双特异性、四价抗原结合蛋白

摘要

双特异性、四价抗原结合蛋白、其生成方法、含有所述抗体的药物组合物、及其用途。

说明书

本发明涉及双特异性、四价抗原结合蛋白、其生成方法、含有所述抗体 的药物组合物、及其用途。

发明背景

经工程化改造的蛋白质，诸如能够结合两种或更多种抗原的双或多特异 性抗体是本领域中已知的。可以使用细胞融合、化学缀合、或重组DNA技术 来生成此类多特异性结合蛋白。

最近已经开发出极其多种重组多特异性抗体形式，例如通过融合例如 IgG抗体形式和单链域得到的四价双特异性抗体(参见例如Coloma，M.J.等， Nature Biotech.15(1997)159-163；WO 2001/077342；及Morrison，S.L.，Nature  Biotech.25(2007)1233-1234)。

还有，已经开发出能够结合两种或更多种抗原的数种其它不再保留抗体 核心结构(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)的新形式，诸如双抗体、三抗体或 四抗体、微型抗体、数种单链形式(scFv、双-scFv)(Holliger，P.等，Nature  Biotech 23(2005)1126-1136；Fischer，N.和Léger，O.，Pathobiology 74(2007) 3-14；Shen，J.等，J.Immunol.Methods 318(2007)65-74；Wu，C.等，Nature  Biotech 25(2007)1290-1297)。

所有此类形式使用接头来融合抗体核心(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM) 与别的结合蛋白(例如scFv)或者融合例如两个Fab片段或scFv(Fischer，N. 和Léger，O.，Pathobiology 74(2007)3-14)。虽然接头在工程化改造双特异性抗 体方面具有优点是明显的，但是它们还可以引起治疗背景中的问题。实际上， 这些外来肽可以引发针对接头自身或蛋白质与接头间的接合的免疫应答。此 外，这些肽的柔性性质使它们更易于蛋白水解切割，这潜在地导致较差的抗 体稳定性、聚集和升高的免疫原性。另外，可能想要保留效应器功能，诸如 例如补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)，其是 经由Fc部分通过维持与天然存在的抗体的高度相似性来介导的。

如此，理想地，应当旨在开发在一般结构上与天然存在的抗体(如IgA、 IgD、IgE、IgG或IgM)非常相似的双特异性抗体，其与人序列具有最小的偏 离。

在一种方法中，已经使用四源杂交瘤(quadroma)技术(参见Milstein，C. 和Cuello，A.C.，Nature 305(1983)537-540)来生成与天然抗体非常类似的双 特异性抗体，所述四源杂交瘤技术基于两种不同的表达具有期望的双特异性 抗体特异性的鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞系的体细胞融合。由于所得的杂合 -杂交瘤(或四源杂交瘤)细胞系内的两种不同抗体重链和轻链的随机配对， 生成多达10种不同抗体种类，其中仅一种是期望的功能性双特异性抗体。由 于错配副产物的存在和显著降低的生产产量，意味着需要复杂的纯化规程 (参见例如Morrison，S.L.，Nature Biotech.25(2007)1233-1234)。一般地，若 使用重组表达技术，则仍存在相同的错配副产物问题。

一种避开错配副产物问题的方法(其称为“隆突-入-穴(knob-into-hole)”) 旨在通过将突变引入CH3域中来修饰接触界面，从而迫使两种不同抗体重链 配对。在一条链上，用具有较短侧链的氨基酸替换体积大的氨基酸以创建 “穴”。相反地，将具有较大侧链的氨基酸引入另一种CH3域中，以创建“隆 突”。通过共表达这两种重链(和两条相同的轻链，其必须适合于这两种重 链)，观察到异二聚体形成(“隆突-穴”)相对于同二聚体形成(“穴-穴”或 “隆突-隆突”)的高产量(Ridgway，J.B.等，Protein Eng.9(1996)617-621；及 WO 96/027011)。可以通过使用噬菌体展示法来重建两种CH3域的相互作用 表面并引入二硫桥以稳定化异二聚体来进一步提高异二聚体的百分比 (Merchant A.M等，Nature Biotech 16(1998)677-681；Atwell，S.等，J.Mol.Biol. 270(1997)26-35)。关于隆突-入-穴技术的新方法记载于例如EP 1 870 459 A1。 虽然此形式似乎非常有吸引力，但是目前不可获得描述通向临床的进展的数 据。此策略的一种重要的约束是两种亲本抗体的轻链必须相同，以阻止错配 和无活性分子的形成。如此，此技术不适合于容易地开发自针对第一和第二 抗原的两种抗体起始的针对两种抗原的重组双特异性抗体，因为这些抗体的 重链和/或相同的轻链必须是优化的。在替代二价、双特异性抗体，例如通过 将额外的Fab片段(每个与结合第一或第二抗原的相应抗体的Fab片段相同) 融合至异二聚体的每个重链C端来表达四价双特异性抗体时仍然有相同的错 配问题(参见图2)。

WO 2006/093794涉及异二聚蛋白结合组合物。WO 99/37791描述了多用 途抗体衍生物。Morrison，S.L.等the J.Immunolog，160(1998)2802-2808指出 可变区域交换对IgG功能特性的影响。

发明概述

本发明包含双特异性、四价抗原结合蛋白，其包含：

a)第一抗体的经修饰的重链，

所述第一抗体特异性结合第一抗原，

且另外将所述第一抗体的VH-CH1域经由其N端融合至所述重链的C端；

b)a)的所述第一抗体的两条轻链；

c)第二抗体的经修饰的重链，

所述第二抗体特异性结合第二抗原，

其中CH1域被所述第二抗体的CL域替换，且另外将所述第二抗体的 VH-CL域经由其N端融合至所述重链的C端；和

d)c)的所述第二抗体的两条经修饰的轻链，

其中CL域被所述第二抗体的CH1域替换。

本发明的别的实施方案是一种用于制备依照本发明的抗原结合蛋白的 方法，包括下列步骤：

a)用包含编码依照本发明的双特异性抗原结合蛋白的核酸分子的载体转 化宿主细胞，

b)在容许所述抗体分子合成的条件下培养所述宿主细胞；并

c)自所述培养物回收所述抗体分子。

本发明的别的实施方案是一种宿主细胞，其含有包含编码依照本发明的 抗原结合蛋白的核酸分子的载体。

本发明的别的实施方案是一种药物组合物，其包含依照本发明的抗原结 合蛋白和至少一种药学可接受赋形剂。

本发明的别的实施方案是一种用于治疗需要治疗的患者的方法，其特征 在于对所述患者施用治疗有效量的依照本发明的抗原结合蛋白。

依照本发明，可以通过在c)下的经修饰的重链中用CL域替换CH1及在d) 下的相应的两条经修饰的轻链来改善期望的双特异性、四价抗原结合蛋白与 不期望的副产物相比的比率。因此，可以降低(b的)特异性结合两个第一 抗原的抗体轻链与特异性结合两个第二抗原的抗体的(c的)经修饰的抗体 重链的错误VH-CH1域的不期望的错配。并且类似地，d)的经修饰的轻链与 a)的重链的错配。(参见没有这些修饰和错配的图2和具有这些CH1-CL替换 (或交换)及没有错配的图3)。

发明详述

本发明包含双特异性、四价抗原结合蛋白，其包含：

a)第一抗体的经修饰的重链，

所述第一抗体特异性结合第一抗原，

且另外将所述第一抗体的VH-CH1域经由其N端肽连接头融合至所述重 链的C端；

b)a)的所述第一抗体的两条轻链；

c)第二抗体的经修饰的重链，

所述第二抗体特异性结合第二抗原，

其中CH1域被所述第二抗体的CL域替换，且另外将所述第二抗体的 VH-CL域经由其N端肽连接头融合至所述重链的C端；和

d)c)的所述第二抗体的两条经修饰的轻链，

其中CL域被所述第二抗体的CH1域替换。

依照本发明，可以通过在c)下的经修饰的重链中用CL域替换CH1及在d) 下的相应的两条经修饰的轻链来改善期望的双特异性、四价抗原结合蛋白与 不期望的副产物(由于抗体轻链与错误抗体重链的错配所致)相比的比率。 此联络中的错配意指i)特异性结合第一抗原的抗体的轻链b)与特异性结合第 二抗原的抗体的经修饰的重链)；或ii)特异性结合第二抗原的抗体的轻链b) 与特异性结合第一抗原的抗体的经修饰的重链的联合(参见图2)，其导致不 期望的无活性或没有完整功能的副产物。

在本发明的别的方面，可以通过修饰特异性结合第一和第二抗原的所述 抗体的CH3域来进一步改善期望的双特异性、四价抗体与不期望的副产物相 比的此类改善的比率。

如此，在本发明的一个优选的实施方案中，可以通过“隆突-入-穴”技 术来改变依照本发明的所述双特异性、四价抗原结合蛋白的CH3域(在a和c) 的经修饰重链中)，所述“隆突-入-穴”技术以数个例子详细记载于例如WO 96/027011，Ridgway，J.B.等，Protein Eng 9(1996)617-621；及Merchant，A.M. 等，Nat Biotechnol 16(1998)677-681。在此方法中，改变两个CH3域的相互作 用表面以提高含有这两个CH3域的两条重链的异二聚化。(两条重链的)两 个CH3域之每个可以是“隆突”，而另一个是“穴”。二硫桥的引入进一步稳 定化异二聚体(Merchant，A.M.等，Nature Biotech 16(1998)677-681；Atwell，S. 等J.Mol.Biol.270(1997)26-35)并提高收率。

如此，在本发明的一个方面，所述双特异性、四价抗原结合蛋白的进一 步特征在于：

a)的抗体的经修饰的重链的CH3域和b)的抗体的经修饰的重链的CH3域 各自在包含所述抗体CH3域间的初始界面的界面处相遇；

-其中改变所述界面以促进所述双特异性、四价抗原结合蛋白的形成， 其中所述改变的特征在于：

i)改变一条重链的CH3域，

使得在一条重链的CH3域中与所述双特异性、四价抗原结合蛋白内的另 一条重链的CH3域的初始界面相遇的初始界面内，

氨基酸残基用具有较大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在一条重链的 CH3域的界面内产生突出，该突出可位于另一条重链的CH3域的界面内的穴 中，

并

ii)改变另一条重链的CH3域，

使得在第二CH3域中与所述双特异性、四价抗原结合蛋白内的第一CH3 域的初始界面相遇的初始界面内，

氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第二CH3域 的界面内产生穴，第一CH3域的界面内的突出可位于该穴内。

优选地，所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自下组：精氨酸(R)、 苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。

优选地，所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自下组：丙氨酸(A)、 丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)。

在本发明的一个方面，通过引入半胱氨酸(C)作为每个CH3域的相应位置 中的氨基酸，使得可以形成这两个CH3域间的二硫桥来进一步改变这两个 CH3域。

在一个优选的实施方案中，所述双特异性、四价抗原结合蛋白包含“隆 突链”的CH3域中的T366W突变和“穴链”的CH3域中的T366S、L368A、 Y407V突变。也可以使用CH3域间额外的链间二硫桥(Merchant，A.M.等， Nature Biotech.16(1998)677-681)，其例如通过将Y349C突变引入“隆突” 或“穴”链的CH3域中及将E356C突变或S354C突变引入另一条链的CH3域中 来实现。如此，在另一个优选的实施方案中，所述双特异性、四价抗原结合 蛋白包含两个CH3域的一个中的S354C、T366W突变和两个CH3域的另一个 中的Y349C、T366S、L368A、Y407V突变或者所述双特异性、四价抗原结 合蛋白包含两个CH3域的一个中的E356C、T366W突变和两个CH3域的另一 个中的Y349C、T366S、L368A、Y407V突变或者所述双特异性、四价抗原 结合蛋白包含两个CH3域的一个中的Y349C、T366W突变和两个CH3域的另 一个中的E356C、T366S、L368A、Y407V突变或者所述双特异性、四价抗原 结合蛋白包含两个CH3域的一个中的Y349C、T366W突变和两个CH3域的另 一个中的S354C、T366S、L368A、Y407V突变；(一个CH3域中的额外的Y349C 突变和另一个CH3域中的额外的E356C或S354C突变，其形成链间二硫桥) (编号方式总是依照Kabat的EU索引)。或者/另外，而且还可以使用如由EP 1 870 459 A1所描述的其它隆突-入-穴技术。所述三特异性或四特异性抗体的 一个优选的例子是“隆突链”的CH3域中的R409D；K370E突变和“穴链” 的CH3域中的D399K；E357K突变(编号方式总是依照Kabat的EU索引)。

在另一个优选的实施方案中，所述三特异性或四特异性抗体包含“隆突 链”的CH3域中的T366W突变和“穴链”的CH3域中的T366S、L368A、Y407V 突变及额外地“隆突链”的CH3域中的R409D；K370E突变和“穴链”的CH3 域中的D399K；E357K突变。

在另一个优选的实施方案中，所述三特异性或四特异性抗体包含两个 CH3域的一个中的Y349C、T366W突变和两个CH3域的另一个中的S354C、 T366S、L368A、Y407V突变或者所述三特异性或四特异性抗体包含两个CH3 域的一个中的Y349C、T366W突变和两个CH3域的另一个中的S354C、T366S、 L368A、Y407V突变及额外地“隆突链”的CH3域中的R409D；K370E突变 和“穴链”的CH3域中的D399K；E357K突变。

如本文中所使用的，术语“抗体”意指由两条抗体重链和两条抗体轻链 组成的全长抗体(参见图1)。全长抗体的重链是一种以N端至C端方向由抗 体重链可变域(VH)、抗体重链恒定域1(CH1)、抗体铰链区(HR)、抗体重链 恒定域2(CH2)、和抗体重链恒定域3(CH3)(缩写为VH-CH1-HR-CH2-CH3)； 和任选地抗体重链恒定域4(CH4)(在IgE亚类的抗体的情况中)组成的多肽。 优选地，全长抗体的重链是一种以N端至C端方向由VH、CH1、HR、CH2和 CH3组成的多肽。全长抗体的轻链是一种以N端至C端方向由抗体轻链可变域 (VL)和抗体轻链恒定域(CL)组成的多肽，缩写为VL-CL。抗体轻链恒定域(CL) 可以是κ(卡帕)或λ(拉姆达)。抗体链经由CL域和CH1域间(即轻链和重链间) 及全长抗体重链的铰链区间的多肽间二硫键连接在一起。典型全长抗体的例 子是天然的抗体，如IgG(例如IgG1和IgG2)、IgM、IgA、IgD、和IgE)。依 照本发明的抗体可以来自单一物种，例如人，或者它们可以是嵌合化的或人 源化的抗体。依照本发明的全长抗体包含各自由一对VH和VL形成的两个抗 原结合位点，它们都特异性结合同一(第一)抗原。所述全长抗体的重链或 轻链的C端意指所述重链或轻链的C端的最后一个氨基酸。所述抗体包含两 个相同的Fab片段，其由重链的VH和CH1域和轻链的VL和CL域组成。(参见 图1)。

在依照本发明的抗原结合蛋白中，特异性结合第二抗原的第二抗体的 CH1和CL域彼此替换，导致d)下的经修饰的轻链和c)下的经修饰的抗体重链， 另外将所述抗体(其特异性结合第二抗原)的VH-CL域经由其N端肽连接头 融合至所述重链的C端。

所述抗体(其特异性结合第一抗原)的“VH-CH1域”指N-至C-端方向 的所述抗体的VH和CH1域。并且所述抗体(其特异性结合第二抗原)的 “VH-CCL域”指N-至C-端方向的所述抗体的VH和CH1域。

如本发明内所使用的，术语“肽连接头”意指具有氨基酸序列的肽，其 优选地是合成起源的。使用依照本发明的这些肽连接头来将抗原结合肽与全 长和/或经修饰的全长抗体链的C或N端融合以形成依照本发明的双特异性抗 原结合蛋白。优选地，c)下的所述肽连接头是具有氨基酸序列的肽，具有至 少5个氨基酸的长度，优选地具有5至100，更优选地10至50个氨基酸的长度。 在一个实施方案中，所述肽连接头是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G＝甘氨酸， S＝丝氨酸，且(x＝3，n＝3、4、5或6，且m＝0、1、2或3)或(x＝4，n＝2、 3、4或5且m＝0、1、2或3)，优选地x＝4和n＝2或3，更优选地，其中x＝4， n＝2。在一个实施方案中，所述肽连接头是(G₄S)₂。

如本文中所使用的，术语“结合位点”或“抗原结合位点”意指依照本 发明的抗原结合蛋白中实际上与配体(例如，抗原或其抗原片段)结合并且 自抗体分子或其片段(例如Fab片段)衍生的区域。依照本发明的抗原结合 位点包含特异性结合期望的抗原的抗体或抗体片段的抗体重链可变域(VH) 和抗体轻链可变域(VL)。

特异性结合想要的抗原的抗原结合位点(即，VH/VL对)可以a)自针对 抗原的已知抗体或者b)自通过使用抗原蛋白或核酸或其片段等通过重新免 疫方法或者通过噬菌体展示获得的新抗体或抗体片段衍生。

本发明的抗原结合蛋白的抗原结合位点含有6个互补决定区(CDR)，其以 不同程度促成结合位点对抗原的亲和力。存在着3个重链可变域CDR (CDRH1、CDRH2和CDRH3)和3个轻链可变域CDR(CDRL1、CDRL2和 CDRL3)。通过与汇编的氨基酸序列数据库比较来确定CDR和框架区(FR)的 范围，在所述数据库中已经依照序列间的可变性限定那些区域。

抗体特异性指抗体或抗原结合蛋白对抗原的特定表位的选择性识别。例 如，天然抗体是单特异性的。双特异性抗体是具有两种不同抗原结合特异性 的抗体。在抗体具有超过一种特异性的情况中，识别的表位可以与单一抗原 或者与超过一种抗原有关。

如本文中所使用的，术语“单特异性”抗体或抗原结合蛋白意指具有一 个或多个各自结合同一抗原的同一表位的结合位点的抗体或抗原结合蛋白。

如本申请内所使用的，术语“价”意指抗体分子中存在规定数目的结合 位点。例如天然抗体或依照本发明的全长抗体具有两个结合位点，并且是二 价的。术语“四价”意指抗原结合蛋白中存在四个结合位点。如本文中所使 用的，术语“双特异性、四价”意指具有四个抗原结合位点且其中两个结合 第一抗原而两个结合第二抗原(或抗原的另一种表位)的依照本发明的抗原 结合蛋白。本发明的抗原结合蛋白具有四个结合位点，并且是四价的。

本发明的全长抗体包含一种或多种免疫球蛋白类别的免疫球蛋白恒定 区。免疫球蛋白类别包括IgG、IgM、IgA、IgD、和IgE同种型及在IgG和IgA 的情况中包括其亚型。在一个优选的实施方案中，本发明的全长抗体具有IgG 型抗体的恒定域结构。

如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单 一氨基酸组成的抗体制备物或抗体或抗原结合蛋白分子。

术语“嵌合抗体”指包含来自一种来源或物种的可变区，即结合区和至 少自不同来源或物种衍生的恒定区的一部分的抗体，其通常通过重组DNA 技术来制备。包含鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体是优选的。本发明涵盖的 “嵌合抗体”的其它优选形式是那些其中的恒定区已经自初始抗体的恒定区 修饰或改变以生成依照本发明的特性(特别地关于C1q结合/或Fc受体(FcR) 结合)的。此类嵌合抗体又称为“类别转换抗体”。嵌合抗体是包含编码免 疫球蛋白可变区的DNA区段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA区段的表达免 疫球蛋白基因的产物。用于生成嵌合抗体的方法牵涉常规的重组DNA和基因 转染技术，其是本领域中公知的。参见例如Morrison，S.L.等，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 81(1984)6851-6855；US 5,202,238和US 5,204,244。

术语“人源化抗体”指其中的框架或“互补决定区”(CDR)已经进行过 修饰以包含与亲本免疫球蛋白的特异性相比不同特异性的免疫球蛋白CDR 的抗体。在一个优选的实施方案中，将鼠CDR嫁接入人抗体的框架区中以制 备“人源化抗体”。参见例如Riechmann，L.等，Nature 332(1988)323-327；及 Neuberger，M.S.等，Nature 314(1985)268-270。特别优选的CDR对应于那些代 表识别上文关于嵌合抗体所记录的抗原的序列的。本发明涵盖的“人源化抗 体”的其它形式是那些其中的恒定区已经另外自初始抗体的恒定区进行过修 饰或改变以生成依照本发明的特性(特别地关于C1q结合/或Fc受体(FcR)结 合)的。

如本文中所使用的，术语“人抗体”意图包括具有自人种系免疫球蛋白 序列衍生的可变和恒定区的抗体。人抗体是现有技术中公知的(van Dijk M.A. 和van de Winkel，J.G.，Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368-374)。还可以在转 基因动物(例如小鼠)中生成人抗体，所述转基因动物在免疫后能够在没有 内源免疫球蛋白生成的情况中生成人抗体的完整全集或选集。在此类种系突 变体小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列会导致抗原考验后人抗体的生 成(参见例如Jakobovits，A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)2551-2555； Jakobovits，A.等，Nature 362(1993)255-258；Brueggemann，M.等，Year  Immunol.7(1993)33-40)。还可以在噬菌体展示文库中生成人抗体 (Hoogenboom，H.R.，和Winter，G.J.，Mol.Biol.227(1992)381-388；Marks，J.D. 等，J.Mol.Biol.222(1991)581-597)。Cole，S.P.C.等及Boerner等的技术还可用 于制备人单克隆抗体(Cole，S.P.C.等，Monoclonal Antibodies and Cancer  Therapy，Alan R.Liss p.77(1985)；及Boerner，P.等，J.Immunol.147(1991) 86-95)。如已经关于依照本发明的嵌合的和人源化的抗体所提及的，如本文 中所使用的，术语“人抗体”还包含此类如下的抗体，其在恒定区中进行修 饰以生成依照本发明的特性(特别地关于C1q结合/或FcR结合)，例如通过“类 别转换”，即Fc部分的变化或突变(例如自IgG1至IgG4和/或IgG1/IgG4突变) 来实现。

如本文中所使用的，术语“重组人抗体”意图包括通过重组手段制备、 表达、创建或分离的所有人抗体，诸如自宿主细胞诸如NS0或CHO细胞或自 人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)分离的抗体或使用转染入宿主 细胞中的重组表达载体表达的抗体。此类重组人抗体具有重排形式的可变区 和恒定区。依照本发明的重组人抗体已经进行过体内体细胞高突变。如此， 重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是如下的序列，其尽管自人种系VH和 VL序列衍生和与之相关，但是可以不在体内的人抗体种系全集内天然存在。

如本文中所使用的，“可变域”(轻链可变域(VL)、重链可变域(VH))意 指直接牵涉抗体对抗原结合的每对轻链和重链。人轻链和重链可变域具有相 同的一般结构，并且每个域包含通过3个“高变区”(或互补决定区，CDR) 连接的4个序列广泛保守的框架(FR)区。框架区采用β-片层构象，而CDR可以 形成连接β-片层结构的环。每条链中的CDR通过框架区保持其三维结构，并 且与来自另一条链的CDR一起形成抗原结合位点。抗体重链和轻链CDR3区 在依照本发明的抗体的结合特异性/亲和力中发挥特别重要的作用，并且因此 提供本发明的又一个目的。

术语“高变区”或“抗体的抗原结合部分”在本文中使用时指抗体中负 责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨 基酸残基。“框架”或“FR”区是那些与如本文中定义的高变区残基不同的 可变域区。因此，抗体的轻链和重链包含N至C端的域FR1、CDR1、FR2、 CDR2、FR3、CDR3、和FR4。每条链上的CDR被此类框架氨基酸分开。特 别地，重链的CDR3是最有助于抗原结合的区域。依照Kabat等，Sequences of  Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National  Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)的标准定义来确定CDR和FR区。

如本文中所使用的，术语“结合”、“特异性结合”、或“其特异性结合” 指在体外测定法中，优选地在使用纯化的野生型抗原的等离振子共振测定法 (BIAcore，GE-Healthcare Uppsala，Sweden)中抗体/抗原结合蛋白对抗原表位 的结合。通过术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体(或抗体或抗原结合蛋白) 的结合速率常数)、k_D(解离常数)、和K_D(k_D/ka)来限定结合亲和力。结合或 特异性结合意指10^-8mol/l或更小，优选地10^-9M至10^-13mol/l的结合亲和力 (K_D)。如此，依照本发明的双特异性、四价抗原结合蛋白以10^-8mol/l或更小， 优选地10^-9M至10^-13mol/l的结合亲和力(K_D)特异性结合其对之特异性的每种 抗原。

可以通过BIAcore测定法(GE-Healthcare Uppsala，Sweden)来调查抗体对 FcγRIII的结合。通过术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体的结合速率常数)、 k_D(解离常数)、和K_D(k_D/ka)来限定结合亲和力。

术语“表位”包括能够与抗体特异性结合的任何多肽决定簇。在某些实 施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面聚组，诸如氨基酸、糖侧链、 磷酰基、或磺酰基，并且在某些实施方案中可以具有特定的三维结构特征， 和/或特定的电荷特征。表位是抗原中被抗体结合的区域。

在某些实施方案中，在抗体优先识别其在蛋白质和/或大分子的复杂混合 物中的靶抗原时，其被说成特异性结合抗原。

在又一个实施方案中，依照本发明的双特异性抗原结合蛋白的特征在于 所述全长抗体是人IgG1亚类的，或具有突变L234A和L235A的人IgG1亚类的。

在又一个实施方案中，依照本发明的双特异性抗原结合蛋白的特征在于 所述全长抗体是人IgG2亚类的。

在又一个实施方案中，依照本发明的双特异性抗原结合蛋白的特征在于 所述全长抗体是人IgG3亚类的。

在又一个实施方案中，依照本发明的双特异性抗原结合蛋白的特征在于 所述全长抗体是人IgG4亚类的，或具有额外的突变S228P的人IgG4亚类的。

优选地，依照本发明的双特异性抗原结合蛋白的特征在于所述全长抗体 是人IgG1亚类的，具有额外的突变S228P的人IgG4亚类的。

现在已经发现了，依照本发明的双特异性抗原结合蛋白具有改善的特 征，诸如生物学或药理学活性、药动学特性或毒性。它们可以例如用于治疗 疾病诸如癌症。

如本申请内所使用的，术语“恒定区”意指抗体中与可变区不同的域的 总和。恒定区不直接牵涉抗原的结合，但是展现出多种效应器功能。根据其 重链恒定区的氨基酸序列，抗体分成类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并 且这些中的数种可以进一步分成亚类，诸如IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4、IgA1 和IgA2。与不同类别的抗体对应的重链恒定区分别称作α、δ、ε、γ、和μ。 可以在所有5种抗体类别中都找到的轻链恒定区(CL)称作κ(卡帕)和λ(拉 姆达)。

如本申请中所使用的，术语“自人起源衍生的恒定区”意指亚类IgG1、 IgG2、IgG3、或IgG4的人抗体的重链恒定区和/或轻链κ或λ恒定区。此类恒 定区是现有技术中公知的，并且例如由Kabat，E.A.(参见例如Johnson，G.和 Wu，T.T.，Nucleic Acids Res.28(2000)214-218；Kabat，E.A.等，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 72(1975)2785-2788)描述。

虽然IgG4亚类的抗体显示降低的Fc受体(FcgRIIIa)结合，但是其它IgG亚 类的抗体显示强的结合。然而，Pro238、Asp265、Asp270、Asn297(丧失Fc 碳水化合物)、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、 Lys288、Thr307、Gln311、Asn434、和His435是在改变时也提供降低的Fc受 体结合的残基(Shields，R.L.等，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604；Lund，J. 等，FASEB J.9(1995)115-119；Morgan，A.等，Immunology 86(1995)319-324； EP 0 307 434)。

在一个实施方案中，依照本发明的抗原结合蛋白与IgG1抗体相比具有降 低的FcR结合，而全长亲本抗体就FcR结合而言是IgG4亚类的或具有S228、 L234、L235和/或D265中的突变的IgG2或IgG1亚类的，和/或含有PVA236突 变。在一个实施方案中，全长亲本抗体中的突变是S228P、L234A、L235A、 L235E和/或PVA236。在另一个实施方案中，全长亲本抗体中的突变在IgG4 S228P中及在IgG1 L234A和L235A中。

抗体的恒定区直接牵涉ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)和 CDC(补体依赖性细胞毒性)。补体激活(CDC)通过补体因子C1q与大多数IgG 抗体亚类的恒定区的结合来启动。通过在所谓的结合位点处限定的蛋白质- 蛋白质相互作用引起C1q与抗体的结合。此类恒定区结合位点是现有技术中 已知的，并且例如由Lukas，T.J.等，J.Immunol.127(1981)2555-2560； Brunhouse，R.和Cebra，J.J.，Mol.Immunol.16(1979)907-917；Burton，D.R.等， Nature 288(1980)338-344；Thomason，J.E.等，Mol.Immunol.37(2000) 995-1004；Idusogie，E.E等，J.Immunol.164(2000)4178-4184；Hezareh，M.等， J.Virol.75(2001)12161-12168；Morgan，A.等，Immunology 86(1995)319-324； 及EP 0 307 434描述。此类恒定区结合位点例如以氨基酸L234、L235、D270、 N297、E318、K320、K322、P331、和P329(依照Kabat的EU索引编号)为 特征。

术语“抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)”指在存在效应细胞的情况 中通过依照本发明的抗原结合蛋白来裂解人靶细胞。优选地，通过在存在效 应细胞，诸如新鲜分离的PBMC或来自血沉棕黄层的纯化的效应细胞，如单 核细胞或天然杀伤(NK)细胞或永久生长NK细胞系的情况中用依照本发明的 抗原结合蛋白来处理抗原表达细胞的制备物来测量ADCC。

术语“补体依赖性细胞毒性(CDC)”意指通过补体因子C1q与大多数IgG 抗体亚类的Fc部分的结合启动的过程。通过在所谓的结合位点处限定的蛋白 质-蛋白质相互作用引起C1q与抗体的结合。此类Fc部分结合位点是现有技术 中已知的(参见上文)。此类Fc部分结合位点例如以氨基酸L234、L235、D270、 N297、E318、K320、K322、P331、和P329(依照Kabat的EU索引编号)为 特征。亚类IgG1、IgG2、和IgG3的抗体通常显示包括C1q和C3结合的补体激 活，而IgG4不激活补体系统，而且不结合C1q和/或C3。

单克隆抗体的细胞介导的效应器功能可以通过工程化改造其寡糖组分 来增强，如记载于Umana，P.等，Nature Biotechnol.17(1999)176-180，及US 6,602,684的。IgG1型抗体(最常使用的治疗性抗体)是在每个CH2域中具有 Asn297处的保守的N连接的糖基化位点的糖蛋白。两个附着于Asn297的复合 双触角寡糖掩埋于CH2域间，这形成与多肽主链的广泛接触，并且其存在对 于抗体介导效应器功能诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)是至关重要 的(Lifely，M.R.等，Glycobiology 5(1995)813-822；Jefferis，R.等，Immunol.Rev. 163(1998)59-76；Wright，A.和Morrison，S.L.，Trends Biotechnol.15(1997) 26-32)。Umana，P.等Nature Biotechnol.17(1999)176-180和WO 99/54342显 示了β(1，4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(“GnTIII”)(即一种催化两分型寡糖形成 的糖基转移酶)在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的过表达显著提高抗体的体外 ADCC活性。Asn297碳水化合物的组成改变或其消除还影响与FcγR和C1q的 结合(Umana，P.等，Nature Biotechnol.17(1999)176-180；Davies，J.等， Biotechnol.Bioeng.74(2001)288-294；Mimura，Y.等，J.Biol.Chem.276(2001) 45539-45547；Radaev，S.等，J.Biol.Chem.276(2001)16478-16483；Shields， R.L.等，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604；Shields，R.L.等，J.Biol.Chem. 277(2002)26733-26740；Simmons，L.C.等，J.Immunol.Methods 263(2002) 133-147)。

例如在WO 2005/018572、WO 2006/116260、WO 2006/114700、WO 2004/065540、WO 2005/011735、WO 2005/027966、WO 1997/028267、US 2006/0134709、US 2005/0054048、US 2005/0152894、WO 2003/035835、WO 2000/061739中报告了增强单克隆抗体的细胞介导的效应器功能的方法。

在本发明的一个优选的实施方案中，双特异性抗原结合蛋白是在Asn297 处用糖链糖基化的(若它包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类，优选地IgG1 或IgG3亚类的Fc部分)，其中所述糖链内的岩藻糖量是65％或更低(依照Kabat 编号)。在另一个实施方案中，所述糖链内的岩藻糖量是在5％和65％之间， 优选地在20％和40％之间。依照本发明的“Asn297”意指位于Fc区中的约第 297位的氨基酸天冬酰胺。基于抗体的次要序列变化，Asn297还可以位于第 297位上游或下游的一些氨基酸(通常不超过±3个氨基酸)，即在第294位和 第300位之间。在一个实施方案中，依照本发明的糖基化抗原结合蛋白IgG亚 类是人IgG1亚类的、具有突变L234A和L235A的人IgG1亚类的或IgG3亚类 的。在又一个实施方案中，在所述糖链内N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)的量是 1％或更小和/或N端α-1，3-半乳糖的量是1％或更小。优选地，糖链显示附着于 CHO细胞中重组表达的抗体的Asn297的N连接的聚糖的特征。

术语“糖链显示附着于CHO细胞中重组表达的抗体的Asn297的N连接的 聚糖的特征”意指依照本发明的全长亲本抗体的Asn297处的糖链与未修饰的 CHO细胞中表达的相同抗体的糖链，例如与WO 2006/103100中所报告的那 些糖链具有相同的结构和糖残基序列(除岩藻糖残基外)。

如本申请内所使用的，术语“NGNA”意指糖残基N-羟乙酰神经氨酸。

在Asn297处发生人IgG1或IgG3的糖基化，作为核心岩藻糖化双触角复合 寡糖糖基化以多至两个Gal残基为末端。Kabat，E.A.等，Sequences of Proteins  of Immunological Interest，第5版Public Health Service，National Institutes of  Health，Bethesda，MD.(1991)及Brüggemann，M.等，J.Exp.Med.166(1987) 1351-1361；Love，T.W.等，Methods Enzymol.178(1989)515-527详细报告了 IgG1或IgG3亚类的人重链恒定区。根据末端Gal残基的量，这些结构称为G0、 G1(α-1，6-或α-1，3-)、或G2聚糖残基(Raju，T.S.，Bioprocess Int.1(2003)44-53)。 抗体Fc部分的CHO型糖基化例如由Routier，F.H.，Glycoconjugate J.14(1997) 201-207描述。在非糖修饰的CHO宿主细胞中重组表达的抗体在Asn297处通 常以至少85％的量进行岩藻糖化。全长亲本抗体的经修饰的寡糖可以是杂合 的或复合的。优选地，两分型、还原的/非岩藻糖化的寡糖是杂合的。在另一 个实施方案中，两分型、还原的/非岩藻糖化的寡糖是复合的。

依照本发明，“岩藻糖的量”意指通过MALDI-TOF质谱术测量的，并以 平均值计算的，Asn297处糖链内所述糖相对于附着于Asn297的所有糖结构 (例如复合的、杂合的和高甘露糖结构)的总和的量。岩藻糖的相对量是通 过MALDI-TOF，含有岩藻糖的结构相对于经N-糖苷酶F处理的样品中鉴定的 所有糖结构(例如分别为复合的、杂合的及寡和高甘露糖结构)的百分比。

通过重组手段来生成依照本发明的抗原结合蛋白。如此，本发明的一方 面是编码依照本发明的抗原结合蛋白的核酸，而又一方面是包含所述编码依 照本发明的抗原结合蛋白的核酸的细胞。用于重组生成的方法是现有技术中 普遍已知的，并且包括在原核和真核细胞中的蛋白质表达，随后分离抗原结 合蛋白，并且通常纯化至药学可接受纯度。对于在宿主细胞中如前述那样表 达抗体，通过标准的方法将编码各经修饰的轻链和重链的核酸插入表达载体 中。在合适的原核或真核宿主细胞，如CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、 HEK293细胞、COS细胞、PER.C6细胞、酵母、或大肠杆菌细胞中实施表达， 并且自细胞(上清液或裂解后的细胞)回收抗原结合蛋白。用于重组生成抗 体的通用方法是现有技术中公知的，并且例如记载于综述文章Makrides，S.C.， Protein Expr.Purif.17(1999)183-202；Geisse，S.等，Protein Expr.Purif.8(1996) 271-282；Kaufman，R.J.，Mol.Biotechnol.16(2000)151-161；Werner，R.G.， Drug Res.48(1998)870-880。

通过常规的免疫球蛋白纯化规程，诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石 层析、凝胶电泳、透析、或亲和层析来自培养液适当地分离依照本发明的双 特异性抗原结合蛋白。容易使用常规规程将编码单克隆抗体的DNA或RNA 分离并测序。杂交瘤细胞可以充当此类DNA和RNA的来源。一旦分离，可以 将DNA插入表达载体中，然后将所述表达载体转染入在其它情况中不生成免 疫球蛋白蛋白质的宿主细胞诸如HEK 293细胞、CHO细胞、或骨髓瘤细胞中， 以获得重组单克隆抗体在宿主细胞中的合成。

通过将合适的核苷酸变化引入抗原结合蛋白DNA中，或者通过核苷酸合 成来制备双特异性抗原结合蛋白的氨基酸序列变体(或突变体)。然而，仅 可以在非常有限的范围中实施此类修饰，例如如上文所描述的。例如，修饰 不改变上文所提及的抗体特征诸如IgG同种型和抗原结合，但是可以改善重 组生成的产量、蛋白质稳定性或者便于纯化。

如本申请中所使用的，术语“宿主细胞”意指可以工程化改造以生成依 照本发明的抗体的任何种类的细胞系统。在一个实施方案中，使用HEK293 细胞和CHO细胞作为宿主细胞。如本文中所使用的，表述“细胞”、“细胞系”、 和“细胞培养物”可互换使用，并且所有此类名称包括后代。如此，词语“转 化体”和“经转化的细胞”包括原代主题细胞和自其衍生的培养物，而不管 传递的次数。还应当理解，由于有意或无意的突变，所有后代在DNA内容上 可能不是正好相同的。包括具有如在初始转化细胞中筛选的相同功能或生物 学活性的变体后代。

例如，Barnes，L.M.等，Cytotechnology 32(2000)109-123；Barnes，L.M.等， Biotech.Bioeng.73(2001)261-270描述了NS0细胞中的表达。例如，Durocher， Y.等，Nucl.Acids.Res.30(2002)E9描述了瞬时表达。Orlandi，R.等，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 86(1989)3833-3837；Carter，P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289；及Norderhaug，L.等，J.Immunol.Methods 204(1997) 77-87描述了可变域的克隆。Schlaeger，E.-J.和Christensen，K.，于 Cytotechnology 30(1999)71-83及Schlaeger，E.-J.，于J.Immunol.Methods 194 (1996)191-199描述了一种优选的瞬时表达系统(HEK 293)。

适合于原核生物的控制序列例如包括启动子，任选地操纵基因序列，和 核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、增强子和多腺苷酸化信号。

在将核酸放置在与另一种核酸序列的功能性关系中时，它是“可操作连 接的”。例如，若前序列或分泌前导的DNA以参与多肽分泌的前蛋白表达， 则它与多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响序列的转录，则它与 编码序列可操作连接；或者若核糖体结合位点定位为使得便于翻译，则它与 编码序列可操作连接。一般而言，“可操作连接的”意指所连接的DNA序列 是连续的，并且在分泌前导的情况中，是连续的且在读码框中。然而，增强 子不必是连续的。通过在方便的限制性位点处的连接来实现连接。若不存在 此类位点，则依照常规的实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。

通过标准的技术，包括碱/SDS处理、CsCl分带、柱层析、琼脂糖凝胶电 泳、和本领域中公知的其它技术来实施抗体纯化以消除细胞组分或其它污染 物，例如其它细胞核酸或蛋白质。参见Ausubel，F.等编Current Protocols in  Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York (1987)。不同方法是完善建立的，并且广泛用于蛋白质纯化，诸如用微生物 蛋白质的亲和层析(例如，蛋白A或蛋白G亲和层析)、离子交换层析(例如， 阳离子交换(羧甲基树脂)、阴离子交换(氨乙基树脂)和混合模式交换)、 亲硫性吸附(例如，用β-巯基乙醇和其它SH配体)、疏水性相互作用或芳香 族吸附层析(例如，用苯基-Sepharose、亲氮杂芳烃性树脂(aza-arenophilic  resin)、或间-氨基苯基硼酸)、金属螯合物亲和层析(例如，用Ni(II)-和Cu(II)- 亲和材料)、大小排阻层析、和电泳方法(诸如凝胶电泳、毛细管电泳) (Vijayalakshmi，M.A.，Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。

本发明的一方面是包含依照本发明的抗原结合蛋白的药物组合物。本发 明的另一方面是依照本发明的抗原结合蛋白用于制备药物组合物的用途。本 发明的又一方面是用于制备包含依照本发明的抗原结合蛋白的药物组合物 的方法。在另一方面，本发明提供了含有与药用载体一起配制的依照本发明 的抗原结合蛋白的组合物，例如药物组合物。

本发明的另一方面是用于治疗癌症的所述药物组合物。

本发明的另一方面是用于治疗癌症的依照本发明的双特异性抗原结合 蛋白。

本发明的另一方面是依照本发明的抗原结合蛋白用于制备供治疗癌症 用的药物的用途。

本发明的另一方面是治疗患有癌症的患者的方法，其通过对需要此类治 疗的所述患者施用依照本发明的抗原结合蛋白来进行。

如本文中所使用的，“药用载体”包括生理学相容的任何和所有溶剂、 分散介质、涂层材料、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂，等等。 优选地，载体适合于静脉内、肌肉内、皮下、胃肠外、脊柱或表皮施用(例 如通过注射或输注)。

可以通过本领域中已知的多种方法来施用本发明的组合物。如熟练技术 人员会领会的，施用的路径和/或模式会随期望的结果而变化。为了通过某些 施用路径来施用本发明的化合物，可能有必要用某种材料包被化合物，或者 与某种材料共施用化合物以阻止其失活。例如，可以将化合物在合适的载体， 例如脂质体或稀释剂中对受试者施用。药学可接受稀释剂包括盐水和水性缓 冲溶液。药用载体包括无菌水溶液或分散体和供临场制备无菌可注射溶液或 分散体用的无菌粉剂。对药学活性物质使用此类介质和药剂是本领域中已知 的。

如本文中所使用的，短语“胃肠外施用”意指通常通过注射进行的与肠 和表面施用不同的施用模式，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、 鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、 囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。

如本文中所使用的，术语癌症指增殖性疾病，诸如淋巴瘤、淋巴细胞性 白血病、肺癌、非小细胞肺(NSCL)癌、支气管肺泡细胞肺癌(bronchioloalviolar  cell lung cancer)、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌(cancer of the head or neck)、 皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌(cancer of the anal  region)、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、结肠癌、乳腺癌、子宫 癌、输卵管癌(carcinoma of the fallopian tubes)、子宫内膜癌(carcinoma of the  endometrium)、宫颈癌(carcinoma of the cervix)、阴道癌(carcinoma of the  vagina)、外阴癌(carcinoma of the vulva)、霍奇金氏病(Hodgkin’s Disease)、食 管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织 肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾 盂癌(carcinoma of the renal pelvis)、间皮瘤、肝细胞癌、胆管癌(biliary cancer)、 中枢神经系统(CNS)新生物、脊柱轴肿瘤(spinal axis tumor)、脑干胶质瘤、多 形性成胶质细胞瘤(glioblastoma multiforme)、星形细胞瘤(astrocytoma)、施万 细胞瘤(schwanomas)、室管膜瘤(ependymona)、髓母细胞瘤(medulloblastoma)、 脑脊膜瘤(meningioma)、鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma)、垂体腺瘤 (pituitary adenoma)和尤因肉瘤(Ewings sarcoma)，包括任何上述癌症的顽固性 型式，或一种或多种上述癌症的组合。

这些组合物还可以含有佐剂诸如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可 以通过无菌规程，见上文，及通过包括各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟 基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、酚、山梨酸等来确保阻止微生物的存在。还可能 期望将等张剂，诸如糖、氯化钠等纳入组合物中。另外，可以通过包括延迟 吸收的药剂诸如单硬脂酸铝和明胶来引起可注射药物形式的吸收延迟。

不管选择的施用路径，通过本领域技术人员已知的常规方法来将本发明 的化合物(其可以以合适的水合形式使用)和/或本发明的药物组合物配制成 药学可接受剂量形式。

可以改变活性成分在本发明的药物组合物中的实际剂量水平，从而获得 对于实现特定患者的期望的治疗响应、组成、和施用模式有效的，而对患者 无毒的活性成分量。选定的剂量水平会取决于多种药动学因素，包括所采用 的本发明的特定组合物的活性、施用路径、施用时间、所采用的特定化合物 的排泄速率、治疗的持续时间、与所采用的特定组合物组合使用的其它药物、 化合物和/或材料、所治疗的患者的年龄、性别、重量、状况、一般健康和先 前的医学史等医学领域公知的因素。

组合物必须是无菌的，而且是流体的，其程度使得组合物通过注射器可 投递。在水外，载体优选地是等张缓冲盐水溶液。

可以例如通过使用涂层材料诸如卵磷脂、在分散体的情况中通过维持所 要求的粒度、及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况中， 优选在组合物中包含等张剂(例如糖、多元醇诸如甘露醇或山梨醇、和氯化 钠)。

如本文中所使用的，表述“细胞”、“细胞系”、和“细胞培养物”可互 换使用，并且所有此类名称包括后代。如此，词语“转化体”和“经转化的 细胞”包括原代主题细胞和自其衍生的培养物，而不考虑转移的次数。还应 当理解，由于有意或无意的突变，所有后代在DNA内容上可能不是正好相同 的。包括具有与在初始转化细胞中筛选的相同功能或生物学活性的变体后 代。在意图独特的名称的情况中，其从上下文看会是明显的。

如本文中所使用的，术语“转化”指将载体/核酸转移入宿主细胞中的过 程。若使用没有难以应付的细胞壁屏障的细胞作为宿主细胞，则例如通过磷 酸钙沉淀法来实施转染，如Graham和Van der Eh，Virology 52(1978)546ff所描 述的。然而，也可以使用其它用于将DNA导入细胞中的方法，诸如通过核注 射或者通过原生质体融合来进行。若使用原核细胞或含有坚固细胞壁构造的 细胞，则例如一种转染方法是使用氯化钙进行的钙处理，如Cohen，S.N.等， PNAS.69(1972)2110-2114所描述的。

如本文中所使用的，“表达”指将核酸转录成mRNA的过程和/或随后将 转录的mRNA(又称为转录物)翻译成肽、多肽、或蛋白质的过程。转录物 和编码的多肽统称为基因产物。若多核苷酸是自基因组DNA衍生的，则真核 细胞中的表达可以包括mRNA的剪接。

“载体”指将插入的核酸分子转移入宿主细胞中和/或在宿主细胞间转移 的核酸分子，特别是自我复制的。该术语包括主要在将DNA或RNA插入细胞 (例如，染色体整合)方面发挥功能的载体、主要在DNA或RNA复制方面发 挥功能的复制载体、和在DNA或RNA的转录和/或翻译方面发挥功能的表达 载体。还包括提供超过一种功能的载体，如所描述的。

“表达载体”指在导入合适的宿主细胞中时可以被转录并翻译成多肽的 多核苷酸。“表达系统”通常指包含能发挥功能以产生期望的表达产物的表 达载体的合适的宿主细胞。

提供以下实施例、序列表和图以帮助理解本发明，其实际范围在所附权 利要求书中列出。应当理解，可以在不背离本发明的精神的前提下对所列规 程做出修饰。

序列表的描述

SEQ ID NO：1具有C端融合的<Ang-2>抗体VH-CH1域的<Ang-2>抗体经 修饰的重链

SEQ ID NO：2未修饰的<Ang-2>抗体轻链

SEQ ID NO：3具有CH1-CL交换及具有C端融合的<VEGF>抗体VH-CL 域的<VEGF>抗体经修饰的重链

SEQ ID NO：4具有CH1-CL交换的<VEGF>抗体经修饰的轻链(<VEGF> 抗体VL-CH1域)

附图简述

图1具有两对包含典型次序的可变和恒定域的重链和轻链，特异性结合 第一抗原1的没有CH4域的全长抗体的示意性结构。

图2结合第一抗原1和第二抗原2且其中没有将域交换，导致例示性的不 想要的副产物，降低双特异性、四价抗体的收率的两种错配可能性 (四种中的)的示意性结构。

图3依照本发明的双特异性、四价抗原结合蛋白的示意性结构——通过 特异性结合第二抗原的抗体的重链和轻链中的CH1和CL域交换削 弱错配。

图4依照本发明的具有隆突和穴的例示性双特异性、四价抗原结合蛋白 的示意性结构。

实施例

材料和通用方法

关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息参见：Kabat， E.A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health  Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)。抗体链的氨基酸依 照EU编号方式(Edelman，G.M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 63(1969)78-85； Kabat，E.A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public  Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，(1991))编号并提 及。

重组DNA技术

使用标准的方法来操作DNA，如记载于Sambrook，J.等，Molecular cloning： A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor， New York，1989的。依照制造商的指令使用分子生物学试剂。

基因合成

自通过化学合成生成的寡核苷酸制备期望的基因区段。通过寡核苷酸的 退火和连接，包括PCR扩增，随后经由指定的限制性位点，例如KpnI/SacI 或AscI/PacI克隆入基于pPCRScript(Stratagene)的pGA4克隆载体中来装配基 因区段，其侧翼有单一的限制性内切核酸酶切割位点。通过DNA测序来确认 亚克隆的基因片段的DNA序列。依照给定的规格在Geneart(Regensburg， Germany)定购基因合成片段。

DNA序列测定

通过在MediGenomix GmbH(Martinsried，Germany)或Sequiserve GmbH (Vaterstetten，Germany)实施的双链测序来测定DNA序列。

DNA和蛋白质序列分析及序列数据管理

使用GCG(Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin)软件包第10.2 版和Infomax的Vector NT1 Advance套件第8.0版来进行序列创建、定位、分析、 注释和例示。

表达载体

对于所描述的双特异性四价抗体的表达，应用用于瞬时表达(例如在 HEK293 EBNA或HEK293-F细胞中)的表达质粒的变体，其基于具有或没有 CMV-内含子A启动子的cDNA构造或基于具有CMV启动子的基因组构造。

在抗体表达盒外，载体含有：

-复制起点，其容许此质粒在大肠杆菌中复制，和

-β-内酰胺酶基因，其在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性。

抗体基因的转录单元由下列元件构成：

-5’端的独特限制性位点

-来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子，

-在cDNA构造的情况中接着有内含子A序列，

-人抗体基因的5’-非翻译区，

-免疫球蛋白重链信号序列，

-人双特异性四价抗体链(野生型或具有域交换)，其作为cDNA或作 为具有免疫球蛋白外显子-内含子构造的基因组构造

-具有多腺苷酸化信号序列的3’非翻译区，和

-3’端的独特限制性位点。

通过PCR和/或基因合成来生成如下文所描述的包含所描述的抗体链的 融合基因，并用已知重组方法和技术例如使用各载体中的独特限制性位点通 过连接相符的核酸区段来装配。通过DNA测序来确认亚克隆的核酸序列。为 了瞬时转染，通过来自经转化的大肠杆菌培养物的质粒制备物来制备更大量 的质粒(Nucleobond AX，Macherey-Nagel)。

细胞培养技术

使用标准的细胞培养技术，如记载于Current Protocols in Cell Biology， Bonifacino，J.S.，Dasso，M.，Harford，J.B.，Lippincott-Schwartz，J.和Yamada， K.M.(编)，John Wiley & Sons，Inc的(2000)。

通过在贴壁生长的HEK293-EBNA中或在悬浮生长的HEK29-F细胞中瞬 时共转染各三种表达质粒来表达双特异性四价抗体，如下文所描述的。

HEK293-EBNA系统中的瞬时转染

通过在补充有10％超低IgG FCS(胎牛血清，Gibco)、2mM L-谷氨酰胺 (Gibco)、和250μg/ml遗传霉素(Gibco)的DMEM(Dulbecco氏改良Eagle氏培 养基，Gibco)中培养的贴壁生长的HEK293-EBNA细胞(表达埃巴病毒核抗 原的人胚肾细胞系293；美国典型培养物保藏中心保藏号ATCC#CRL-10852， Lot.959218)中瞬时共转染各三种表达质粒(例如，编码经修饰的重链，及 相应的轻链和经修饰的轻链)来表达双特异性四价抗体。对于转染，以 FuGENE^TM试剂(μl)与DNA(μg)的比率为4∶1(范围为3∶1至6∶1)使用FuGENE^TM6转染试剂(Roche Molecular Biochemicals)。使用(经修饰的和野生型)轻链 和经修饰的重链编码质粒的摩尔比率为1∶1∶1(等摩尔)(其范围为1∶1∶2至 2∶2∶1)分别自各质粒表达蛋白质。在第3天用加至4mM的L-谷氨酰胺、葡萄 糖[Sigma]和NAA[Gibco]饲养细胞。在转染后第5天至第11天通过离心来收获 含有双特异性四价抗体的细胞培养物上清液，并于-20℃贮存。关于人免疫 球蛋白在例如HEK293细胞中的重组表达的一般信息参见：Meissner，P.等， Biotechnol.Bioeng.75(2001)197-203。

HEK293-F系统中的瞬时转染

或者，使用HEK293-F系统(Invitrogen)依照制造商的指令通过各质粒(例 如编码经修饰的重链，及相应的轻链和经修饰的轻链)的瞬时转染来生成双 特异性四价抗体。简言之，用如上文所描述的三种表达质粒和293fectin或 Fectin(Invitrogen)的混合物转染在无血清FreeStyle 293表达培养基(Invitrogen) 中在摇瓶中或在搅动式发酵罐中悬浮生长的HEK293-F细胞(Invitrogen)。对于 2L摇瓶(Corning)，以1.0E*6个细胞/mL的密度在600mL中接种HEK293-F细 胞，并以120rpm，8％CO₂温育。次日，以约1.5E*6个细胞/mL的细胞密度用 约42mL A)20mL具有600μg总质粒DNA(1μg/mL)(编码等摩尔比率的经修饰 的重链、相应的轻链和相应的经修饰的轻链)的Opti-MEM(Invitrogen)和B) 20ml Opti-MEM+1.2mL 293Fectin或Fectin(2μl/mL)的混合物转染细胞。依 照葡萄糖消耗，在发酵过程期间添加葡萄糖溶液。在5-10天后收获含有分泌 的抗体的上清液，并自上清液直接纯化抗体，或者将上清液冷冻并贮存。

蛋白质测定

使用依照Pace，C.N.等，Protein Science，1995，4，2411-1423基于氨基酸序 列计算的摩尔消光系数，通过测定280nm的光密度(OD)来测定纯化的双特异 性四价抗体和衍生物的蛋白质浓度。

上清液中的抗体浓度测定

通过用蛋白A琼脂糖珠(Roche)的免疫沉淀来评估细胞培养物上清液中 的双特异性四价抗体的浓度。将60μL蛋白A琼脂糖珠在TBS-NP40(50mM Tris，pH 7.5，150mM NaCl，1％Nonidet-P40)中清洗三次。随后，将1-15mL细 胞培养物上清液应用于在TBS-NP40中预平衡的蛋白A琼脂糖珠。于室温温育 1小时后，将珠在Ultrafree-MC-过滤柱(Amicon]上用0.5mL TBS-NP40清洗一 次，用0.5mL 2x磷酸盐缓冲盐水(2xPBS，Roche)清洗两次，并用0.5mL 100mM 钠的柠檬酸盐pH 5,0短暂清洗4次。通过添加35μlLDS样品缓冲液 (Invitrogen)来洗脱结合的抗体。分别将样品的一半与样品还原剂 组合或者保持未还原，并于70℃加热10分钟。因此，将5-30μl应用于4-12％ Bis-Tris SDS-PAGE(Invitrogen)(对于非还原性SDS-PAGE用 MOPS缓冲液，而对于还原性SDS-PAGE用含抗氧化剂运行缓冲液 添加剂(Invitrogen)的MES缓冲液)，并用考马斯蓝染色。

通过亲和HPLC层析来定量测量细胞培养物上清液中的双特异性四价抗 体的浓度。简言之，在Agilent HPLC 1100系统上，将含有结合蛋白A的抗体 和衍生物的细胞培养物上清液应用于200mM KH₂PO₄、100mM钠的柠檬酸 盐，pH 7.4中的Applied Biosystems Poros A/20柱，并用200mM NaCl、100mM 柠檬酸，pH 2,5自基质洗脱。通过UV吸光度和峰面积级分来量化洗脱的蛋白 质。纯化的标准IgG1抗体充当标准品。

或者，通过三明治式-IgG-ELISA来测量细胞培养物上清液中的双特异性 四价抗体的浓度。简言之，用100μL/孔0.1μg/mL的生物素化的抗人IgG捕捉 分子F(ab’)2<h-Fcγ>BI(Dianova)包被StreptaWell高结合链霉亲合素A-96孔微 量滴定板(Roche)，于室温持续1小时或者备选地于4℃过夜，随后用200μL/ 孔PBS、0.05％Tween(PBST，Sigma)清洗三次。将100μL/孔各含有抗体的细 胞培养物上清液在PBS(Sigma)中的稀释系列添加至孔，并在微量滴定板摇动 器上于室温温育1-2小时。将孔用200μL/孔PBST清洗三次，并用100μl 0.1μg/mL的F(ab‘)2<hFcγ>POD(Dianova)作为检测抗体在微量滴定板摇动器 上于室温检测结合的抗体达1-2小时。用200μL/孔PBST将未结合的检测抗体 洗掉三次，并通过添加100μL ABTS/孔来检测结合的检测抗体。在Tecan Fluor 光谱仪上以405nm的测量波长(参照波长492nm)实施吸光度测定。

蛋白质纯化

参考标准的方案自经过过滤的细胞培养物上清液纯化蛋白质。简言之， 将双特异性四价抗体应用于蛋白A Sepharose柱(GE healthcare)，并用PBS清 洗。在pH 2.8实现双特异性四价抗体的洗脱，接着立即中和样品。通过在PBS 中或在20mM组氨酸、150mM NaCl pH 6.0中的大小排阻层析(Superdex 200， GE Healthcare)将聚集的蛋白质与单体抗体分离。将单体级分合并，若需要的 话，使用例如MILLIPORE Amicon Ultra(30MWCO)离心浓缩器来浓缩，冷 冻，并于-20℃或-80℃贮存。为随后的蛋白质分析学和分析表征(例如通过 SDS-PAGE、大小排阻层析或质谱术进行)提供样品的一部分。

SDS-PAGE

依照制造商的指令，使用预制凝胶系统(Invitrogen)。具体地， 使用10％或4-12％Bis-TRIS预制凝胶(pH 6.4)和 MES(还原性凝胶，具有抗氧化剂运行缓冲液添加剂) 或MOPS(非还原性凝胶)运行缓冲液。

分析用大小排阻层析

通过HPLC层析来实施用于测定双特异性四价抗体的聚集和寡聚状态的 大小排阻层析。简言之，将蛋白A纯化的抗体应用于Agilent HPLC 1100系统 上在300mM NaCl、50mM KH₂PO₄/K₂HPO₄，pH 7.5中的Tosoh TSKgel G3000SW柱，或者应用于Dionex HPLC-系统上在2x PBS中的Superdex 200 柱(GE Healthcare)。通过UV吸光度和峰面积级分来量化洗脱的蛋白质。 BioRad凝胶过滤标准品151-1901充当标准品。

质谱术

经由电喷射离子化质谱术(ESI-MS)来测定并确认双特异性四价抗体的 总脱糖基化质量。简言之，将100μg纯化的抗体用50mU在100mM KH₂PO₄/K₂HPO₄，pH 7中的N-糖苷酶F(PNGaseF，ProZyme)于37℃以多至 2mg/ml的蛋白质浓度脱糖基化12-24小时，随后经由Sephadex G25柱(GE  Healthcare)上的HPLC脱盐。脱糖基化并还原后，通过ESI-MS来测定经修饰 的重链、轻链和经修饰的轻链各自的质量。简言之，将115μl中的50μg双特 异性四价抗体与60μl 1M TCEP和50μl 8M盐酸胍一起温育，随后脱盐。在装 备有NanoMate源的Q-Star Elite MS系统上经由ESI-MS来测定总质量和还原 的重链和轻链的质量。

VEGF结合ELISA

在ELISA测定法中用全长VEGF165-His蛋白(R&D Systems)来评估双特 异性四价抗体的结合特性。出于此目的，用100μl 2μg/mL在PBS中的重组人 VEGF165(R&D Systems)包被Falcon聚苯乙烯清洁增强型微量滴定板，于室 温持续2小时或于4℃过夜。将孔用300μl PBST(0,2％Tween 20)清洗三次，并 用200μl 2％BSA 0,1％Tween 20于室温封闭30分钟，随后用300μl PBST清洗 三次。将100μL/孔纯化的双特异性四价抗体在PBS(Sigma)中的系列稀释添加 至孔，并在微量滴定板摇动器上于室温温育1小时。将孔用300μl PBST(0,2％ Tween 20)清洗三次，并用100μL/孔0.1μg/ml在2％BSA 0,1％Tween 20中的 F(ab‘)<hFcgamma>POD(Immuno research)作为检测抗体在微量滴定板摇动 器上于室温检测结合的抗体达1小时。将未结合的检测抗体用300μL/孔PBST 洗掉三次，并通过添加100μL ABTS/孔来检测结合的检测抗体。以405nm的 测量波长(参照波长492nm)在Tecan Fluor光谱仪上实施吸光度测定。

VEGF结合：通过表面等离振子共振(Biacore)于37℃对VEGF结合的动力学 表征

为了进一步确证ELISA发现，依照以下方案在Biacore T100仪上使用表面 等离振子共振技术来定量分析双特异性四价抗体对VEGF的结合，并使用 T100软件包来分析：简言之，经由结合山羊抗人IgG(JIR109-005-098)在CM5- 芯片上捕获双特异性四价抗体。如下使用标准的氨基偶联通过氨基偶联来固 定化捕捉抗体：HBS-N缓冲液充当运行缓冲液，以700个RU的配体密度为目 标通过EDC/NHS的混合物来完成活化。将捕捉抗体在偶联缓冲液NaAc，pH 5.0中稀释，c＝2μg/mL，最后通过注射1M乙醇胺来封闭仍活化的羧基基团。 以5μL/分钟的流动和c＝10nM(用运行缓冲液+1mg/mL BSA稀释)完成双特 异性四价<VEGF>抗体的捕获；应当达到约30个RU的捕获水平。使用rhVEGF (rhVEGF，R&D-Systems产品目录编号293-VE)作为分析物。于25℃或37℃在 作为运行缓冲液的PBS+0.005％(v/v)Tween20中实施VEGF与双特异性四 价<VEGF>抗体结合的动力学表征。以300-0.29nM的rhVEGF浓度系列以 50μL/分钟的流动及80秒结合时间和1200秒解离时间注射样品。在每次分析 物循环后用10mM甘氨酸pH 1.5和60秒接触时间实施游离的捕捉抗体表面的 再生。通过使用通常的双重参照方法来计算动力学常数(对照参照：rhVEGF 对捕捉分子山羊抗人IgG的结合，测量流动池上的空白，rhVEGF浓度“0”， 模型：朗缪尔结合1∶1，(由于捕捉抗体结合，Rmax设置为局部))。

Ang-2结合ELISA

在ELISA测定法中用全长Ang-2-His蛋白(R&D Systems)评估双特异性四 价抗体的结合特性。出于此目的，用100μl 1μg/mL在PBS中的重组人Ang-2 (R&D Systems，无载体)包被Falcon聚苯乙烯清洁增强型微量滴定板，于 室温持续2小时或于4℃过夜。将孔用300μl PBST(0,2％Tween 20)清洗三次， 并用200μl 2％BSA 0,1％Tween 20于室温封闭30分钟，随后用300μl PBST清 洗三次。将100μL/孔纯化的双特异性四价抗体在PBS(Sigma)中的系列稀释添 加至孔，并在微量滴定板摇动器上于室温温育1小时。将孔用300μl PBST (0,2％Tween 20)清洗三次，并用100μL/孔0.1μg/ml在2％BSA 0,1％Tween 20 中的F(ab‘)<hk>POD(Biozol产品目录编号206005)作为检测抗体在微量滴 定板摇动器上于室温检测结合的抗体达1小时。将未结合的检测抗体用 300μL/孔PBST洗掉三次，并通过添加100μL ABTS/孔来检测结合的检测抗 体。以405nm的测量波长(参照波长492nm)在Tecan Fluor光谱仪上实施吸 光度测定。

Ang-2结合BIACORE

使用BIACORE T 100仪(GE Healthcare Biosciences AB，Uppsala，Sweden) 通过表面等离振子共振来调查双特异性四价抗体对人Ang-2的结合。简言之， 对于亲和力测量，经由胺偶联将山羊<hIgG-Fcγ>多克隆抗体固定化于CM5芯 片上以呈现针对人Ang-2的双特异性四价抗体。在HBS缓冲液(HBS-P(10mM HEPES、150mM NaCl、0.005％Tween 20，ph 7.4)，25℃中测量结合。以在溶 液中的多个浓度添加纯化的Ang-2-His(R&D Systems或内部纯化的)。通过3 分钟的Ang-2注射来测量结合；通过用HBS缓冲液清洗芯片表面达3分钟来测 量解离，并使用1∶1朗缪尔结合模型来评估KD值。由于Ang-2制备物的异质性， 没能观察到1∶1结合；如此，KD值仅是相对估值。自样品曲线扣除阴性对照 数据(例如缓冲液曲线)以校正系统固有基线漂移并用于噪声信号降低。使 用Biacore T100评估软件第1.1.1版来分析传感图(sensorgram)并计算亲和力数 据。或者，可以经由五His抗体(五His-Ab无BSA，Qiagen No.34660)以 2000-1700个RU的捕捉水平捕捉Ang-2，所述五His抗体经由胺偶联(无BSA) 固定化于CM5芯片上(参见下文)。

Ang-2-VEGF桥接ELISA

在ELISA测定法中用固定化的全长VEGF165-His蛋白(R&D Systems)和 用于检测结合的双特异性抗体的人Ang-2-His蛋白(R&D Systems)来评估双特 异性四价抗体的结合特性。仅双特异性四价<VEGF-Ang-2>抗体能够同时结 合VEGF和Ang-2，并且如此桥接两种抗原，而单特异性“标准”IgG1抗体不 能同时结合VEGF和Ang-2(图7)。

出于此目的，用100μl2μg/mL在PBS中的重组人VEGF165(R&D Systems) 包被Falcon聚苯乙烯清洁增强型微量滴定板，于室温持续2小时或于4℃过夜。 将孔用300μl PBST(0,2％Tween 20)清洗三次，并用200μl 2％BSA 0,1％ Tween 20于室温封闭30分钟，随后用300μl PBST清洗三次。将100μL/孔纯化 的双特异性四价抗体在PBS(Sigma)中的系列稀释添加至孔，并在微量滴定板 摇动器上于室温温育1小时。将孔用300μl PBST(0,2％Tween 20)清洗三次， 并通过添加100μl 0.5μg/ml在PBS中的人Ang-2-His(R&D Systems)来检测结 合的抗体。将孔用300μl PBST(0,2％Tween 20)清洗三次，并用100μl 0.5μg/mL <Ang-2>mIgG1-生物素抗体(BAM0981，R&D Systems)于室温检测结合的 Ang-2达1小时。将未结合的检测抗体用300μl PBST(0,2％Tween 20)洗掉三 次，并通过添加100μl在封闭缓冲液中以1∶4稀释的1∶2000链霉亲合素-POD缀 合物(Roche Diagnostics GmbH，产品目录编号11089153)于室温检测结合的 抗体达1小时。将未结合的链霉亲合素-POD缀合物用300μl PBST(0,2％ Tween 20)洗掉3-6次，并通过添加100μL ABTS/孔来检测结合的链霉亲合素 -POD缀合物。在Tecan Fluor光谱仪上以405nm的测量波长(参照波长492nm) 实施吸光度测定。

通过Biacore证明双特异性四价抗体<VEGF-Ang-2>对VEGF-A和Ang-2的同 时结合

为了进一步确证来自桥接ELISA的数据，依照以下方案在Biacore T100 仪上使用表面等离振子共振技术，建立别的测定法来确认对VEGF和Ang-2 的同时结合，并使用T100软件包(T100 Control，第2.01版，T100 Evaluation， 第2.01版，T100 Kinetics Summary，第1.01版)来分析：经由五His抗体(五 His-Ab无BSA，Qiagen No.34660)在PBS，0.005％(v/v)Tween20运行缓冲液 中以2000-1700个RU的捕获水平捕获Ang-2，所述五His抗体经由胺偶联(无 BSA)固定化于CM5芯片上。HBS-N缓冲液充当偶联过程中的运行缓冲液， 通过EDC/NHS的混合物完成活化。将五His-Ab无BSA捕捉抗体在偶联缓冲液 NaAc，pH 4.5中稀释，c＝30μg/mL，最后通过注射1M乙醇胺来封闭仍活化的 羧基基团；测试5000和17000个RU的配体密度。以5μL/分钟的流动用运行缓 冲液+1mg/mL BSA稀释，具有500nM浓度的Ang-2被五His-Ab捕获。随后， 通过与rhVEGF一起温育，并形成三明治式复合物来证明<Ang-2，VEGF>双特 异性四价抗体对Ang-2及对VEGF的结合。出于此目的，将双特异性四价 <VEGF-Ang-2>抗体以50μL/分钟的流动和100nM的浓度(用运行缓冲液+ 1mg/mL BSA稀释)结合Ang-2，并通过以50μL/分钟的流动和150nM的VEGF 浓度与PBS+0.005％(v/v)Tween20运行缓冲液中的VEGF(rhVEGF， R&D-Systems产品目录编号293-VE)一起温育来检测同时结合。结合时间 120秒，解离时间1200秒。每个循环后用2x10mM甘氨酸pH 2.0以50μL/分钟 的流动和60秒接触时间来完成再生。使用通常的双重参照(对照参照：双特 异性抗体和rhVEGF对捕捉分子五HisAb的结合)来校正传感图。用rhVEGF 浓度“0”测量每种抗体的空白。

HEK293-Tie2细胞系的生成

为了测定<Ang-2，VEGF>双特异性四价抗体干扰Ang-2刺激的Tie2磷酸 化及Ang-2对细胞上的Tie2的结合，生成重组HEK293-Tie细胞系。简言之， 使用Fugene(Roche Applied Science)作为转染试剂将在CMV启动子和新霉素 抗性标志物控制下编码全长人Tie2的基于pcDNA3的质粒(RB22-pcDNA3 Topo hTie2)转染入HEK293细胞(ATCC)中，并在DMEM 10％FCS，500μg/ml G418中选择抗性细胞。经由克隆圆筒分离个别的克隆，随后通过FACS来分 析Tie2表达。克隆22鉴定为即使在没有G418的情况中也具有高的且稳定的 Tie2表达的克隆(HEK293-Tie2克隆22)。随后，使用HEK293-Tie2克隆22来进 行细胞测定法：Ang-2诱导的Tie2磷酸化和Ang-2细胞配体结合测定法。

Ang-2诱导的Tie2磷酸化测定法

依照以下测定法原理来测量<Ang-2，VEGF>双特异性四价抗体对Ang-2 诱导的Tie2磷酸化的抑制。在没有或存在Ang-2抗体的情况中用Ang-2刺激 HEK293-Tie2克隆22达5分钟，并通过三明治式ELISA来量化P-Tie2。简言之， 将每孔2x10⁵个HEK293-Tie2克隆22细胞在经聚-D-赖氨酸包被的96孔微量滴 定板上在100μl DMEM、10％FCS、500μg/ml遗传霉素中培养过夜。次日， 在微量滴定板中制备<Ang-2，VEGF>双特异性四价抗体的滴定行(4倍浓缩 的，75μl终体积/孔，一式两份)，并将其与75μl Ang-2(R&D systems#623-AN] 稀释(3.2μg/ml作为4倍浓缩溶液)混合。将抗体和Ang-2于室温预温育15分 钟。将100μl混合物添加至HEK293-Tie2克隆22细胞(与1mM NaV₃O₄，Sigma #S6508一起预温育5分钟)，并于37℃温育5分钟。随后，将细胞用每孔200μl 冰冷的PBS+1mM NaV₃O₄来清洗，并通过添加冰上的每孔120μl裂解缓冲液 (20mM Tris，pH 8.0、137mM NaCl、1％NP-40、10％甘油、2mM EDTA、1mM NaV₃O₄、1mM PMSF和10μg/ml抑肽酶(Aprotinin))来裂解。将细胞于4℃在微 量滴定板摇动器上裂解30分钟，并在没有先前离心的情况中及在没有总蛋白 质测定的情况中将100μl溶胞物直接转移入p-Tie2 ELISA微量滴定板(R&D Systems，R&D#DY990)中。依照制造商的指令来量化P-Tie2量，并使用Excel 的XLfit4分析插件程序(剂量-响应一位点，205模型)来测定抑制的IC50值。 IC50值可以在一个实验内比较，但是在实验间可能存在变化。

VEGF诱导的HUVEC增殖测定法

选择VEGF诱导的HUVEC(人脐静脉内皮细胞，Promocell#C-12200) 增殖以测量<Ang-2，VEGF>双特异性四价抗体的细胞功能。简言之，将每96 孔5000个HUVEC细胞(低传代数目，小于等于5次传代)在经胶原I包被的 BD Biocoat胶原I 96孔微量滴定板(BD#354407/35640)中在100μl饥饿培养基 (EBM-2内皮基础培养基2、Promocell#C-22211，0.5％FCS、青霉素/链霉素) 中温育过夜。将变化浓度的<Ang-2，VEGF>双特异性四价抗体与rhVEGF(30 ngl/ml终浓度，BD#354107)混合，并于室温预温育15分钟。随后，将混合 物添加至HUVEC细胞，并将它们于37℃，5％CO₂温育72小时。在分析当天， 将平板平衡至室温达30分钟，并使用CellTiter-GloTM发光细胞存活力测定试 剂盒依照手册(Promega，#G7571/2/3)来测定细胞存活力/增殖。在光谱仪中测 定发光。

实施例1

识别Ang-2和VEGF-A的双特异性、四价抗原结合蛋白的生成、表达、纯化 和表征

在第一个实施例中，通过经由(G4S)4-连接头将识别Ang-2的抗体的 VH-CH1域融合物与识别Ang-2的所述抗体的重链的C端融合(SEQ1)；并通过 经由(G4S)4-连接头将识别VEGF-A的抗体的VH-CL域融合物与识别VEGF的 CH1-CL交换抗体的重链的C端融合(SEQ3)来生成识别Ang-2和VEGF-A的双 特异性、四价抗原结合蛋白。为了诱导两个相应重链的异二聚化，SEQ 1含 有例如隆突序列(T366W)，而SEQ2含有例如穴序列T366S、L368A和Y407V 及两个引入的半胱氨酸残基S354C/Y349’C以在异二聚化后形成稳定化的二 硫桥。为了获得依照本发明的双特异性、四价抗原结合蛋白，将此重链构建 体与编码Ang-2抗体的相应轻链(SEQ2)和识别VEGF-A的VL-CH1域融合物 (SEQ4)的质粒共表达。图4中给出了具有隆突-入-穴修饰的相应双特异性、四 价抗原结合蛋白的通用方案。

通过经典的分子生物学技术如在通用方法部分中所描述的那样生成双 特异性、四价抗原结合蛋白，并在HEK293F细胞中瞬时表达，如上文所描述 的。随后，通过蛋白A亲和层析和大小排阻层析的组合来自上清液将其纯化。 在身份方面(通过质谱术)及在分析特征诸如纯度(通过SDS-PAGE)、单体 含量和稳定性方面表征所获得的产物。

这些数据显示了双特异性、四价抗原结合蛋白可以以良好的产量生成， 而且是稳定的。

随后，通过上文所描述的ELISA和Biacore测定法来研究对Ang-2和 VEGF-A的结合及同时结合，并分析功能特性诸如对Tie2磷酸化的抑制和对 VEGF诱导的HUVEC增殖的抑制，显示生成的双特异性四价抗体能够同结合 Ang-2和VEGF-A，并时阻断它们的活性。