热淋清颗粒和头花蓼TOF-MS指纹图谱测定方法

摘要

本发明涉及热淋清颗粒和头花蓼的指纹图谱测定方法。具体地，本发明头花蓼药材或其提取物或包含该提取物的药物组合物的指纹图谱的测定方法，其是照超高效液相色谱-飞行时间-质谱联用法测定，包括以下步骤：(i)供试液配制：称取适量试样加入甲醇水溶液制成混悬液，超声处理；(ii)提供UPLC-TOF-MS色谱及质谱分析条件；(iii)将步骤(i)试样注入液相色谱仪中，以步骤(ii)所述条件进行测定，获得供试样品的UPLC-TOF-MS总离子流色谱图。本发明方法可以有效地用于头花蓼药材或其提取物或制剂的质量评价。

说明书

技术领域

本发明涉及中药领域，特别涉及中药质量评价领域，具体涉及一种热淋清颗粒及其原料药材头花蓼的质量评价方法，特别涉及热淋清颗粒及其原料药材头花蓼指纹图谱的测定方法，更特别地具体涉及一种通过超高效液相色谱-飞行时间-质谱联用法(在本发明中可简称为UPLC-TOF-MS)对热淋清颗粒及药材头花蓼进行质量评价的方法。

背景技术

头花蓼为蓼科植物头花蓼Polygonum capitatum Buch.-Ham.ex D.Don的干燥全草或地上部分，收载于《贵州省中药材民族药材质量标准》2003年版，具清热利湿、抗菌消炎、利尿通淋等功效(贵州省食品药品监督管理局.贵州省中药材民族药材质量标准[M].贵阳：贵州科技出版社，2003:147)。

头花蓼是贵州常用苗药，是贵州省中药现代化重点发展的“六大苗药”和重点培育发展的“七大中药产业链”的品种之一。本发明的申请人已在贵州施秉及贵阳乌当区建立了头花蓼规范化种植基地，并通过国家GAP认证。

现在有关头花蓼GAP种植及化学成分等方面的研究已取得一定成果(孙长生，韩见宇，杨锦纲，等.头花蓼GAP种植基地的环境质量评价[J].中药研究与信息，2005,7(2):27~30)，但头花蓼药材现行质量标准较为简单，仅以单一成分槲皮素为指标进行评价，无法达到真实、全面反应药材内在品质的目的。

CN101091749A公开了一种头花蓼药材、提取物及其质量控制方法，其中的头花蓼药材具有如HPLC指纹图谱，含有13个特征峰，其中色谱条件为:色谱柱:依利特HYPERSIL ODS色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)；柱温：25℃；流动相：乙腈(A)-0.4%磷酸(B)溶液二元梯度洗脱，重量百分比为：0-30%:100-70%；流速:0.8mL·min^-1；检测波长：310nm；进样量20μL。该发明质控制方法对不同产地头花蓼进行了考察比较，构建了头花蓼HPLC的指纹图谱。

CN102296118A公开了一种DNA分子标记鉴别技术鉴别头花蓼与尼泊尔蓼的方法，在该发明中，以贵州具有代表性的民族药头花蓼为研究对象，探索使用RAPD分析方法对头花蓼与尼泊尔蓼进行遗传多样性分析；并在RAPD的实验基础上，将RAPD方法转化为SCAR标记，为头花蓼与尼泊尔蓼的药材鉴定提供了准确可靠、快速稳定的方法。DNA分子标记鉴别技术同样不适合药材的常规质量评价和控制。

中药指纹图谱是指某种中药材或中成药中所共有的、具有特征性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。在现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确的情况下，中药指纹图谱对于有效控制中药材或中成药的质量具有重要的意义。日本汉方药主要生产企业在20世纪80年代就已经在企业内部采用高效液相指纹图谱控制质量。德国、法国在对银杏叶提取物联合开发的过程中，发现银杏叶提取物的医疗作用是提取物所得物质群的整体作用结果，而对这样一个整体的质量控制，亦采用高效液相指纹图谱方法。美国FDA最近几年制定的植物草药指南中已经明确把指纹图谱作为混合物质群的质量控制方法(FDA．Guidance of Industy：BotanicalDrug(Draft)．2000August)。随着研究的深入，人们发现，作为中医理论的实践产物，中药，尤其是复方中药，其中所含的任一成分都不能代表其整体疗效。人们逐渐认识到，现行的参照西药(合成药)质量控制模式的质量标准不能恰当地反映中药内在的质量。从发展趋势看，从现行的质量控制模式向一种综合的、宏观的、可量化的鉴别与主要有效成分含量测定结合已是发展的趋势。

中药质量评价的现行标准是利用光谱或色谱手段鉴别和测定某一种或几种有效成分、活性成分或指标成分，以及药典规定的常规检查项目。显然，这些质量标准的设置是模仿了化学药品的模式。其它国家如英国、印度、美国草药典、日本药局方中的汉药及德国Commission E编辑的德国草药专论等也采用了基本相同的内容。对于化学药品而言，其药效成分为结构清晰的单一化合物，构效关系明确，其含量和纯度直接表达其有效及安全性。然而，中医用药的特点是复方配伍，任何单一的有效或活性成分的含量高低均不能表达其整体的疗效。例如，黄芪所含的黄芪甲苷(aastraga loside IV)是当前被选择为质量标准的鉴别和含量测定的最为常见的目标，但并没有依据证明黄芪甲苷与黄芪的功能主治的明确联系。同样，黄连、黄柏、三棵针均含小檗碱，一般都以它作为检测的目标，但是三者的功能主治却截然不同。复方制剂的情况就更加复杂。中医这种不是一对一的非线性的理论和实践说明中药质量应该采用某种宏观的综合的质量评价手段。

然而就头花蓼药材的质量评价，例如就产地差异对头花蓼药材进行质量评价，或者对药材的真伪进行鉴别，以及就由头花蓼制备得到的提取物或者制剂，例如热淋清颗粒，迄今为止尚无一种从整体上控制样品质量的适用的常规检验方法。因此，本领域仍然需要有一从整体上控制头花蓼药材、提取物或者制剂例如热淋清颗粒质量评价的方法，特别是可以用于头花蓼药材真伪鉴别以及药材、提取物或制剂简便、宏观、可行的质量判定方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适合常规使用的用于热淋清颗粒及其原料药材头花蓼质量评价的方法。本发明人发现采用一种独特的超高效液相色谱-飞行时间-质谱联用法(在本发明中可简称为UPLC-TOF-MS)可以有效地实现至少一个上述的目的，该方法可以有效地为客观、准确地评价热淋清颗粒及其头花蓼药材的品质，为热淋清颗粒及头花蓼药材质量标准提升以及头花蓼药材优良种源选育、规范化生产提供参考依据。本发明基于此发现而得以完成。

为此，本发明第一方面提供了一种头花蓼药材或其提取物或包含该提取物的药物组合物的指纹图谱的测定方法，其是照超高效液相色谱-飞行时间-质谱联用法测定，包括以下步骤：

(i)供试液配制：称取适量头花蓼药材或其提取物或包含该提取物的药物组合物粉末,加入甲醇水溶液制成混悬液，超声处理，过滤，必要时稀释，作为检测用试样；

(ii)色谱及质谱分析条件：

色谱柱：Acquity BEH C18柱(2.1×100mm,1.7μm)，柱温：30-50℃(例如35-45℃，例如约40℃)；流速：0.2-2ml/min(例如0.2-1ml/min，例如0.3-.5ml/min，例如0.35ml/min)；进样量：1-10μl(例如1-5μl，例如2μl)；质谱条件：离子源为ESI源；干燥气体温度：150-200℃(例如160-190℃)180℃；毛细管电压：4500eV；检测模式：负离子模式；喷雾压力：2.5bar；干燥气(N2)流速：8L/min；扫描范围：100-2000amu；碰撞能量:10ev；以0.1%甲酸水溶液为流动相A，0.1%甲酸乙腈溶液为流动相B，洗脱程序为：在25-40分钟内使流动相A的比率从95%降到0%并且流动相B相应地从5%升高到100%；

(iii)将步骤(i)试样注入液相色谱仪中，以步骤(ii)所述条件进行测定，获得供试样品的UPLC-TOF-MS总离子流色谱图。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(i)中所述甲醇水溶液是浓度为0-80%的甲醇水溶液，例如浓度10-80%的甲醇水溶液，例如浓度20-80%的甲醇水溶液，例如浓度30-70%的甲醇水溶液，例如浓度40-70%的甲醇水溶液，例如约50%、约60%、约70%的甲醇水溶液。对于头花蓼水提物或者由该水提物制备的制剂而言，使用水作为步骤(i)的溶解溶剂是可行的，而对于头花蓼醇提物或者由该醇提物制备的制剂而言，使用含水醇例如含水甲醇是优选的。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(i)中所述混悬液的浓度为1-100mg/ml，例如2-50mg/ml，例如约2、5、10、15、20、25、50mg/ml。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(i)中所述超声处理的时间为5-100min，例如10-60min，例如15-50min，例如15、20、30、45、60min。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(i)中超声处理是以功率250W、频率33kHz的条件超声处理10~60min，优选20~40min，例如约30min。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(i)中所述稀释是使以药材计的溶质在溶液中的浓度为1-10mg/ml，例如2-15mg/ml，例如3-10mg/ml，例如约3、4、5、7.5、10mg/ml。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(i)中所述稀释使用的稀释液是浓度为30-80%的甲醇水溶液，例如浓度40-70%的甲醇水溶液，例如约50%、约60%、约70%的甲醇水溶液。在一个实施方案中，步骤(i)中所述稀释使用的稀释液是步骤(i)中用于配制混悬液的甲醇水溶液。

根据本发明第一方面的方法，其中使用的液相色谱仪是Waters公司的UPLC系统。根据本发明第一方面的方法，其中使用的飞行时间质谱是Bruker公司的Q-TOF-MS系统。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(i)中所述洗脱程序如下：

 时间(min)  A(%)  B(%)  0  95  5  0.5  95  5  20  81.5  18.5  28  0  100  30  0  100  30.1  95  5  32  95  5

根据本发明第一方面的方法，其还对已知或符合规定的头花蓼药材或其提取物或包含该提取物的药物组合物进行测定的步骤。

根据本发明第一方面的方法，其还包括在步骤(iii)之后，将测试头花蓼药材或其提取物或包含该提取物的药物组合物的色谱图与已知或符合规定的头花蓼药材或其提取物或包含该提取物的药物组合物色谱图进行比较的步骤。在一个实施方案中，本发明第一方面的方法，其在步骤(iii)之后还包括如下步骤：将测试头花蓼药材或其提取物或包含该提取物的药物组合物的色谱图中各个峰面积大于主峰面积10%(例如大于20%)的色谱峰与已知或符合规定的头花蓼药材或其提取物或包含该提取物的药物组合物色谱图的相应色谱峰进行比较，比较二者保留时间的一致性。

本发明第二方面提供了一种头花蓼药材指纹图谱的测定方法，其是照超高效液相色谱-飞行时间-质谱联用法测定，包括以下步骤：

(i)供试液配制：称取适量头花蓼药材粉末,加入甲醇水溶液制成混悬液，超声处理，过滤，必要时稀释，作为检测用试样；

(ii)色谱及质谱分析条件：

色谱柱：Acquity BEH C18柱(2.1×100mm,1.7μm)，柱温：30-50℃(例如35-45℃，例如约40℃)；流速：0.2-2ml/min(例如0.2-1ml/min，例如0.3-.5ml/min，例如0.35ml/min)；进样量：1-10μl(例如1-5μl，例如2μl)；质谱条件：离子源为ESI源；干燥气体温度：150-200℃(例如160-190℃)180℃；毛细管电压：4500eV；检测模式：负离子模式；喷雾压力：2.5bar；干燥气(N2)流速：8L/min；扫描范围：100-2000amu；碰撞能量:10ev；以0.1%甲酸水溶液为流动相A，0.1%甲酸乙腈溶液为流动相B，洗脱程序为：在25-40分钟内使流动相A的比率从95%降到0%并且流动相B相应地从5%升高到100%；

(iii)将步骤(i)试样注入液相色谱仪中，以步骤(ii)所述条件进行测定，获得供试样品的UPLC-TOF-MS总离子流色谱图。

根据本发明第二方面的方法，其中步骤(i)中所述甲醇水溶液是浓度为30-80%的甲醇水溶液，例如浓度40-70%的甲醇水溶液，例如约50%、约60%、约70%的甲醇水溶液。

根据本发明第二方面的方法，其中步骤(i)中所述混悬液的浓度为1-100mg/ml，例如2-50mg/ml，例如约2、5、10、15、20、25、50mg/ml。

根据本发明第二方面的方法，其中步骤(i)中所述超声处理的时间为5-100min，例如10-60min，例如15-50min，例如15、20、30、45、60min。根据本发明第二方面的方法，其中步骤(i)中超声处理是以功率250W、频率33kHz的条件超声处理10~60min，优选20~40min，例如约30min。

根据本发明第二方面的方法，其中步骤(i)中所述稀释是使以药材计的溶质在溶液中的浓度为1-10mg/ml，例如2-15mg/ml，例如3-10mg/ml，例如约3、4、5、7.5、10mg/ml。

根据本发明第二方面的方法，其中步骤(i)中所述稀释使用的稀释液是浓度为30-80%的甲醇水溶液，例如浓度40-70%的甲醇水溶液，例如约50%、约60%、约70%的甲醇水溶液。在一个实施方案中，步骤(i)中所述稀释使用的稀释液是步骤(i)中用于配制混悬液的甲醇水溶液。

根据本发明第二方面的方法，其中使用的液相色谱仪是Waters公司的UPLC系统。根据本发明第二方面的方法，其中使用的飞行时间质谱是Bruker公司的Q-TOF-MS系统。

根据本发明第二方面的方法，其中步骤(i)中所述洗脱程序如下：

 时间(min)  A(%)  B(%)  0  95  5  0.5  95  5  20  81.5  18.5  28  0  100  30  0  100  30.1  95  5  32  95  5

根据本发明第二方面的方法，其还对已知或符合规定的头花蓼药材进行测定的步骤。

根据本发明第二方面的方法，其还包括在步骤(iii)之后，将测试药材的色谱图与已知或符合规定的头花蓼药材色谱图进行比较的步骤。在一个实施方案中，本发明第二方面的方法，其在步骤(iii)之后还包括如下步骤：将测试药材的色谱图中各个峰面积大于主峰面积10%(例如大于20%)的色谱峰与已知或符合规定的头花蓼药材色谱图的相应色谱峰进行比较，比较二者保留时间的一致性。

根据本发明第二方面的方法，其还适用于头花蓼醇提取物或者头花蓼醇提浸膏或其制剂。

根据本发明第二方面的方法，其中测试头花蓼药材或者其醇提浸膏或该醇提浸膏的制剂所指认的色谱峰及其对应物质至少包括：

根据本发明第二方面的方法，其中测试头花蓼药材或者其醇提浸膏或该醇提浸膏的制剂所指认的色谱峰及其对应物质至少包括：

根据本发明第二方面的方法，其中测试头花蓼药材或者其醇提浸膏或该醇提浸膏的制剂所指认的色谱峰及其对应物质包括：

本发明第三方面提供了一种头花蓼制剂(例如热淋清颗粒)或者制备该制剂的头花蓼提取物或者头花蓼水提取物(亦可称为水提浸膏)的指纹图谱的测定方法，其是照超高效液相色谱-飞行时间-质谱联用法测定，包括以下步骤：

(i)供试液配制：称取适量头花蓼制剂或头花蓼提取物的粉末,加入甲醇水溶液制成混悬液，超声处理，过滤，必要时稀释，作为检测用试样；

(ii)色谱及质谱分析条件：

色谱柱：Acquity BEH C18柱(2.1×100mm,1.7μm)，柱温：30-50℃(例如35-45℃，例如约40℃)；流速：0.2-2ml/min(例如0.2-1ml/min，例如0.3-.5ml/min，例如0.35ml/min)；进样量：1-10μl(例如1-5μl，例如2μl)；质谱条件：离子源为ESI源；干燥气体温度：150-200℃(例如160-190℃)180℃；毛细管电压：4500eV；检测模式：负离子模式；喷雾压力：2.5bar；干燥气(N2)流速：8L/min；扫描范围：100-2000amu；碰撞能量:10ev；以0.1%甲酸水溶液为流动相A，0.1%甲酸乙腈溶液为流动相B，洗脱程序为：在25-40分钟内使流动相A的比率从95%降到0%并且流动相B相应地从5%升高到100%；

(iii)将步骤(i)试样注入液相色谱仪中，以步骤(ii)所述条件进行测定，获得供试样品的UPLC-TOF-MS总离子流色谱图。

根据本发明第三方面的方法，其中步骤(i)中所述甲醇水溶液是浓度为0-80%的甲醇水溶液，例如浓度10-80%的甲醇水溶液，例如浓度20-80%的甲醇水溶液，例如浓度30-70%的甲醇水溶液，例如浓度40-70%的甲醇水溶液，例如约50%、约60%、约70%的甲醇水溶液。对于头花蓼水提物或者由该水提物制备的制剂而言，使用水作为步骤(i)的溶解溶剂是可行的，而对于头花蓼醇提物或者由该醇提物制备的制剂而言，使用含水醇例如含水甲醇是优选的。

根据本发明第三方面的方法，其中步骤(i)中所述混悬液的浓度为1-100mg/ml，例如2-50mg/ml，例如约2、5、10、15、20、25、50mg/ml。

根据本发明第三方面的方法，其中步骤(i)中所述超声处理的时间为5-100min，例如10-60min，例如15-50min，例如15、20、30、45、60min。根据本发明第三方面的方法，其中步骤(i)中超声处理是以功率250W、频率33kHz的条件超声处理10~60min，优选20~40min，例如约30min。

根据本发明第三方面的方法，其中步骤(i)中所述稀释是使以药材计的溶质在溶液中的浓度为1-10mg/ml，例如2-15mg/ml，例如3-10mg/ml，例如约3、4、5、7.5、10mg/ml。

根据本发明第三方面的方法，其中步骤(i)中所述稀释使用的稀释液是浓度为30-80%的甲醇水溶液，例如浓度40-70%的甲醇水溶液，例如约50%、约60%、约70%的甲醇水溶液。

根据本发明第三方面的方法，其中使用的液相色谱仪是Waters公司的UPLC系统。根据本发明第三方面的方法，其中使用的飞行时间质谱是Bruker公司的Q-TOF-MS系统。

根据本发明第三方面的方法，其中步骤(i)中所述洗脱程序如下：

 时间(min)  A(%)  B(%)  0  95  5  0.5  95  5  20  81.5  18.5  28  0  100  30  0  100  30.1  95  5  32  95  5

根据本发明第三方面的方法，其还对已知或符合规定的头花蓼制剂(例如热淋清颗粒)或者制备该制剂的头花蓼提取物进行测定的步骤。

根据本发明第三方面的方法，其还包括在步骤(iii)之后，将测试头花蓼制剂(例如热淋清颗粒)或者制备该制剂的头花蓼提取物的色谱图与已知或符合规定的头花蓼制剂(例如热淋清颗粒)或者制备该制剂的头花蓼提取物色谱图进行比较的步骤。在一个实施方案中，本发明第三方面的方法，其在步骤(iii)之后还包括如下步骤：将测试头花蓼制剂(例如热淋清颗粒)或者制备该制剂的头花蓼提取物的色谱图中各个峰面积大于主峰面积10%(例如大于20%)的色谱峰与已知或符合规定的头花蓼制剂(例如热淋清颗粒)或者制备该制剂的头花蓼提取物色谱图的相应色谱峰进行比较，比较二者保留时间的一致性。

根据本发明第三方面的方法，其中测试头花蓼制剂(例如热淋清颗粒)以及制备该制剂的头花蓼提取物所指认的色谱峰及其对应物质至少包括：

根据本发明第三方面的方法，其中测试头花蓼制剂(例如热淋清颗粒)以及制备该制剂的头花蓼提取物所指认的色谱峰及其对应物质至少包括：

根据本发明第三方面的方法，其中测试头花蓼制剂(例如热淋清颗粒)以及制备该制剂的头花蓼提取物所指认的色谱峰及其对应物质包括：

本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

在本发明中，术语“药物组合物”或者“制剂”，它们在本发明中具有相同或类似含义，即均包括活性物质例如头花蓼提取物以及任选的药学可接受的辅料。

在本发明中，术语“头花蓼药材”可以是头花蓼的干品或鲜品。在本发明中，术语头花蓼“提取物”可以是头花蓼药材经任何方法提取获得的提取物，例如溶剂(例如水、醇等)提取获得的，或者经超临界二氧化碳萃取获得的提取物。在本发明中，术语“头花蓼醇提取物”或者“头花蓼醇提浸膏”是指头花蓼用醇类溶剂(可以是含水或不含水的)或主要步骤用醇类溶剂提取所获得的提取物，所述醇类溶剂例如甲醇、乙醇等，例如其可以是如下方式获得：将头花蓼地上部分鲜品或干品加6-8倍量的5~90%乙醇回流提取1-3次，每次约1-5小时，过滤，使滤液浓缩、干燥，得醇提取物或醇浸膏。在本发明中，术语“头花蓼水提取物”是指头花蓼用水或主要步骤用水提取获得的提取物，例如参考中国药典2010年版一部“热淋清颗粒”项下的方法获得的头花蓼水提取物。尽管在本发明中头花蓼“提取物”可以是本发明提及的甚至是本发明未提及的，然而本发明作为一种检测方法，该方法的有效性并不会因为检测对象的改变而不能实施。恰恰相反，本发明方法一方面可以检测药材，另一方面还可以检测水提物，再一方面还可以检测醇提物，由此表明本发明适用场合非常广泛。

在本发明一个实施方案中，“头花蓼水提物”制备方法是：将头花蓼干品用10倍水(W/W)分成二次煎煮，每次1.5小时，过滤，合并滤液，将滤液浓缩至20℃时相对密度为1.1，浓缩液喷雾干燥得100目以上细粉。该头花蓼水提物还用于下文试验例作为试药。

在本发明一个实施方案中，“头花蓼醇提物”制备方法是：(1)将头花蓼地上部分鲜品或干品加7倍量的70%乙醇回流提取2次，每次约1.5小时，过滤，使滤液浓缩、干燥，得醇浸膏。

附图说明

图1为头花蓼药材UPLC-TOF-MS总离子流色谱图

图2为17批头花蓼药材及3批70%醇提浸膏UPLC-TOF-MS总离子流色谱图。图中样品1为头花蓼药材(SJ-2008，贵州盘县1)，样品2为头花蓼药材(PG-2008，贵州盘县2)，样品3为头花蓼药材(SC-2008，贵州水城)，样品4为头花蓼药材(PX090807-3，贵州盘县)，样品5为头花蓼药材(BJ090804-3，贵州毕节市)，样品6为头花蓼药材(LS090818-3，贵州雷山县)，样品7为头花蓼药材(KL090818-1，贵州凯里市)，样品8为头花蓼药材(NY090805-1，贵州纳雍县)，样品9为头花蓼药材(XR20100817，贵州兴仁县)，样品10为头花蓼药材(LD20100821，贵州罗甸县)，样品11为头花蓼药材(GZSQ20100902，贵州石阡县)，样品12为头花蓼药材(GZHZ20100925，贵州赫章县)，样品13为头花蓼药材(GXTL20100821-1，广西田林县)，样品14为头花蓼药材(SCXW20100924-2，四川兴文县)，样品15为头花蓼药材(SBYN20100918，云南腾冲引种)，样品16为头花蓼药材(Y001-10-11-16-05，贵州盘县)，样品17为头花蓼药材(Y001-10-11-05-01，贵州施秉GAP基地)，样品19为盘县70%醇提浸膏，样品21为施秉70%醇提浸膏，样品23为水城70%醇提浸膏。

图3为头花蓼水提物UPLC-TOF-MS总离子流色谱图。

图4、头花蓼水提浸膏及热淋清颗粒UPLC-TOF-MS总离子流色谱图。图中，样品18为盘县水提浸膏，样品20为施秉水提浸膏，样品22为水城水提浸膏，样品24为热淋清颗粒(含糖型)，样品25为热淋清颗粒(无糖型)。

图5、头花蓼水提浸膏与药材UPLC-TOF-MS总离子流色谱图比较，图中绿色(虚线)连接的表示共同的成分，红色(菱形)表示水提浸膏中新产生的峰。图中digalloylglucose表示二没食子酰基葡萄糖，trigalloylglucose表示三没食子酰基葡萄糖。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：头花蓼药材、提取物及制剂UPLC-TOF-MS指纹图谱分析

本实施例对本申请人提供的头花蓼药材、提取物及热淋清制剂进行了UPLC-TOF-MS(Waters公司UPLC；Bruker公司Q-TOF-MS)指纹图谱分析，鉴定了药材、提取物及制剂中的主要成分。鉴定结果表明头花蓼药材中主要含有黄酮及多酚类化合物。药材醇提浸膏的化学成分与药材很接近，而水提浸膏中的成分则有明显的化学变化，主要表现为没食子鞣质类成分的水解和缩合鞣质类成分(如原花青素B1,B2,B3,B4等)的损失。

1、测试药材的样品、编号及方法

  序号  药材样品编号  药材采集地或测试试样  1  SJ-2008  贵州盘县1  2  PG-2008  贵州盘县2  3  SC-2008  贵州水城  4  PX090807-3  贵州盘县  5  BJ090804-3  贵州毕节市  6  LS090818-3  贵州雷山县  7  KL090818-1  贵州凯里市  8  NY090805-1  贵州纳雍县  9  XR20100817  贵州兴仁县  10  LD20100821  贵州罗甸县  11  GZSQ20100902  贵州石阡县  12  GZHZ20100925  贵州赫章县  13  GXTL20100821-1  广西田林县  14  SCXW20100924-2  四川兴文县  15  SBYN20100918  云南腾冲引种  16  Y001-10-11-16-05  贵州盘县  17  Y001-10-11-05-01  贵州施秉GAP基地  18  10263  盘县水提浸膏  19  盘县70%醇提浸膏  20  10246  施秉水提浸膏  21  施秉70%醇提浸膏  22  10264  水城水提浸膏  23  水城70%醇提浸膏  24  101101  热淋清颗粒(含糖型)  25  101109  热淋清颗粒(无糖型)

以上，“水提浸膏”是参考2010年版中国药典一部热淋清颗粒项下提取方法获得，未加赋形剂；“70%醇提浸膏”制备方法是：将头花蓼地上部分干品10Kg，加7倍量的70%乙醇回流提取2次，每次约1.5小时，过滤，使滤液浓缩、干燥，得醇浸膏。

2、样品液制备：

头花蓼药材:称取适量头花蓼药材粉末,加入50%甲醇(浓度5mg/ml)，超声30分钟，离心(3000rpm,5min)，上清液过滤后，进样2μl作质谱检测。

头花蓼水提取物：称取适量头花蓼水提取物粉末,加入水(浓度5mg/ml)，超声使完全溶解，用甲醇稀释1倍，过滤，进样2μl作质谱检测。

头花蓼醇提取物：称取适量头花蓼醇提取物粉末,加入70%甲醇(浓度5mg/ml)，超声使尽量溶解，混悬液稀释10倍，过滤，进样2μl作质谱检测。

热林清颗粒(中国药典一部热淋清颗粒项下提取方法获得，无糖型)：称取热林清颗粒1g，加入10ml 50%甲醇，超声30分钟，离心(3000rpm，5min)，上清液过滤后，进样2μl作质谱检测。

3、色谱及质谱分析条件：

色谱柱：Acquity BEH C18柱(2.1×100mm，1.7μm)，柱温：40℃；流速：0.35ml/min；进样量：2μl。以0.1%甲酸水溶液为流动相A，0.1%甲酸乙腈溶液为流动相B，按下表的规定进行梯度洗脱。质谱条件：离子源：ESI源；干燥气体温度：180℃；毛细管电压：4500eV；检测模式：负离子模式；喷雾压力：2.5bar；干燥气(N2)流速：8L/min；扫描范围：100-2000amu。碰撞能量:10ev。

UPLC-TOF-MS梯度洗脱程序

 时间(min)  A(%)  B(%)  0  95  5  0.5  95  5  20  81.5  18.5  28  0  100  30  0  100  30.1  95  5  32  95  5

4、指纹图谱中色谱峰的鉴定

对上面试药进行测定。利用精确分子量，对头花蓼药材指纹图谱中25个色谱峰进行了推测和指认，头花蓼药材UPLC-TOF-MS总离子流色谱图见图1和下表。由指认结果可知，头花蓼药材中的成分以黄酮类和多酚类成分为主，包括(1)黄酮及黄酮苷类化合物：(峰16,18,20,21,22,23,24)，以黄酮为苷元，单糖或双糖苷，部分连有没食子酰基；(2)多酚类成分(峰1-15,17,19,20)，包括没食子可水解鞣质，儿茶素及其聚合体；(3)木脂素及其苷类化合物(峰19,25)等。

头花蓼药材UPLC-TOF-MS色谱图中指认的色谱峰

部分色谱峰所对应的物质及其化学结构如下：

1,3,6-三没食子酰葡萄糖(峰1)  原花青素B2(峰2)

carpinusin(峰11)  Davidiin(峰15)

头花蓼中部分黄酮及黄酮苷类化合物举例如下：

槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷：    R₁=OH，R₂=β-D-吡喃葡糖苷；

槲皮素-3-(2-没食子酰葡萄糖苷)： R₁=OH，R₂=2-没食子酰葡萄糖苷；

槲皮苷：                        R₁=OH，R₂=鼠李糖苷；

山奈酚3-(2-没食子酰葡萄糖苷)：  R₁=H，R₂=2-没食子酰葡萄糖苷。

头花蓼中木脂素类化合物举例如下：

5、各批药材及醇提浸膏指纹图谱

对17批头花蓼药材、3批头花蓼70%醇提浸膏行了UPLC-TOF-MS指纹图谱分析，它们的总离子流色谱图见图2中的各样品图。由图2可见，十七批药材的指纹图谱主要成分相似度很高，指认的25个色谱峰在编号1，7-15批药材中都可以找到；编号4，5，6批药材24号峰含量较低或者基本没有，编号17批药材9号峰含量较低或者基本没有，编号16批药材2、3、9、11、13、14、24号峰含量较低或者基本没有,编号2，3批药材2、3、5、7、8、11、13、17、19、22号峰含量较低或者基本没有。

6、头花蓼水提物、热淋清颗粒指纹图谱

(1)指纹图谱中色谱峰的指认

利用精确分子量，对头花蓼水提物指纹图谱中31个色谱峰进行了推测和指认，结果图3和下表。

表：头花蓼水提浸膏及热淋清颗粒UPLC-TOF-MS色谱图中指认的色谱峰

由结果可见，与药材及醇提浸膏相比，水提浸膏及制剂中的成分发生了以下明显的变化：(1)没食子鞣质的水解：表现为二没食子酰及三没食酰葡萄糖的明显增多。(2)儿茶素类化合物如原花青素B₁/B₂/B₃/B₄等的消失，可能该类化合物在水煎煮过程中发生了进一步的聚合或氧化。

(2)样品分析

对3批头花蓼水提浸膏、2种热淋清颗粒进行了UPLC-TOF-MS分析，结果见图4中的各样品图。由图4可见，3批头花蓼水提浸膏、2种热淋清颗粒的指纹图谱主要成分的色谱峰一致，指认的31个色谱峰在上述样品中都可以找到。

此外，对头花蓼水提浸膏与药材UPLC-TOF-MS总离子流色谱图比较，结果见图5。由以上可见头花蓼药材在经不同溶剂提取后物质指纹发生不同的变化。