由医师通过合理医学判断来决 定。

在本发明的一个实施方案中，在人类患者中治疗或抑制人免疫缺陷病 毒(HIV)感染，或者治疗或抑制获得性人免疫缺陷综合征(AIDS)的方 法包括利用一种融合蛋白。特别地，包含了一种超氧化物歧化酶(SOD) 和至少一种具有YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO.3)序列的转导肽的融合 蛋白以治疗有效量给药。此转导肽的羧基端和SOD的氨基端相连，或者 相反。Cu-Zn-SOD是优选SOD。融合蛋白可能包含连接于转导肽的氨基 端的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。通过融合蛋白的给药，经过药物组合物 治疗的人类患者与未经治疗患者相比，其HIV RNA产量和CD4+T细胞 消耗均有下降。

在本发明的其它各种实施方案中，本发明的方法可用于诊断、预防或 研究目的，或除上述直接疗法外，随后回到患者体内的间接体内疗法。在 这些实施方案中，包含了SOD的融合蛋白在体外、间接体内或体内被递 送到细胞内。例如，递送可通过向体外培养细胞(如：活组织检查)中添 加GST、PTD和SOD融合蛋白或PTD及SOD融合蛋白的方式达到。另 一种选择是，递送可通过间接体内法向取自患者的样品(如：血液、组织 或骨髓)中添加给定的融合蛋白，并且把治疗过的样品送回患者体内的方 式达到。

工作实施例

以下工作实施例被提供用来说明本发明的优选实施方案，但是当然地， 不能用于解释为对此发明范围的任何限制。下面实施例的执行除了特别的 细节描述以外，使用的均是众所周知的传统技术和本研究领域专业技术人 员所熟知的程序。进一步说，本研究领域专业技术人员应该体会到这些实 施例中披露的技术代表了发明人找到的能在发明应用中起到良好功效的 技术，并且这些可以被认为是构成了实践运用中的优选方式。然而，鉴于 此披露，本研究领域专业技术人员还应该体会到，所披露的具体实施方案 可以有很多实施变化，并仍然能得到相同或相似的结果，而不会脱离发明 的精髓和范围。

实施例1含SOD融合蛋白及其活性

含有GST和无GST的融合蛋白的构建、表达及其酶学或生物学活性 分析方法如下：

构建体制备：通过DNA重组技术构建GST-PTD-SOD融合蛋白的核酸 编码序列，并将其接入表达载体pGEX-2T(GenBank：U13850.1)。通过 PCR技术构建SOD-PTD融合蛋白基因，并由穿梭载体pPICZαA插入 Pichia pastoris酵母的染色体中。

细胞培养和转染：携带GST-PTD-SOD基因的表达载体pGEX-2T转化 进入大肠杆菌E.coli(BL21，DH5α)。插入了SOD-PTD基因的表达载体 pICZαA转化进入酵母Pichia pastoris(X-33)。

GST-PTD-SOD融合蛋白制备：通过IPTG诱导，GST-PTD-SOD在大 肠杆菌胞内表达，并通过亲和色谱方法纯化达到电泳纯，以备后续使用。

SOD-PTD融合蛋白制备：经甲醇诱导，酵母表达并分泌SOD-PTD到 胞外；通过过滤、乙醇沉降、离子交换色谱纯化，备后续使用。

SOD测定：SOD活力通过分光光度法在505nm处测定。一个活力单 位定义为：每毫升反应液中使有色物甲瓒(505nm处)生成的抑制率达到 50％时的SOD蛋白量，该有色物由黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶作用产生超氧自 由基后生成，方法详见IrVin Fridovich的描述(Superoxide Radical：An  Endogenous Toxicant，Annual Review of Pharmacology and Toxicology，Vol. 23：239-257)。此SOD属于Cu/Zn超氧化物歧化酶，基因ID6649，NCBI 引用序列为NP_000445.1。NCBI引用GST蛋白ID为AAA57089.1。

GST-PTD-SOD氨基酸序列(SEQ ID NO.1)：

SPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLP

YYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAY

SKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLY

MDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPK

SDLVPRGS-YGRKKRRQRRR-

ATKAVCVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNT

AGCTSAGPHFNPLSRKHGGPKDEERHVGDLGNVTADKDGVADVSIEDSVISLSG

DHCIIGRTLVVHEKADDLGKGGNEESTKTGNAGSRLACGVIGIAQ

SOD-PTD氨基酸序列(SEQ ID NO.2)：

ATKAVCVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNT

AGCTSAGPHFNPLSRKHGGPKDEERHVGDLGNVTADKDGVADVSIEDSVISLSG

DHCIIGRTLVVHEKADDLGKGGNEESTKTGNAGSRLACGVIGIAQ-YGRKKR

实施例2融合蛋白PS1和PS2对HIV/AIDS患者HIV病毒载量和CD4+T 细胞数量的影响

PS1融合蛋白如图3所示，是将谷胱甘-肽-S转移酶(GST)的C端融 合一段序列为YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO.3)蛋白转导结构域PTD， 并在PTD的C端融合了Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD)。PS2如图4所示， 是将一段序列为YGRKKR(SEQ ID NO.5)的PTD的N端融合了Cu/Zn  SOD。PS2不含谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。上述两种融合蛋白分别简称 为PS1和PS2，后面的提及同此理解。

PS1/PS2通过直肠粘膜给药

HIV/AIDS男性患者，11名，实验前均至少三个月未接受抗逆转录治 疗(ART)或者其它任何的抗病毒治疗。HIV-RNA＞50cp/mL、不伴有其 它重大传染病(如N1H1-甲型流感、肺结核等)，在医生告知PS1/PS2信 息后，实验前患者自愿签署临床试验知情同意书。患者被随机分为四组： PS1 10万U组、PS2 10万U组、PS2 50万U组、PS2 250万U组，每组 病人基本情况如表1-1所示。病人在接受治疗期间，正常工作和生活。

药物剂型、给药方式、时间、剂量和持续时间：PS1和PS2冻干粉按 设定的剂量(酶活力)溶于2mL生理盐水中，用5ml规格注射器装载全 部液体，注射器针头经肛门插入直肠5-10cm处，注射全部溶液，随后， 患者需俯卧于床10到30分钟。患者每天睡前注射PS1或PS2一次，持续 一个月。治疗前和最后一次治疗结束后各取血样一次检测。检测指标包括 CD4+T、CD8+T细胞数量(CD8+T细胞能杀死感染HIV病毒的细胞，它 的数量与病毒载量相关)、HIV RNA载量、肝肾功能、全血细胞量以及血 糖等指标相关。

临床用药安全性：用药期间，各组HIV/AIDS患者均未出现呕吐、视 力模糊、四肢关节痛、肌肉酸痛、四肢麻木、感觉异常等不良反应，只有 PS2 250万U组中的1人出现轻度发热症状，适当休息后消失；整个治疗 过程中，所有患者生命体征平稳，血压稳定，显示了良好的临床用药安全 性。

症状体征变化情况：与服药前对比，各组病人经过一个月治疗后面色 红润，精神明显改善，体力显著提高，性功能显著提高，皮疹少发或不发； 食欲、腹泻、体重无明显变化。

CD4+T细胞数量和病毒载量的变化：患者CD4+T细胞数量和病毒载 量的变化如表1-2所示。

经治疗一个月后，PS1用药组患者CD4+增加了37.6/μL，而对病毒载 量尚未显示出明显的作用。PS2用药组患者病毒载量下降，且以中低剂量 (10万U和50万U)效果较好，而中剂量(50万U)组患者CD4+细胞 数量增加最多，高剂量组(250万U)CD4+T细胞数量的增加值和病毒载 量的减少量最不明显，此剂量组病毒载量变化PS1和PS2的250万U组 的+0.19和-0.15病毒载量变化均在95％置信区间的0.3Lg误差范围内。

PS1/PS2直肠给药方式对HIV/AIDS患者都没有明显的副作用，且都 能够显著改善患者症状体征、提高患者生活质量。

舌下含服PS1

HIV/AIDS患者，10名，实验前均至少三个月未接受抗逆转录治疗 (ART)或者其它任何的抗病毒治疗。患者均为1994-1996年期间有偿献 血感染HIV病毒。HIV-RNA＞50cp/mL、不伴有其它重大传染病(如N1H1- 甲型流感、肺结核等)，在被告知PS1信息后，实验前患者自愿签署临床 试验知情同意书。入选病例被随机分为治疗组和对照组。基本情况如表1-3 所示。治疗期间，所有入选病例集中统一管理，自由活动。适应环境生活 一周以后，开始实验。

药物剂型：片剂。治疗组给予含有食品添加剂的PS1片剂，2,500U/ 片；对照组片剂仅含有食品添加剂。片剂为一食品厂加工生产。

给药方式：每组病人均舌下含服PS1药片或对照药片。

给药时间、剂量和持续时间：每天三次，早晨八点(8:00)，下午两点 (14:00)，晚上八点(20:00)，每次16片，持续三个月。

实验前和每治疗一个月后取血样一次检测。

检测指标包括CD4+T、CD8+T细胞数量、HIV RNA载量、肝肾功能、 全血细胞量以及血糖等指标相关。

临床用药安全性：用药期间，各组HIV/AIDS患者均未出现呕吐、视 力模糊、四肢关节痛、肌肉酸痛、四肢麻木、感觉异常等不良反应，只有 对照组1人出现轻度恶心。治疗组3例、对照组1例患者服药期间出现发 热症状，并伴随轻度头晕头痛；适当休息后均消失。

整个治疗过程中，所有患者肝肾功能无恶化趋势，生命体征平稳，血 压稳定，显示了良好的临床用药安全性。治疗前后，患者临床症状、体征 变化情况如表1-4所示。

服药三个月后，治疗组病人面色红润，精神明显改善，体力显著提高， 男性性功能显著提高；落发明显减少，有3位患者甚至长出新发。治疗组 患者体重增加了4.34kg而对照组为2.50kg；皮疹少发或不发，食欲、腹泻 无明显变化。对照组患者三个月后与试验前相比，面色、精神、体力、落 发、皮疹、腹泻、食欲、体重、男性性功能等症状和体征无明显变化。

CD4+T细胞数量和病毒载量的变化：患者CD4+T细胞数量和病毒载 量的变化如表1-5所示。

治疗三个月后，舌下含服PS1片剂(每日三次、每次16片、每片2,500 U)对HIV/AIDS患者具有良好的抗病毒效果，与对照组相比，治疗组病 毒载量下降了1.08LOG10，同时也显示出增强免疫的作用。CD4+T细胞 数量有所上升，但幅度较小。

舌下含服PS1片剂对HIV/AIDS患者没有明显的副作用，且能够显著 改善患者的面色、精神、体力、头发、皮疹、性功能等症状体征，显著提 高患者生活质量。

实施例3 PS1对抗逆转录病毒治疗(ART)耐药的HIV/AIDS患者HIV 病毒载量和CD4+T细胞数量的影响

HIV/AIDS患者，共10名。患者均为1994-1996年期间有偿献血感染 HIV病毒。患者本次治疗开始前均接受过至少三个月以上的常规抗逆转录 病毒治疗(ART)，HIV-RNA＞50cp/mL、不伴有其它重大传染病(如N1H1- 甲型流感、肺结核等)，在被告知PS1信息后，实验前患者自愿签署临床 试验知情同意书。入选病例被随机分为治疗组和对照组，病人基本情况如 表2-1所示。治疗期间，所有入选病例集中统一管理，自由活动。适应环 境生活一周以后，开始实验。

药物剂型：片剂。治疗组给予含有食品添加剂的PS1片剂，2,500U/ 片；对照组片剂仅含有食品添加剂。片剂为一食品厂加工生产。

给药方式：每组病人均舌下含服PS1药片或对照药片。给药时间、剂 量和持续时间：每天三次，早晨八点(8:00)，下午两点(14:00)，晚上八 点(20:00)，每次16片，持续三个月。实验前和每治疗一个月后取血样一 次检测。检测指标包括CD4+T、CD8+T细胞数量、HIV RNA载量、肝肾 功能、全血细胞量以及血糖等指标相关。

临床用药安全性：用药期间，各组HIV/AIDS患者均未出现呕吐、视 力模糊、四肢关节痛、肌肉酸痛、四肢麻木、感觉异常等不良反应，只有 治疗组4例、对照组3例患者服药期间出现发热症状，并伴随轻度头晕头 痛；适当休息后均消失。

整个治疗过程中，所有患者肝肾功能无恶化趋势，生命体征平稳，血 压稳定，显示了良好的临床用药安全性。治疗前后，患者临床症状、体征 变化情况如表2-2所示。

治疗组病人面色红润，精神明显改善，体力显著提高，性功能显著提 高；落发明显减少，有2位患者甚至长出新发。治疗组患者体重增加了3.33 kg而对照组为2.43kg；食欲、皮疹、腹泻无明显变化。对照组患者三个 月后与试验前相比，面色、精神、体力、落发、皮疹、腹泻、食欲、体重、 男性性功能等症状和体征无明显变化。

CD4+T细胞数量和病毒载量的变化：患者CD4+T细胞数量和病毒载 量的变化如表2-3所示。

治疗三个月后，舌下含服PS1片剂(每日三次、每次16片、每片2,500 U)对HIV/AIDS抗逆转录病毒治疗(ART)耐药患者具有很好的抗病毒 效果，与对照组相比，治疗组病毒载量下降了1.27LOG10，超过1LOG10。 同时CD4+T细胞数量的增加，也显示出增强免疫的作用。

舌下含服PS1片剂对HIV/AIDS患者没有明显的副作用，且能够显著 改善患者的面色、精神、体力、头发、皮疹、性功能等症状体征，显著提 高患者生活质量。

实施例4联合高效抗逆转录病毒治疗(HARRT)的直肠粘膜给药PS2对 HIV/AIDS病人的HIV病毒载量和CD4+T细胞的作用

共3位HIV/AIDS男性患者，本次治疗开始前均接受过至少三个月以 上的高效抗逆转录病毒治疗(AZT+3TC+EFV)。他们的病毒载量低于检测 限水平，并且不伴有其它重大传染病(如N1H1-甲型流感、肺结核等)。 在被告知PS2信息后，实验前患者自愿签署临床试验知情同意书。入选病 例被随机分为3组：PS210万U组、PS250万U组、PS2250万U组， 每组病人基本情况如表3-1所示。病人在接受治疗期间，正常工作和生活。

药物剂型、给药方式、时间、剂量和持续时间：PS2冻干粉按设定的 剂量(酶活力)溶于2mL生理盐水中，用5ml规格注射器装载全部液体， 注射器针头经肛门插入直肠5-10cm处，注射全部溶液，随后患者需俯卧 于床10到30分钟。患者每天睡前注射PS2一次，持续一个月。治疗前和 最后一次治疗结束后各取血样一次检测。检测指标包括CD4+T、CD8+T 细胞数量、HIV RNA载量、肝肾功能、全血细胞量以及血糖等指标相关。

临床用药安全性：用药期间，各组HIV/AIDS患者均未出现呕吐、视 力模糊、四肢关节痛、肌肉酸痛、四肢麻木、感觉异常等不良反应，只有 PS2250万U组中的1人出现轻度发热症状，适当休息后消失；整个治疗 过程中，所有患者生命体征平稳，血压稳定，显示了良好的临床用药安全 性。

症状体征变化情况：与服药前对比，各组病人经过一个月治疗后面色 红润，精神明显改善，体力显著提高，食欲增加。

CD4+T细胞数量和病毒载量的变化：患者CD4+T细胞数量变化如表 3-2所示。他们的病毒载量保持低于检测限水平。

经治疗一个月后，PS2用药组患者免疫显著增强，CD4+T细胞数量增 加了81.7/μL，平均增幅达31.6％。50万和250万组的两个人的情况更好； 同时可以看出，PS2直肠给药不干扰抗逆转录病毒治疗药(HARRT)的抗 病毒效果。联合高效抗逆转录病毒药物治疗的直肠给予PS2，可以明显改 善HIV/AIDS患者的症状体征，提高患者生活质量。

表1-1 HIV/AIDS临床实验病例基本情况

表1-2 PS1/PS2直肠给药对HIV/AIDS患者CD4+T细胞数量和病毒载量的影响

注：CD4+T细胞数量和HIV RNA载量由中国CDC艾滋病预防和控制国家中心(NCAIDS)检测； 使用了CD3/CD8/CD45/CD4抗体，TruCOUNT管，FACS裂解液，(BD Biosciences，San Jose，California，USA).HIV  RNA载量：NucliSens HIV-1QT，NASBA，bioMe′rieux(Marcy L’Etoile，France)

表1-3 HIV/AIDS临床实验病例基本情况

表1-4 HIV/AIDS患者临床症状、体征治疗前后变化表

表1-4(续)HIV/AIDS患者临床症状、体征治疗前后变化表

表1-4(续)HIV/AIDS患者临床症状、体征治疗前后变化表

注：同组相同症状体征治疗后与治疗前比较，^*P＜005，^**P＜001。

表1-5舌下含服PS1对HIV/AIDS患者CD4+T细胞数量和病毒载量的影响

表2-1 HIV/AIDS耐药病人的临床实验病例的基本情况

表2-2 HIV/AIDS患者临床症状、体征治疗前后变化表

表2-2(续)HIV/AIDS患者临床症状、体征治疗前后变化表

表2-2(续)HIV/AIDS患者临床症状、体征治疗前后变化表

注：同组相同症状体征治疗后与治疗前比较，^*P＜005，^**P＜001。

表2-3舌下含服PS1对HIV/AIDS耐药病人的CD4+T细胞和病毒载量的影响

表3-1 HIV/AIDS临床实验病例基本情况

表3-2联合高效抗逆转录病毒治疗(HARRT)的PS2直肠给药对HIV/AIDS患者CD4+T细胞 数量和病毒载量的影响

注：CD4+T细胞数量由中国CDC艾滋病预防和控制国家中心(NCAIDS)检测；使用了 CD3/CD8/CD45/CD4抗体，TruCOUNT管，FACS裂解液，(BD Biosciences，San Jose，California，USA).HIV RNA载量： NucliSens HIV-1QT，NASBA，bioMe′rieux(Marcy L’Etoile，France)

因此，如上所述，本发明中的融合蛋白能够抑制HIV活性和有效治疗 HIV感染病人。然而，本发明不只限于上述所示的融合蛋白。事实上，鉴 于此披露而设计合成的药物小分子肽和核酸将是所示分子的二代衍生物。

本说明书所提所有出版物是指示本发明所属技术领域的技术人员水 平。所有出版物、专利和专利申请，若有的话，在此通过引用结合到本文 中，结合程度犹如每个独立出版物或专利申请都特别地分别在本文引用列 出。尽管为理解明确起见，前述发明已通过图解和举例方法详细描述，但 显然在所附权利要求范围内仍需实行某种变化和修饰。虽然为了便于清晰 的理解，前述发明的某些细节已通过图解和举例方式详细描述过，但显然， 某种变化和修饰可被纳入所附权利要求范围内。