丽江云杉体细胞胚胎发生与植株再生方法

摘要

本发明涉及一种丽江云杉体细胞胚胎发生与植株再生方法，包括：采集丽江云杉自由授粉无性系的球果，分离出成熟合子胚进行体胚发生培养；所述体胚发生培养分为：胚性愈伤组织诱导阶段、胚性愈伤组织增殖阶段、体细胞胚成熟阶段和体细胞胚萌发阶段。和现有技术相比，所述方法有利于维持胚性愈伤组织的胚性能力，降低了丧失胚性能力的风险，分化率和萌发率均有提高；为丽江云杉的大规模无性繁殖育苗提供一种周期短、繁殖率高且成本低廉的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及林业中细胞工程种苗繁殖领域，具体地，涉及一种丽江云杉体细胞胚胎发生与植株再生方法。

背景技术

丽江云杉（Picea likiangensis）松科，云山属。常绿乔木，高可达40米。小枝淡黄灰色，有密毛。叶条行，四棱状或微扁平，四面有气孔线，常0.8~0.5厘米。球果柱形或卵状圆柱形，长4~9米，成熟前紫红色或紫黑色。种鳞薄，斜方状软形，边缘有波状缺齿。产于中国四川西南部，云南西北部高山地带，组成大面积单纯林。木材轻软、耐用，可供建筑、枕木、器具、造纸等用材。又为观赏树。木材纹理直，结构致密，材质优良，易加工。它是我国西南地区重要的寒温性针叶树种，具有生长快、材质优良的特点，是其分布区的主要造林树种，也被作为庭园观赏树种普遍栽培。目前人工造林及庭院绿化用苗主要是通过实生繁殖进行的，但丽江云杉结实较晚，种子成熟率很低，致使丽江云杉良种苗供不应求，远远不能满足造林需求。

体细胞胚胎发生是细胞工程中植株再生的重要途径之一，可作为遗传转化的受体系统，同时也是为研究全能性细胞分化及其形态而建成的理想试验体系。在应用上，体细胞胚胎发生是一种有效的大规模无性繁殖方法。在目前已成功诱导体胚形成的植物中，草本植物占了大多数，已有40多种木本植物获得了体细胞胚，尤其是用常规无性繁殖技术很难生根的针叶树的体胚发生研究取得了令人瞩目的进展，20多种不同的针叶树的外植体成功诱导出体细胞胚。

就丽江云杉体细胞胚胎发生与植株再生方法，目前有文献进行了公开：丽江云杉体细胞胚胎发生（陈芳等，《林业科学》，第46卷第8期，162~167页，2010年8月），该文献选取丽江云杉成熟种子进行胚胎发生，所用的基本培养基为改良P6、1/2MS及LP培养基，生长调节剂（激素）的浓度较高，不利于维持胚性愈伤组织的胚性能力，且丧失胚性能力的风险较高，分化率低，成本也较高。

因此，开发出一种新的丽江云杉体细胞胚胎发生与植株再生方法，克服现有技术存在的不足，是非常有必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种丽江云杉体细胞胚胎发生与植株再生方法。该方法有利于维持胚性愈伤组织的胚性能力，降低了丧失胚性能力的风险。

本发明提供的一种丽江云杉体细胞胚胎发生与植株再生方法，包括：采集丽江云杉自由授粉无性系的球果，分离出成熟合子胚进行体胚发生培养；所述体胚发生培养分为四个阶段：胚性愈伤组织诱导阶段、胚性愈伤组织增殖阶段、体细胞胚成熟阶段和体细胞胚萌发阶段。

其中，分离出成熟合子胚进行体胚发生培养是在无菌条件下进行的。

其中，所述胚性愈伤组织诱导阶段：采用1/2LM基本培养基，附加激素为1.1~2.2mg/L的2,4-氯化苯氧乙酸（2,4-dichlorophenoxyaceticacid，以下简称2,4-D）和0.55~1.1mg/L的6-苄基氨基嘌呤（benzylaminmopurine，以下简称6-BA）。所述2,4-D优选2.2mg/L，6-BA优选0.8mg/L。

其中，所述胚性愈伤组织诱导阶段的培养基中，还包括：浓度为1~3%的蔗糖，500mg/L的谷氨酰胺，1g/L的酶解酪蛋白和0.2~0.3%的植物凝胶。所述蔗糖浓度优选1%，植物凝胶优选为0.2%。

其中，所述胚性愈伤组织增殖阶段：采用1/2LM液体培养基，细胞体积与培养液体积比为1:2~1:12，优选1:2~1:9，更优选1:5~1:9，其中以1:9最优。

其中，所述胚性愈伤组织增殖阶段的培养基中，附加激素为0~2.2mg/L的2,4-D和0~1.1mg/L的6-BA，优选0.55~2.2mg/L的2,4-D和0.275~1.1mg/L的6-BA，更优选2.2mg/L的2,4-D和1.1的6-BA。

其中，2,4-D的浓度优选为6-BA的2倍。

其中，所述胚性愈伤组织增殖阶段的培养基中，还包括：500mg/L的谷氨酰胺，1~4%的蔗糖和1g/L的酶解酪蛋白。蔗糖优选1~3%，更优选3%。

本发明所述方法，诱导阶段和增殖阶段使用的激素浓度均较现有技术的低一些，这样有利于维持胚性愈伤组织的胚性能力。并且，增殖阶段本发明采用的是液体培养，有利于将胚性愈伤组织较快的增殖到一定的量，从而降低其丧失胚性能力的风险。

其中，所述体细胞胚成熟阶段：采用1/2LM基本培养基，附加激素为12~16mg/L的脱落酸（abscisic acid，以下简称ABA），优选为16mg/L。

其中，所述体细胞胚成熟阶段的培养基中，还包括：0~7.5%的聚乙二醇4000（简称PEG4000），0~1%的活性炭，0.3~0.6%的植物凝胶，6%的蔗糖，500mg/L的谷氨酰胺和1g/L的水解酪蛋白。PEG4000优选3~7.5%，更优选7.5%。植物凝胶优选0.4~0.6%，更优选0.4%。

其中，所述胚性愈伤组织诱导阶段、胚性愈伤组织增殖阶段和体细胞胚成熟阶段的培养条件均为：将培养基的pH值调至5.8，121℃、压力101kp，高温、高压灭菌20分钟，培养温度为24±1℃，黑暗条件培养。

本发明所述方法，体细胞胚成熟阶段较现有技术降低了PEG和ABA的浓度，这不仅降低了采用体胚大规模繁殖丽江云杉的成本，而且大大提高了分化率。

其中，体细胞胚萌发阶段：采用1/4LM基本培养基，其中还包括：250~500mg/L的谷氨酰胺，0~0.25%的活性炭，0~17.6mg/L的抗坏血酸，2%的蔗糖，1mg/L的水解酪蛋白和0.4%植物凝胶。所述谷氨酰胺优选500mg/L，活性炭优选0.25%。

其中，所述体细胞胚的萌发阶段的培养条件均为：在24±1℃，80μEm^-2s^-1下光照培养16h。

本发明所述的方法，在对成熟合子胚进行体胚发生培养前，还包括：对球果进行消毒，然后在无菌的环境下取出成熟合子胚。

其中，所述消毒方式为：利用75~95%的乙醇对丽江云杉球果消毒15~20min，再用无菌水冲洗3~4次。优选：利用95%的乙醇消毒对丽江云杉球果15min，再用无菌水冲洗3次。

进一步地，在消毒前还可以对球果与4℃条件下冷藏0~30天。优选4℃条件下冷藏7天。

经过冷藏和消毒处理的球果，会使得诱导率增加，污染率低于0.1%。

本发明中出现的浓度百分数“%”均指质量-体积浓度g/mL（100mL溶液里需要添加的克数）。

截至目前为止，国外采用幼嫩的茎尖为外植体进行诱导最多只能诱导出胚性愈伤组织，均不能分化为体细胞胚。本申请的发明人尝试过用种子发芽的子叶、胚轴和胚根为外植体进行诱导，也均未诱导出培养愈伤组织，所以本发明利用整个合子胚作为外植体。其次，本发明利用自由授粉的种子较杂交的云杉种子易获得，所以优先使用自由授粉的球果，等整个体系成熟之后可以采用杂交的球果，符合本发明的研究目的，即是通过体细胞胚胎发生来大规模扩增丽江云杉的优良家系。

本发明提供的方法，是专门针对丽江云杉天然结实率低，种子成熟率很低，扦插生根困难，种苗繁殖技术无法满足大面积植树造林需要的现状，寻找一种丽江云杉优良无性系的体细胞胚胎发生与植株再生的技术。和现有技术相比，该方法有利于维持胚性愈伤组织的胚性能力，降低了丧失胚性能力的风险，分化率和萌发率均有提高。为丽江云杉的大规模无性繁殖育苗提供一种周期短、繁殖率高且成本低廉的方法。

附图说明

图1为丽江云杉的成熟合子胚。

图2为丽江云杉的胚性愈伤组织。

图3为丽江云杉的成熟体细胞胚。

图4为丽江云杉的体细胞胚萌发的植株。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明所用植物凝胶Gelrite购自：美国Sigma公司。它是一种冷凝胶，跟琼脂的作用相同，但效果要好很多，培养基凝的快且是透明的。本发明所用其他原料和试剂均为从市场上购得的常规原料和试剂。

LM液体培养基的成分为：1.65g/L NH₄NO₃，1.9g/L KNO₃，1.85g/L MgSO4·7H₂0，0.34g/L KH₂PO₄，0.2g/L Myo-Inositol（肌醇），2g/L N-Z-Amine A（酶解酪蛋白），0.022g/L CaCl₂·2H₂0，0.028g/L，FeSO₄·7H₂0，0.038g/L EDTA·2H₂0（乙二胺四乙酸），0.0304g/LH₃BO₃，0.0210g/L MnSO₄·H₂0，0.043g/L ZnSO₄·7H₂0，0.001g/LNiacinamide（尼克酰胺），0.0002g/L Pyroxidone-HCl（Vitamin B6），0.0002g/L Thiamine-HCl（Vitamin B1），0.0042g/L KI，0.00126g/LNa₂MoO₄·2H₂0，0.0005g/L CuSO₄·5H₂0，0.00013g/L CoCl₂6H₂0，加水至1L。

LM基本培养基就是在上述液体培养基的基础上添加每个培养阶段所需的植物凝胶的半固体培养基。

实施例1

分离出成熟合子胚：采集春季自由授粉，8月底获得的无性系球果，将采下的球果于4℃条件下低温冷藏7天。用95%的乙醇处理球果15min，无菌水冲洗3次。无菌状态下，取出种子并剥去种皮，将成熟合子胚（如图1所示）进行下一阶段的胚性愈伤组织诱导。

实施例2

胚性愈伤组织诱导阶段：将实施例1得到的成熟合子胚进行胚性愈伤组织诱导，采用1/2LM基本培养基，附加激素浓度分别为2,4-D2.2mg/L和6-BA0.55mg/L，添加1g/L的天然复合物酶解酪蛋白，培养基中含1%的蔗糖，500mg/L的谷氨酰胺(过滤灭菌)和0.2%的植物凝胶（Gelrite，Sigma）。灭菌前将pH调至5.8，121℃、压力101kp高温、高压灭菌20分钟，培养温度24±1℃，黑暗条件培养，至诱导出胚性愈伤组织。

成熟合子胚接入上述培养基后约2~3天开始启动，长出的愈伤组织淡黄、半透明。25天左右，有的形成绿色瘤状坚硬的愈伤组织，继代（继代方式和本阶段的条件完全一致）后褐变，而有的则长出白色、半透明、粘质的丝状胚性愈伤组织。这种愈伤组织在显微镜下观察，多为细胞核大、细胞质浓的细胞。

实施例3

胚性愈伤组织诱导阶段：将实施例1得到的成熟合子胚进行胚性愈伤组织诱导，采用1/2LM基本培养基，附加激素浓度分别为2,4-D2.2mg/L和6-BA0.8mg/L，添加1g/L的天然复合物酶解酪蛋白，培养基中含1%的蔗糖，500mg/L的谷氨酰胺(过滤灭菌)和0.2%的植物凝胶（Gelrite,Sigma）。灭菌前将pH调至5.8，121℃、压力101kp高温、高压灭菌20分钟，培养温度24±1℃，黑暗条件培养，至诱导出胚性愈伤组织。

实施例4

胚性愈伤组织诱导阶段：将实施例1得到的成熟合子胚进行胚性愈伤组织诱导，采用1/2LM基本培养基，附加激素浓度分别为2,4-D2.2mg/L和6-BA1.1mg/L，添加1g/L的天然复合物酶解酪蛋白，培养基中含1%的蔗糖，500mg/L的谷氨酰胺(过滤灭菌)和0.2%的植物凝胶（Gelrite,Sigma）。灭菌前将pH调至5.8，121℃、压力101kp高温、高压灭菌20分钟，培养温度24±1℃，黑暗条件培养，至诱导出胚性愈伤组织。

实施例5

胚性愈伤组织的增殖阶段：将实施例2得到的胚性愈伤组织进行增殖，使用的是1/2LM液体培养基，细胞体积与培养液体积的比值为1:5，生长素2,4-D和细胞分裂素6-BA浓度分别为2.2和1.1mg/L，而蔗糖的浓度为2%。酶解酪蛋白浓度为1g/L，谷氨酰胺则为500mg/L，且培养条件均与诱导阶段相同。根据本实施例得到的胚性愈伤组织的生长量为：7.781±0.19。如图2所示。

实施例6

胚性愈伤组织的增殖阶段：其他条件同实施例5，细胞体积与培养液体积（接种量）的比值为1:2，1:5（实施例5），1:9和1:12；胚性愈伤组织的生长量如下表所示：

从上表可以看出：细胞体积与培养液体积，即接种量的比值在1:2~1:9范围内时，胚性愈伤组织的生长量呈线性增长的趋势，当高于这个范围时，生长量反而下降。当范围为1:5~1:9时，效果较好。

实施例7

胚性愈伤组织的增殖阶段：其他条件同实施例5，生长素2,4-D和细胞分裂素6-BA的浓度比分别为全量(2.2mg/L和1.1mg/L)，1/2(1.1mg/L和0.55mg/L)，1/4(0.55mg/L和0.275mg/L)和0；胚性愈伤组织的生长量如下表所示：

从上表可以看出：不加生长素2,4-D和细胞分裂素6-BA，胚性愈伤组织也可以生长，随着加入的量，呈线性增长趋势。当所用量为1/4至全量时，效果较好。

实施例8

胚性愈伤组织的增殖阶段：其他条件同实施例5，蔗糖的浓度为1%，2%（实施例5），3%和4%；胚性愈伤组织的生长量如下表所示：

从上表可以看出：蔗糖的浓度在1~3%的范围内时，胚性愈伤组织的生长量呈线性增长的趋势，当高于这个范围时，生长量反而下降。

实施例9

体细胞胚的成熟阶段：将实施例5得到的胚性愈伤组织进行体细胞胚的成熟培养，采用1/2LM基本培养基，附加的激素和渗透剂组合分别为16mg/L的ABA，7.5%的PEG4000，以及0.4%的植物凝胶（Gelrite,Sigma），此时培养基中的蔗糖浓度提高到6%，水解酪蛋白替代诱导和增殖阶段的酶解酪蛋白，为1g/L，谷氨酰胺的量仍为500mg/L，其中ABA和谷氨酰胺均为过滤灭菌。且培养条件均与诱导阶段相同。平均每100mg愈伤组织在这种分化培养基上可以形成115个成熟的子叶胚。如图3所示。

实施例10

体细胞胚的成熟阶段：将实施例5得到的胚性愈伤组织进行体细胞胚的成熟培养，采用1/2LM基本培养基，附加的激素和渗透剂组合分别为20mg/L的ABA，3%的PEG4000，以及0.6%的植物凝胶（Gelrite，Sigma），此时培养基中的蔗糖浓度提高到6%，水解酪蛋白替代诱导和增殖阶段的酶解酪蛋白，为1g/L，谷氨酰胺的量仍为500mg/L，其中ABA和谷氨酰胺均为过滤灭菌。且培养条件均与诱导阶段相同。平均每100mg愈伤组织在这种分化培养基上可以形成90个成熟的子叶胚。

实施例11

体细胞胚的成熟阶段：将实施例5得到的胚性愈伤组织进行体细胞胚的成熟培养，采用1/2LM基本培养基，附加的激素和渗透剂组合分别为20mg/L的ABA，7.5%的PEG4000，以及1%的活性炭和0.6%的植物凝胶（Gelrite，Sigma），此时培养基中的蔗糖浓度提高到6%，水解酪蛋白替代诱导和增殖阶段的酶解酪蛋白，为1g/L，谷氨酰胺的量仍为500mg/L，其中ABA和谷氨酰胺均为过滤灭菌。且培养条件均与诱导阶段相同。平均每100mg愈伤组织在这种分化培养基上可以形成72个成熟的子叶胚。

实施例12

体细胞胚的成熟阶段：其他条件同实施例9，附加的激素为12，16（同实施例9），20mg/L的ABA，体细胞胚的成熟数量如下表所示：

从上表可以看出：当ABA的浓度为16mg/L时，每100mg的愈伤组织分化出来的体细胞胚最多。

实施例13

体细胞胚的成熟阶段：其他条件同实施例9，渗透剂的为浓度是3%和7.5%（同实施例9）的PEG4000，体细胞胚的成熟数量如下表所示：

  PEG4000（%）  0  3%  7.5%  成熟的子叶胚(个)  80  90  115

从上表可以看出：当在成熟培养基中添加7.5%的PEG4000时，每100mg的愈伤组织分化出来的体细胞胚最多。

实施例14

体细胞胚的成熟阶段：其他条件同实施例9，活性炭的浓度分别为0（同实施例9），0.5%和1%，体细胞胚的成熟数量如下表所示：

从上表可以看出：当在成熟培养基中不添加活性炭时，每100mg的愈伤组织分化出来的体细胞胚最多。

实施例15

体细胞胚的成熟阶段：其他条件同实施例9，植物凝胶（Gelrite,Sigma）的浓度分别为0.3%，0.4%（同实施例9）和0.6%，体细胞胚的成熟数量如下表所示：

从上表可以看出：当在成熟培养基中添加0.4%的植物凝胶时，每100mg的愈伤组织分化出来的体细胞胚最多。

转入成熟培养基以后胚性愈伤组织开始分化，经过两个月的发育会依次经过球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚。在本发明经过改良的培养基上，成功的调整了胚性细胞的生长状况，使得体细胞胚胎发生中最难的关键技术问题——畸形胚和不同步化的发生得到有效控制，且分化率高，平均每100mg愈伤组织可以形成72~115个成熟的子叶胚。值得注意的是胚性愈伤组织不需要在不添加激素的培养基上进行预培养即可正常的分化，可以在节省人力物力的基础上缩短培养周期。

实施例16

体细胞胚的萌发阶段：将实施例9~11得到的体细胞胚进行萌发，使用1/4LM基本培养基，添加谷氨酰胺500mg/L，活性炭0.25%，2%蔗糖、1g/L水解酪蛋白和0.4%的植物凝胶（Gelrite，Sigma）。温度为24±1℃，80μEm^-2s^-1下光照培养16h。由于体细胞胚胎发生具有两极性的特点，所以，成熟的子叶胚可以同时形成子叶和根，成为完整的幼苗，继而很好的解决了针叶树体细胞胚胎发生中生根难的问题。根据本实施例得到植株的萌发率为27.99%。如图4所示。

实施例17

体细胞胚的萌发阶段：将实施例9~11得到的体细胞胚进行萌发，使用1/4LM基本培养基，添加谷氨酰胺250mg/L，2%蔗糖、1g/L水解酪蛋白和0.4%的植物凝胶（Gelrite，Sigma）。温度为24±1℃，80μEm^-2s^-1下光照培养16h。体细胞胚的萌发率为22.52%。

实施例18

体细胞胚的萌发阶段：其他条件同实施例16，添加谷氨酰胺250和500mg/L（同实施例16），体细胞胚的萌发率如下表所示：

  谷氨酰胺(mg/L)  250  500  萌发率（%）  21.51%  27.99%

从上表可以看出：在萌发培养基中添加500mg/L的谷氨酰胺时，萌发率最高。

实施例19

体细胞胚的萌发阶段：其他条件同实施例16，抗坏血酸浓度分别为：0（同实施例16）和17.6mg/L，体细胞胚的萌发率如下表所示：

  抗坏血酸(mg/L)  0  17.6  萌发率（%）  27.99%  16.99%

从上表可以看出：不添加抗坏血酸的萌发培养基的诱导率最高，为27.99%。

实施例20

体细胞胚的萌发阶段：其他条件同实施例16，活性炭浓度分别为：0和0.25%（同实施例16），体细胞胚的萌发率如下表所示：

  活性炭（%）  0  0.25%  萌发率（%）  17.80%  27.99%

从上表可以看出：在萌发培养基中添加0.25%的活性炭可显著提高萌发率至27.99%。

本发明中，针对体细胞胚胎发生的各个阶段都有明确的培养基方案、激素和其他营养物质的组合。丽江云杉体细胞胚胎发生分化率最高能够达到115个/100mg（高于背景技术中现有技术的8个/1g），平均萌发率为23%左右（若采用背景技术方法，可得到的萌发率为15%左右）。

采用本发明提供的技术，为丽江云杉的工厂化无性繁殖育苗提供了一种周期短、繁殖率高、成本低廉的方法。突破了丽江云杉天然结实率低，扦插繁殖困难，种苗繁殖技术无法满足无性系造林需要的限制。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。