用于TSH受体的反向激动剂和中性拮抗剂

摘要

用于治疗格雷夫斯眼眶病、格雷夫斯甲状腺机能亢进症和/或甲状腺癌的TSHR反向激动剂和中性拮抗剂。

说明书

本申请要求2010年4月8日提交的美国临时专利申请No. 61/322,138的权利。

技术领域

本文公开的是用于诊断、分析和治疗目的化合物，其为促甲状腺 激素受体(TSHR)反向激动剂和中性拮抗剂。

背景技术

促甲状腺激素(TSH)是异二聚体糖蛋白激素，其通过调节甲状 腺滤泡细胞的生长、繁殖和机能而调节甲状腺自稳态(homeostasis)。 对TSH的细胞应答通过TSH受体(TSHR)介导，所述TSHR是独 特的7跨膜受体。TSHR是甲状腺功能的主要调节剂且在甲状腺之外 的组织中表达，包括脂肪前体细胞、脂肪细胞、纤维原细胞、免疫细 胞和骨骼。通过内源激素TSH而活化TSHR为正常甲状腺自稳态所需 要，但也可调节所述其他组织/细胞的功能。

TSHR涉及多种疾病的发病机制。在格雷夫斯病(Graves’disease) 中，TSHR-刺激抗体(TSAbs)激活TSHR，模仿TSH的作用。这通 过激活甲状腺细胞上的TSHRs导致甲状腺机能亢进症并通过在眼后 的眼球后空间中的细胞上激活TSHRs导致格雷夫斯眼眶病(或眼病或 甲状腺相关性眼病)。TSH也通过激活癌细胞上的TSHRs刺激甲状 腺癌细胞的生长、增殖和转移。事实上，甲状腺癌手术后大部分病人 接受甲状腺激素治疗从而抑制血液中的TSH水平。TSHR表现出基础 信号活性，即TSH或TSAbs不存在时的信号活性。

发明内容

在一个实施方案中，此处公开了一种化合物，或其可药用的盐或 酯，其具有结构为：

(式I)

其中，R¹选自含呋喃基基团、含吡啶基基团、含噻吩基基团、羟 烷基或烷氧基烷基；

R²是H、烷氧基、烷基、取代烷基或卤素；和

R³-R⁷各自独立地选自H、烷基、取代烷基、卤素或氨基羰基，前 提是R³或R⁷中的至少一个不是H；以及

X是O或S；前提是该化合物不是

同样公开了一种药物组合物，包括至少一种可药用的添加剂和治 疗有效量的至少一种具有下式结构的化合物，或其可药用的盐或酯：

(式I)

其中R¹选自含呋喃基基团、含吡啶基基团、含噻吩基基团、羟烷 基或烷氧基烷基；

R²是H、烷氧基、烷基、取代烷基或卤素；和

R³-R⁷各自独立地选自H、烷基、取代烷基、卤素或氨基羰基，前 提是R³或R⁷中的至少一个不是H；以及

X是O或S。

根据此处公开的另一实施方案，提供一种制备药物组合物的方法， 包括结合至少一种可药用的添加剂和治疗有效量的至少一种具有下式 结构的化合物，或其可药用的盐或酯：

(式I)

其中R¹选自含呋喃基基团、含吡啶基基团、含噻吩基基团、羟烷 基或烷氧基烷基；

R²是H、烷氧基、烷基、取代烷基或卤素；和

R³-R⁷各自独立地选自H、烷基、取代烷基、卤素或氨基羰基，前 提是R³或R⁷中至少的一个不是H；以及

X是O或S。

此处同样公开一种治疗受试者格雷夫斯病的方法，包括向受试者 给药TSHR反向激动剂或TSHR中性拮抗剂。

此处公开的另一实施方案是一种治疗受试者甲状腺癌的方法，包 括向受试者给药TSHR反向激动剂或TSHR中性拮抗剂。

在此处公开的另一个实施方案中，提供一种治疗受试者格雷夫斯 病的方法，包括向受试者给药治疗有效量的至少一种具有下式结构的 化合物，或其可药用的盐或酯：

(式I)

其中R¹选自含呋喃基基团、含吡啶基基团、含噻吩基基团、羟烷 基或烷氧基烷基；

R²是H、烷氧基、烷基、取代烷基或卤素；和

R³-R⁷各自独立地选自H、烷基、取代烷基、卤素或氨基羰基；以 及

X是O或S。

在此处公开的另一个实施方案中，提供一种抑制受试者中由甲状 腺-刺激抗体(TSAbs)刺激的信号的方法，包括向受试者给药治疗有 效量的具有下式结构的至少一种化合物，或其可药用的盐或酯：

(式I)

其中R¹选自含呋喃基基团、含吡啶基基团、含噻吩基基团、羟烷 基或烷氧基烷基；

R²是H、烷基、取代烷基或卤素；和

R³-R⁷各自独立地选自H、烷基、取代烷基、卤素或氨基羰基；以 及

X是O或S。

根据此处公开的另一个实施方案，提供一种治疗受试者甲状腺机 能亢进症的方法，包括向受试者给药治疗有效量的至少一种具有下式 结构的化合物，或其可药用的盐或酯：

(式I)

其中R¹选自含呋喃基基团、含吡啶基基团、含噻吩基基团、羟烷 基或烷氧基烷基；

R²是H、烷氧基、烷基、取代烷基或卤素；和

R³-R⁷各自独立地选自H、烷基、取代烷基、卤素或氨基羰基；以 及

X是O或S。

此处同样公开的是一种治疗受试者甲状腺癌的方法，包括向受试 者给药治疗有效量的至少一种具有下式结构的化合物，或其可药用的 盐或酯：

(式I)

其中R¹选自含呋喃基基团、含吡啶基基团、含噻吩基基团、羟烷 基或烷氧基烷基；

R²是H、烷氧基、烷基、取代烷基或卤素；和

R³-R⁷各自独立地选自H、烷基、取代烷基、卤素或氨基羰基，前 提是R³或R⁷中至少的一个不是H；以及

X是O或S。

在另一个实施方案中，公开了一种治疗受试者甲状腺癌的方法， 包括向受试者给药治疗有效量的至少一种具有下式结构的化合物，或 其可药用的盐或酯：

(式II)

其中R¹选自

或并且

R²-R⁶各自独立地选自H、烷基、取代烷基或卤素。

在另一个实施方案中，公开了一种治疗受试者甲状腺机能亢进症 的方法，包括向受试者给药治疗有效量的至少一种具有下式结构的化 合物，或其可药用的盐或酯：

(式II)

其中R¹选自

或并且

R²-R⁶各自独立地选自H、烷基、取代烷基或卤素。

同样公开的是一种药物组合物，包括至少一种可药用的添加剂和 治疗有效量的至少一种具有下式结构的化合物，或其可药用的盐或酯：

(式II)

其中R¹选自

或并且

R²-R⁶各自独立地选自H、烷基、取代烷基或卤素。

通过下文的详细描述并参考附图，将更加清晰地了解上述内容。

附图说明

图1A和1B。化合物1的结构和对TSHR的非激动剂依赖信号的 作用。

图1A)1(2-(3-((2，6-二甲基苯氧基)甲基)-4-甲氧基苯基)-3-(呋喃-2- 基甲基)-2，3-二氢喹唑啉-4(1H)-酮)[NCGC00161856]的化学结构。

图1B)如下文方法部分所记载，将稳定表达TSHRs的细胞暴露 于指定浓度的化合物1，在HBSS中40分钟，并随后在HBSS+1mM  IBMX(基础信号)中60分钟。60分钟后，细胞溶解并且通过ELISA 测定cAMP水平。用相同样品进行两次独立试验，数据以对照组的％ 显示。

图2A和2B。化合物1是TSH-刺激信号的竞争性拮抗剂。

图2A)将稳定表达TSHRs的细胞暴露于指定浓度的化合物1中 20分钟，随后加入最大有效浓度一半的TSH(2nM)和1mM IBMX。

图2B)将稳定表达TSHRs的细胞在不存在1或存在3、10或30μM 的1的条件下培养，加入1的20分钟后加入不同浓度TSH和1mM  IBMX。

60分钟后，细胞溶解并且通过ELISA测定cAMP水平。用相同 样品进行两次独立试验，数据以对照组的％显示。这些数据的Schild 图是线性的，斜率不异于1.0(未显示)。

图3.化合物1抑制组成性活性突变TSHRs(CAMs)的基础活性。 将暂时表达突变TSHRs-S281N、M453T、I568T或F631T的细胞用 指定浓度的1加上1mM IBMX培养xx分钟。60分钟后通过ELISA 测定cAMP水平。CAMs的对照组活性为：S281N-15±3.3-倍；M453T -27±7.3-倍；I568T-24±0.71-倍；以及F631I-20±4.5-倍于对照。 用相同样品进行两次独立试验，数据以对照组的％显示。

图4A和4B。化合物1在原代培养的人甲状腺细胞中抑制基础 cAMP生产和抑制mRNAs基础表达：针对TPO(甲状腺过氧化物酶)、 TSHR、TG(甲状腺蛋白)、DIO2(2型脱碘酶)、和NIS(钠-碘同 向转运体)。

图4A)将甲状腺细胞于37℃下在不含或含有1mM IBMX且不 含或含有1的HBSS/HEPES中培养2小时。随后，抽出缓冲液，细胞 溶解并测定细胞内cAMP。

图4B)按照方法中的记载，将甲状腺细胞在含有2％胎牛血清和 1mM IBMX并不含或含有30μM 1的介质中培养。48小时后，细胞 溶解，测定mRNAs水平并标准化为GAPDH mRNA。mRNA水平以 相比于对照组的促进倍数表示。显示用相同样品进行三次独立试验的 数据。

图5是测试TSHR反向激动剂活性和拮抗剂活性的化合物列表。

图6是示出一些化合物的TSHR拮抗剂活性的图。图6中的化合 物S2是与下文记载的化合物1相同的化合物。

图7-9是量效曲线，指出化合物S2-6是一种反向激动剂。

图10是示出化合物S2-2的TSHR激动剂活性及其弱拮抗剂活性 的图。激动剂活性：将稳定表达TSHRs的HEK-EM 293细胞在HBSS +1mM IBMX中暴露于30μM S2-2 60分钟。仅用IBMX培养的未处 理的细胞用作对照(基础活性)。60分钟后，细胞溶解且通过ELISA 测定cAMP水平。拮抗剂活性：将HEKTSHR细胞于HBSS中暴露于 30μM S2-2 20分钟，并随后在含1mM IBMX、S2-2和1mU/ml TSH (EC50剂量)的HBSS中培养。40分钟后，停止培养并通过ELISA 测定总cAMP水平。

图11描绘了证明小分子配体S2、S2-6、S2-7、S2-8、S2-17和S2-29 是中性拮抗剂的量效曲线。将HEKTSHR细胞在HBSS中暴露于指定 浓度的小分子配体中20分钟，并随后在含有1mM IBMX、小分子配 体和1mU/ml hTSH(EC50剂量)的HBSS中培养。40分钟后，停止 培养并通过ELISA测定总cAMP水平。数据源自相同样品的2次实验， 且表示为平均±SE。

图12描绘了证明S2、S2-6和S2-7是反向激动剂的量效曲线。除 S2-8外，所有配体具有反向激动剂性能。S2-8是一种中性拮抗剂。稳 定表达TSHRs的HEK-EM 293细胞在HBSS+1mM IBMX中暴露于 指定浓度的小分子配体60分钟。仅用IBMX培养的未处理细胞用作对 照(基础活性)。60分钟后，细胞溶解并通过ELISA测定cAMP水 平。用相同样品进行两次独立试验，数据以基础活性的％显示。

图13A和13B。化合物S2-6是GD血清刺激cAMP产生的拮抗剂。

图13A。将HEKTSHR细胞不用(对照)或用30μM化合物S2-6 (图13A和13B中指定为化合物1)培养20分钟，并随后加入1mM  IBMX和三种GD血清中每一种的1∶30或1∶100稀释液。在额外的40 分钟后，停止培养并通过ELISA测定总cAMP水平。数据源自三份样 品的一次试验且代表3次试验。化合物S2-6通过配对t-检验效果显著 (P＜0.01)。

图13B。将HEKTSHR细胞不用(对照)或用30μM化合物S2-6 培养20分钟，并随后加入1mM IBMX和1∶30稀释的30份GD血清。 额外40分钟后，停止培养并通过ELISA测定总cAMP水平。数据表 示为抑制％＝100-(100x暴露于化合物S2-6的样品/对照)。该数据代 表重复进行两次的试验。

图14A和14B。通过化合物S2-6(图14A中指定为化合物1)在 原代培养的人甲状腺细胞中抑制基础的和TSAb-诱导上调的TPO  mRNA的表达。将甲状腺细胞在含有2％胎牛血清且未含(对照)或 含有30μM化合物S2-6，未含(基础)或含有1∶10稀释GD血清的 DMEM中在37℃下培养。48小时后，抽出缓冲液，细胞溶解并测定 TPO mRNA水平，且标准化为GAPDH mRNA。mRNA水平以相比于 基础水平(对照)的倍数表示。显示相同样品进行2次独立试验的数 据。

图15是显示多个化合物活性的表格。

具体实施方式

术语

以下对术语和方法的解释旨在更好地描述本发明化合物、组合物 和方法，以及引导本领域一般技术人员实践本发明。也应该理解本公 开文本中使用的术语仅用于描述具体实施方案和实例，不用于限制。

如此处使用的，单数“一个”和“这个”包括复数指称，除非上 下文明确相反指出。同样地，词语“或”旨在包括“和”，除非上下 文明确相反指出。同样，如此处使用的，术语“包括”意味着“包含”。 因此“包括A或B”意味着包括A、B或A和B。

“化合物的给药”和“给药一种化合物”应理解为意味着提供一 种此处记载的化合物、化合物的前体药物、或药物组合物。该化合物 或组合物可由其他人对受试者给药(例如静脉给药)或可由受试者自 行给药(例如药片)。

“任选”或“任选地”意味着随后记载的事件或情况可以发生但 不必须发生，且所述记载包括其中所述事件或情况发生的状况和不发 生的状况。

“衍生物”指的是衍生自或可理论上衍生自母体化合物的化合物 或化合物的部分。

术语“受试者”包括人类和动物受试者。

“治疗”指的是在疾病或病理状态开始发展后改善病征或症状的 治疗性干预。如此处使用的，关于疾病或病理状态的术语“改善”， 指的是对于治疗的任何可观察到的有益效果。有益效果可通过以下方 面显现，例如，易感受试者疾病的临床症状延迟发作、疾病的一些或 所有临床症状严重程度降低、疾病的发展变慢、受试者的整体健康或 舒适感增加、或通过其他本领域已知的针对特定疾病的参数显现。短 语“治疗疾病”指的是抑制疾病或状态的全部发展，例如，在有风险 患上激素受体介导疾病的受试者中，特别是有风险患上甲状腺疾病如 甲状腺功能亢进症或甲状腺功能衰退症的受试者中。“预防”治疗是 为了降低病理发展的风险而对未表现出疾病病征或仅表现出早期病征 的病人进行治疗。术语“共给药”意味着至少两种化合物中的每一种 在其各自生物活性周期重叠的时间范围内给药。因此，该术语包括两 种以上药物化合物的连续给药以及同延给药(coextensive  administration)。

术语“可药用的盐或酯”指的是通过常规方法制备的盐或酯，包 括无机和有机酸的碱式盐，所述酸包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、 磷酸、甲磺酸、乙磺酸、羟基丁二酸、乙酸、草酸、酒石酸、柠檬酸、 乳酸、富马酸、琥珀酸、马来酸、水杨酸、苯甲酸、苯乙酸、扁桃酸 等。本文公开的化合物的“可药用的盐“也包括那些由阳离子如钠、 钾、铝、钙、锂、镁、锌形成的，以及由碱如氨、乙二胺、N-甲基- 谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、胆碱、N，N′-二苄基乙二胺、氯 普鲁卡因、二乙醇胺、普鲁卡因、N-苄基苯乙胺、二乙胺、哌嗪、三(羟 甲基)氨基甲烷、以及四甲基氢氧化铵形成。这些盐可通过标准程序制 备，例如，通过将游离酸与合适的有机或无机碱反应。本说明书中列 举的任何化学化合物可替代地以其可药用的盐给药。“可药用的盐” 也包含游离酸、碱和两性形式。合适的可药用的盐的记载可参见 Handbook of Pharmaceutical Salts，Properties，Selection and Use，Wiley  VCH(2002)。当此处公开的化合物包括酸官能团如羧基，对于羧基合 适的可药用的阳离子对是本领域技术人员已知的，包括碱金属、碱土 金属、铵、季铵阳离子等。这类盐为本领域技术人员已知。“可药用 的盐”的更多实例参见Berge et al.，J.Pharm.Sci.66：1(1977)。“可药 用的酯”包括那些衍生自此处记载的改性而包括羟基或羧基的化合物 的酯。体内可水解酯是一种在人体或动物体内水解产生母酸或醇的酯。 对羧基而言合适的可药用的酯包括C_1-6烷氧基甲酯例如甲氧基甲酯、 C_1-6烷酰氧基甲酯例如特戊酰氧基甲酯、2-苯并[C]呋喃酮酯、C_3-8环 烷氧基羰基氧基C_1-6烷酯例如1-环己基羰基-氧基乙酯、1，3-二氧杂环 戊烯-2-酮基甲酯例如5-甲基-1，3-二氧杂环戊烯-2-酮基甲酯、以及C_1-6烷氧基羰基氧基乙酯例如1-甲氧基羰基-氧基乙酯，可以在化合物中任 意羰基上形成。

含有羟基的可体内水解酯包括无机酯如磷酸酯和α-乙酰氧基烷基 醚以及由于酯在体内水解断裂得到母羟基的相关化合物。α-乙酰氧基 烷醚的实例包括乙酰氧基-甲氧基醚和2，2-二甲基丙酰氧基-甲氧基醚。 对于体内可水解酯的羟基形成基团的选择包括烷酰基、苯甲酰基、苯 乙酰基和取代苯甲酰基和苯乙酰基、烷氧基羰基(得到烷基碳酸酯)、 二烷基氨基甲酰基和N-(二烷基氨基乙基)-N-烷基氨基甲酰基(得到氨 基甲酸酯)、二烷基氨基乙酰基和羧基乙酰基。苯甲酰基上的取代基 的实例包括吗啉基和哌嗪基，从一个环氮原子通过亚甲基连接至苯甲 酰基环的3-或4-位。

为了治疗用途，化合物的盐中抗衡离子是可药用的。然而，不可 药用的酸和碱的盐也可用于，例如，可药用的化合物的制备和纯化。

上文提到的可药用的酸和碱加成盐旨在包括所述化合物能够形成 的有治疗活性的无毒酸和碱加成盐形式。可药用的酸加成盐可便利地 通过使用所述适当酸处理碱形式得到。适当的酸包括，例如，无机酸 如氢卤酸，如，盐酸或氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等酸；或有机酸如， 乙酸、丙酸、羟基乙酸、乳酸、丙酮酸、草酸(即乙二酸)、丙二酸、 琥珀酸(即丁二酸)、马来酸、富马酸、苹果酸(即羟基丁二酸)、 酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、环拉酸(cyclamic  acid)、水杨酸、对氨基水杨酸、双羟萘酸(pamoic acid)等酸。反过来 所述盐形式可通过使用适当碱处理转化为游离碱形式。

含有酸质子的化合物也可通过用适当有机碱和无机碱处理而转化 为其无毒金属加成盐或胺加成盐形式。适当的碱盐形式包括，例如， 铵盐、碱金属和碱土金属盐，例如，锂、钠、钾、镁、钙盐等，有机 碱的盐，例如苯乍生(benzathine)、N-甲基-D-葡糖胺、哈胺盐 (hydrabamine salt)，以及氨基酸的盐，如精氨酸、赖氨酸等的盐。

上文中使用的术语“加成盐”也包括此处记载的化合物能够形成 的溶剂化物。所述溶剂化物是例如水合物、醇化物等。

上文中使用的术语“季胺”定义所述化合物能够通过化合物的碱 性氮与适当的季胺化试剂——例如任选取代的烷基卤、芳基卤、或芳 烷基卤，例如碘甲烷或苄基碘——之间的反应形成的季铵盐。也可以 使用其他具有良好离去基团的反应物，如，三氟甲磺酸烷基酯、甲磺 酸烷基酯、和对甲苯磺酸烷基酯。季胺含有一个带正电荷的氮。可药 用的抗衡离子包括氯、溴、碘、三氟乙酸根和乙酸根。选择的抗衡离 子可使用离子交换树脂引入。

应了解此处记载的化合物可具有形成金属结合、螯合、配合的性 能，且因此可作为金属配合物或金属螯合物存在。

“饱和或未饱和”包括氢饱和取代基、氢完全不饱和取代基以及 氢部分饱和取代基。

术语“酰基”指的是式RC(O)-的基团，其中R是一个有机基团。

术语“烷基”指的是含有1至24个碳原子的支化或未支化饱和烃 基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊 基、己基、庚基、辛基、癸基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二 十四烷基等。“低级烷基”是含有1至10个碳原子的饱和支化或未支 化烃基。优选的烷基含有1至4个碳原子。烷基可以是“取代烷基”， 其中一个或多个氢原子被取代基如卤素、环烷基、烷氧基、氨基、羟 基、芳基或羧基取代。

术语“烯基”指的是含有2至24个碳原子且结构式中含有至少一 个碳-碳双键的烃基。

术语“炔基”指的是含有2至24个碳原子且结构式中含有至少一 个碳-碳三键的烃基。

术语“卤化烷基”或“卤代烷基”指的是上述定义的烷基中存在 的1个或多个氢原子被卤素(F、Cl、Br、I)替代的基团。

术语“环烷基”指的是由至少三个碳原子组成的非芳香族碳基环。 环烷基实例包括，但不限于，环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。 术语“杂环烷基”是一个上文定义的环烷基中至少一个环碳原子被杂 原子如，但不限于氮、氧、硫或磷替代。

术语“脂肪族”定义为包括上文定义的烷基、烯基、炔基、卤化 烷基和环烷基、“低级脂肪族”基团是含有1至10个碳原子的支化或 未支化脂肪基。

术语“烷氧基”指的是直链、支化或环状烃结构及其结合物，包 括1至20个碳原子，优选1至8个碳原子，更优选1至4个碳原子， 其在连接点包括一个氧原子。“烷氧基”的一个实例由式-OR表示， 其中R可以是烷基，任选由上文记载的烯基、炔基、芳基、芳烷基、 环烷基、卤代烷基、或杂环烷基取代。合适的烷氧基包括甲氧基、乙 氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁 氧基、环丙氧基(cclopropoxy)、环己氧基等。

“烷氧基羰基”指的是被烷氧基取代的羰基，-C(O)OR，其中R 代表任选取代的烷基、芳基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基或类似的 部分。

术语“烷基氨基”指的是其中至少一个氢原子被氨基替代的上文 定义的烷基。

“氨基羰基”单独或以结合形式，指的是被氨基取代的羰基(氨 基甲酰基)，其中氨基可任选地为单取代或双取代的，例如，被烷基、 芳基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、烷酰基、烷氧基羰基、芳烷氧 基羰基等取代。一种氨基羰基可以是-N(R)-C(O)-R(其中R是取代基 或H)或-C(O)-N(R)。“氨基羰基”包括酰氨基。一种合适的氨基羰 基是乙酰氨基。

术语“芳基”指的是任何碳基芳香基团，包括但不限于苯、萘等。 术语“芳香族”也包括“杂芳基”，其定义为含有至少一个结合进入 芳香环的杂原子的芳香基。所述杂原子的实例包括但不限于氮、氧、 硫和磷。芳基可被1个或多个基团取代，所述取代基团包括，但不限 于烷基、炔基、烯基、芳基、卤素、硝基、氨基、酯基、酮基、醛基、 羟基、羧酸、或烷氧基，或芳基可为未取代的。

“羰基”指的是式-C(O)-的基团。含羰基基团包括任何含有碳氧 双键(C＝O)的取代基，包括酰基、酰胺、羧基、酯、脲、氨基甲酸 酯、碳酸酯和酮以及醛，如基于-COR或-RCHO的取代基，其中R是 脂肪族、杂脂肪族、烷基、杂烷基、羟基、或仲胺、叔胺或季胺。

“羧基”指的是-COOH基团。取代羧基指的是-COOR，其中R 是脂肪族、杂脂肪族、烷基、杂烷基、或羧酸或酯。

术语“羟基”由式-OH代表。

术语“羟烷基”指的是至少一个氢原子被羟基替代的烷基。术语 “烷氧基烷基”定义为至少一个氢原子被上文记载的烷氧基替代的烷 基。

术语“胺”或“氨基”指的是式-NRR′的基团，其中R和R′可以 彼此独立地为氢或上文记载的烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、环 烷基、卤代烷基、或杂环烷基。

术语“酰胺”或“酰氨基”由式-C(O)NRR′代表，其中R和R′ 可以彼此独立地为氢、上文记载的烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、 环烷基、卤代烷基、或杂环烷基。一种合适的酰氨基是乙酰氨基。

术语“芳烷基”指的是含有上文定义的烷基与上文定义的芳基相 连的芳基。芳烷基的一个实例是苯甲基。

任选取代的基团，如“任选取代的烷基”，指的是例如烷基的基 团，如果被取代，含有1-5个取代基，通常为1、2或3个取代基，所 述取代基选自烷氧基、任选取代的烷氧基、酰基、酰基氨基、酰氧基、 氨基、氨酰基、氨基酰氧基、芳基、羧烷基，任选取代的环烷基、任 选取代的环烯基、卤素、任选取代的杂芳基、任选取代的杂环基、羟 基、磺酰基、硫醇和硫代烷氧基。特别地，任选取代的烷基包括，例 如，卤代烷基，如氟代烷基，包括但不限于三氟甲基。

“治疗有效量”或“诊断有效量”指的是给定药剂在用该药剂处 理的受试者中足以实现所需效果的用量。例如，可以是此处公开的化 合物用于检测或治疗受试者甲状腺癌的用量。理想地，药剂的治疗有 效量或诊断有效量是足以抑制或治疗受试者疾病而不引起明显细胞毒 作用的用量。药剂的治疗有效量或诊断有效量取决于被治疗的受试者、 痛苦的严重性、以及治疗组合物的给药方式。

此处也涉及公开的化合物的前体药物。前体药物是活性或非活性 化合物，在将前体药物给药受试者后通过体内生理作用，如水解、新 陈代谢等化学改性为活性化合物。制备和使用前体药物的适宜性和技 术为本领域技术人员熟知。对于包括酯在内的前体药物的概要讨论参 见Svensson and Tunek Drug Metabolism Reviews 165(1988)和 Bundgaard Design of Prodrugs，Elsevier(1985)。

可药用的前体药物指的是可在受试者体内新陈代谢，例如水解或 氧化而形成本发明的抗病毒化合物的化合物。前体药物的一般实例包 括含有一个或多个生物易变保护基团——其位于活性化合物官能团上 或相反阻断活性化合物官能团——的化合物。前体药物包括可以氧化、 还原、氨化、脱氨化、羟基化、脱羟基化、水解、脱水、烷基化、脱 烷基化、酰化、脱酰化、磷酸化、脱磷酸化产生活性化合物的化合物。 通常此处公开的前体药物具有激素受体调节活性和/或可新陈代谢或 在体内加工形成表现所述活性的化合物。

术语“前体药物”也旨在包括任何共价结合载体，当将前体药物 给药受试者时该载体在体内释放本发明的活性母药。由于前体药物相 对于活性剂药物通常具有增强的性能，如溶解性和生物利用度，此处 公开的化合物可以以前体药物形式给药。因此，同样涉及本文公开的 化合物的前体药物、递送前体药物的方法以及含有该前体药物的组合 物。本文公开的化合物的前体药物的制备方法一般是将化合物中存在 的一个或多个官能团改性，改性以常规操作或在体内裂解，产生母化 合物。前体药物包括含有膦酸酯基和/或氨基——其被任意在体内裂解 而分别产生相应氨基和/或膦酸酯基的基团官能化——的化合物。前体 药物的实例包括，但不限于，含有酰化氨基和/或膦酸酯基或膦酸酯酰 胺基团的化合物。在具体的实施方案中，一种前体药物是低级烷基膦 酸酯，如异丙基膦酸酯。

也涉及所公开的化合物的被保护衍生物。用于本公开化合物的多 种合适的保护基团公开于Greene and Wuts Protective Groups in  Organic Synthesis；第三版；John Wiley&Sons，New York，1999。

通常，保护基团在不影响分子剩余部分的条件下移除。这些方法 为本领域所熟知，且包括酸性水解、氢解等。一个优选方法包括酯的 移除，如使用路易斯酸条件裂解膦酸酯，如TMS-Br介导酯裂解产生 游离膦酸酯。第二种优选方法包括在适当溶剂体系——如乙醇、乙酸 等或其混合物——中使用碳负载钯而氢解移除诸如苯甲基等保护基。 基于叔丁氧基的基团，包括叔丁氧基羰基保护基团，可使用无机或有 机酸，如HCl或三氟乙酸在合适溶剂体系中移除，所述溶剂如水、二 氧杂环己烷和/或二氯甲烷。另一种适用于保护氨基和羟基官能氨基的 示例性的保护基团是三苯甲基。其他常规保护基团是已知的，且本领 域技术人员可参考Greene and Wuts Protective Groups in Organic  Synthesis；第三版；John Wiley&Sons，New York，1999选择适当的保 护基团。当胺脱保护，得到的盐可轻易中和产生游离胺。同样地，当 酸性部分，如膦酸部分被显露，化合物可以作为酸性化合物或其盐分 出。

本公开化合物的特别实例包括一个或多个不对称中心，因此这些 化合物可以不同的立体异构体形式存在。因此，化合物和组合物可以 提供为单一纯对映异构体，或提供为立体异构体混合物，包括外消旋 体混合物。在某些实施方案中此处公开的化合物以基本上对映纯的形 式合成，或纯化为基本上对映纯的形式，如以90％对映异构体过量、 95％对映异构体过量、97％对映异构体过量或甚至高于99％对映异构 体过量，例如对映纯的形式。

应理解此处记载的化合物的取代基和取代形式可以由本领域一般 技术人员选择，以提供化学稳定且可通过本领域已知技术和本发明中 阐述的方法简单合成的化合物。对于优选化合物现将详细提及。

综述

此处公开的是TSHR中性拮抗剂化合物以及反向激动剂化合物， 所述TSHR中性拮抗剂，也就是说，它们抑制由TSH或TSAbs刺激 的信号，所述反向激动剂化合物抑制由TSH和TSAbs刺激的信号， 以及抑制基础信号。

如上文提到的，通过内源激素TSH激活TSHR为常规甲状腺自稳 态所需要，但也可调节甲状腺的功能，包括脂肪细胞(脂肪)前体细 胞、脂肪细胞、纤维原细胞、免疫细胞和骨骼。TSHR也表现出不依 赖于TSH刺激的活性；这被称为非激动剂依赖的基础的或组成性活 性。非激动剂依赖信号活性在一些甲状腺疾病状况中被认为是重要的 (参见下文)。

甲状腺细胞中的TSHR，以及可能在眼后支撑组织(眼球后空间) 中的纤维原细胞和脂肪细胞中的TSHR，也由TSHR-刺激抗体 (TSAbs)刺激，导致格雷夫斯病。格雷夫斯病，其为一种自体免疫 性疾病并在1％的美国人口中出现，具有两个重要的临床组成-1)源 自甲状腺细胞上TSHR刺激的甲状腺机能亢进症和2)格雷夫斯眼眶 病(或格雷夫斯眼病或甲状腺眼病)，其看起来源自在眼球后纤维原 细胞和/或脂肪细胞上的TSHR刺激。

格雷夫斯甲状腺机能亢进症是代谢亢进状态，其几乎影响身体里 的每个组织/细胞，并可特别地导致心血管功能障碍和死亡。格雷夫斯 甲状腺机能亢进症可通过手术切除、治疗剂量的放射性碘、或药理学 (甲巯咪唑(methimazole)或者丙基硫脲嘧啶(propylthiouracil))治疗。 然而，这些治疗方法中的每一个都伴随有副作用(Cooper DS，2005N  Engl J Med，352，905-917)。

由计算机断层扫描诊断，格雷夫斯眼眶病在80％的格雷夫斯甲状 腺机能亢进症患者中出现。症状从轻微至中度至重度至威胁视力。眼 球的突出(眼球突出)和导致重影(复视)的不同程度的眼外肌肉无 力或肌肉瘫痪可以是毁容性且失能性的。使用糖皮质激素的治疗可带 来一定改善，但是对将甲状腺功能亢进状态调节至正常没有效果。眼 角膜磨损或视神经压力会威胁视力，需要使用静脉注射糖皮质激素和 眼眶放射治疗进行急诊治疗，且在一些情况下需要对眼眶手术减压 (Bahn RS 2010，N Engl J Med 362，726-738)。对于格雷夫斯眼眶病 没有不引起不良副作用的简单治疗。

通过手术、放射性碘或阻断甲状腺激素合成的药物(甲巯咪唑和 丙基硫脲嘧啶)治疗格雷夫斯甲状腺机能亢进症降低或消除了甲状腺 功能亢进状态，但无法解决引起格雷夫斯甲状腺机能亢进症或格雷夫 斯眼眶病的根本原因，即存在激活了刺激甲状腺或眼球后细胞的抗体 的TSHR，并因此不能治疗格雷夫斯眼眶病。TSHR反向激动剂和中 性拮抗剂可以有效地治疗格雷夫斯甲状腺机能亢进症和格雷夫斯眼眶 病，因为它们阻断在甲状腺和眼球后细胞中的TSHR-刺激自体抗体对 TSHR的刺激。

可由TSHR反向激动剂和中性拮抗剂治疗的第二种疾病是甲状腺 癌。TSHR在甲状腺癌细胞中表达并调控甲状腺癌细胞的生长、繁殖 和新陈代谢潜能。众所周知，甲状腺是体内控制代谢的一个场所。甲 状腺癌并不特别常见，但高疾病复发率使长期监测是必要的。通常， 在甲状腺癌治疗过程中，大部分甲状腺肿瘤被移除，但通常残余少量 的必须通过放射性碘治疗处理的肿瘤。实际上，甲状腺癌特征在于—— 甚至在成功治疗后——在最高达30％病人中存在复发的高可能性。因 此，必须进行后续筛查。

通常建议在初步甲状腺癌治疗(手术或或放射碘消融)后进行垂 体TSH的甲状腺激素抑制以降低血清TSH水平并从而抑制癌细胞生 长、繁殖和转移的TSH刺激。然而，由于增加心律不齐和其他心血管 不良影响的风险，在有心血管问题的病人中给药甲状腺激素是禁忌的。 反向激动剂和中性拮抗剂能在垂体TSH无法抑制的病人中通过抑制 TSHR活性而抑制肿瘤生长。在有些情况下，尽管通过给药甲状腺激 素抑制TSH，甲状腺癌仍然复发。这可能是由于组成性活性TSHR的 非激动剂-依赖性促进生长和促进增殖的活性。反向激动剂(其抑制组 成性TSHR活性)可以为有效的治疗。

在罕见情况下，TSHR含有遗传突变，使其比常规TSHR更活泼， 导致遗传性非免疫甲状腺功能亢进症。TSHR反向激动剂也可有效治 疗这类病人。

此处使用的“反向激动剂”指的是抑制基础的或非TSH依赖性的 或组成性的TSHR活性的药剂。反向激动剂也可以是一种抑制TSH活 化的拮抗剂。特别地，此处使用的“反向激动剂”指的是抑制非TSH- 和甲状腺-刺激抗体-依赖性(基础或组成性)TSHR活性以及抑制TSH- 和甲状腺-刺激抗体-依赖性活化的药剂。相比之下，“中性拮抗剂” 阻断激动剂(用于TSHR的TSH-或甲状腺-刺激抗体)活性，但不抑 制基础/组成性TSHR活性。因此，反向激动剂和中性拮抗剂都拮抗 TSH和甲状腺-刺激抗体对TSHR的活化。用于TSHR的小分子配体 (激动剂、反向激动剂、中性拮抗剂)结合至受体的膜内区域，并通 过诱导构象变化而起作用，而不是通过简单地竞争TSH结合于在受体 上的其细胞外区域而起作用。

小分子(例如，小于1000道尔顿)反向激动剂和中性拮抗剂是引 人注意的药剂，因为它们相比于TSH，其类似物或抗TSHR抗体更易 于用作探针和药物，能够以适当成本大量化学合成，并由于它们在胃 肠道中不分解且可由胃肠道吸收而可口服给药。此处公开了这样的反 向激动剂，其抑制野生型TSHR和多个组成性活性突变受体(CAMs) 基础信号，可用作TSHR生物学探针、治疗甲状腺癌受试者(尤其是 非TSH-依赖性甲状腺癌)、治疗甲状腺机能亢进症受试者(尤其是格 雷夫斯甲状腺机能亢进症)，或治疗格雷夫斯眼眶病受试者。同样公 开的是这样的中性拮抗剂，其可用于TSHR生物学探针或治疗格雷夫 斯眼眶病和/或格雷夫斯甲状腺机能亢进症受试者。在某些实施方案 中，反向激动剂和中性拮抗剂可以是用于TSHR的选择性反向激动剂 或中性拮抗剂(即，该化合物不活化或调节其他激素受体，特别是促 黄体激素/绒毛膜促性腺激素受体(LHCGR)和促卵泡激素受体 (FSHR))。

在某些实施方案中，此处公开的反向激动剂可用于抑制甲状腺癌 受试者体内癌细胞生长/繁殖/转移，尽管通过给药甲状腺激素抑制他们 的TSH。尽管通过给药甲状腺激素治疗甲状腺癌的受试者体内TSH 可被抑制，但TSHRs仍表现出继续刺激甲状腺癌细胞的基础信号活 性。此处公开的反向激动剂可以抑制TSHR基础信号活性。因此，在 另一个实施方案中，公开了一种治疗甲状腺癌的方法，尤其是在尽管 抑制其内源性垂体TSH而癌症仍复发的受试者中，或是在给药甲状腺 激素禁忌的受试者中，包括向受试者给药至少一种反向激动剂。

在某些实施方案中，此处公开的反向激动剂和中性拮抗剂可用于 治疗受试者甲状腺机能亢进症。例如，反向激动剂和中性拮抗剂可抑 制比常规基础信号具有更高活性(CAMs)的突变TSHRs，所述突变 TSHR导致甲状腺机能亢进症的不寻常形式。在另一个实例中，反向 激动剂和中性拮抗剂可抑制通过在格雷夫斯病——其为最常见形式的 甲状腺机能亢进症——中发现的抗体的刺激。

在某些实施方案中，反向激动剂也是TSHR拮抗剂并因此也通过 阻断格雷夫斯甲状腺机能亢进症中的TSHR-刺激抗体(TSAbs)而用 于治疗TSHR介导甲状腺癌或甲状腺机能亢进症。

特别地，此处公开的式I或II的反向激动剂和中性拮抗剂可通过 阻断格雷夫斯甲状腺机能亢进症和/或格雷夫斯眼眶病中的TSAbs而 用于抑制甲状腺或眼眶组织的刺激。

反向激动剂和/或中性拮抗剂

在一个实施方案中，反向激动剂或中性拮抗剂是2，3-二氢喹唑啉 -4-酮化合物，特别地为2-取代、3-取代2，3-二氢喹唑啉-4-酮化合物。 在2位的取代基可以是，例如，含呋喃基基团、含吡啶基基团、含噻 吩基基团、羟烷基或烷氧基烷基。在3位的取代基可以是，例如， -Ar¹-CH₂-X-Ar²，其中Ar¹是取代或未取代的亚芳基(例如-C₆H₄-)； Ar²是取代或未取代的芳基；且X是O或S。在某些实施方案中，Ar²是2，6-二烷基苯基，特别地为2，6-二甲基。在某些实施方案中，Ar¹是 甲氧基-取代亚苯基。

通常，示例的反向激动剂或中性拮抗剂具有以下结构：

(式I)

其中，R¹选自含呋喃基基团、含吡啶基基团、含噻吩基基团、羟 烷基或烷氧基烷基；

R²是H、烷氧基、烷基、取代烷基或卤素；和

R³-R⁷各自独立地选自H、烷基、取代烷基、卤素或氨基羰基；以 及

X是O或S。

在式I的某些实施方案中，R¹选自：

(a)含呋喃基基团，其中所述含呋喃基基团是具有结构-R¹⁰-呋喃 基的呋喃基烷基，其中R¹⁰是一个低级亚烷基(例如，含有1至10个 碳原子，如亚甲基(-CH₂-)、亚乙基(-CH₂CH₂-)、三亚甲基 (-CH₂CH₂CH₂-)、甲基亚乙基(-CH₂C(CH₃)H-)等)。呋喃环可以 是未取代或是被低级烷基取代的。在某些实施方案中，呋喃环在3碳 位被低级烷基，特别是甲基取代。呋喃基可以是2-呋喃基或3-呋喃基。 在某些实施方案中，所述含呋喃基基团是2-呋喃基或呋喃-2-基甲基；

(b)含吡啶基基团，其中所述含吡啶基基团是具有结构-R¹⁰-吡啶 基的吡啶基烷基，其中R¹⁰是一个低级亚烷基(例如，含有1至10个 碳原子，如亚甲基(-CH₂-)、亚乙基(-CH₂CH₂-)、三亚甲基 (-CH₂CH₂CH₂-)、甲基亚乙基(-CH₂C(CH₃)H-)等)。吡啶环可以 是未取代或是被低级烷基取代的。吡啶环可以是2-吡啶基、3-吡啶基 或4-吡啶基。在某些实施方案中，所述含呋喃基基团是3-吡啶基或吡 啶-3-基甲基；

(c)含噻吩基基团，其中所述含噻吩基基团是具有结构-R¹⁰-噻吩 基的噻吩基烷基，其中R¹⁰是一个低级亚烷基(例如，含有1至10个 碳原子，如亚甲基(-CH₂-)、亚乙基(-CH₂CH₂-)、三亚甲基 (-CH₂CH₂CH₂-)、甲基亚乙基(-CH₂C(CH₃)H-)等)。噻吩环可以 是未取代或是被低级烷基取代的。在某些实施方案中，噻吩环在3碳 位由低级烷基，特别是甲基取代。噻吩基可以是2-噻吩基或3-噻吩基。 在某些实施方案中，所述含噻吩基基团是2-噻吩基或噻吩-2-基甲基； 或

(d)具有-R⁸OR⁹结构的烷氧基烷基，其中R⁸是一个低级亚烷基 (例如，含有1至10个碳原子，如亚甲基(-CH₂-)、亚乙基(-CH₂CH₂-)、 三亚甲基(-CH₂CH₂CH₂-)、甲基亚乙基(-CH₂C(CH₃)H-)等)，且 R⁹是一个低级烷基(特别是甲基)；R²是一个低级烷基；R³和R⁷各 自是一个低级烷基；R⁴和R⁶都是氢；且R⁵是一个氨基羰基(特别是 乙酰氨基(-NHAc或-NHC(O)CH₃))或H。

在式I的具体实施方案中，R³和R⁷各自为一个低级烷基，特别是 甲基。在式I的其他实施方案中，R²是甲氧基。在式I的另一个实施 方案中，-R⁸OR⁹是-(CH₂)₂OCH₃。在式I的其他实施方案中，X是S。 在式I的其他实施方案中，R⁵是一个氨基羰基。根据式I的另一实施 方案，R¹是-R⁸OR⁹。在式I的其他实施方案中，R³和R⁷是烷基，特 别是除了甲基之外的低级烷基。在式I的其他实施方案中，R³或R⁷中的一个是低级烷基，且R³或R⁷中的另一个是H。

在另一实施方案中，示例的反向激动剂或中性拮抗剂具有以下结 构：

(式II)

其中R¹选自

或和

R²-R⁶各自独立地选自H、烷基、取代烷基或卤素；前提是化合物 不是

或

在式II的某些实施方案中，R¹是：

在式II的其他实施方案中，R¹是：

在式II的某些实施方案中，R²-R⁶分别独立地选自H或烷基(特 别是低级烷基)。在式II的一个具体实施方案中，R³-R⁵都是H且R²和R⁶是低级烷基，特别是甲基。

反向激动剂的具体实例在下文示出：

化合物1(此处也称作化合物S2)(NCGC00161856)

化合物S2-6(NCGC00229600)

化合物S2-7(NCGC00242364)

中性拮抗剂的的具体实例在下文示出：

化合物1(此处也称作化合物S2)(NCGC00161856)

化合物S2-6(NCGC00229600)

化合物S2-7(NCGC00242364)

化合物S2-8(NCGC00242595)

化合物S2-17(NCGC00242589-01)

化合物S2-29(NCGC00242580-01)

药物组合物

本发明的另一方面包括药物组合物，其制备用于给药受试者，且 包括治疗有效量的一种或多种此处公开的化合物。在某些实施方案中， 所述药物组合物用于治疗甲状腺癌、甲状腺机能亢进症(特别是格雷 夫斯甲状腺机能亢进症)、或格雷夫斯眼眶病。所公开的化合物的治 疗有效量将取决于给药途径、受试者类型和被治疗的受试者的身体特 征。可考虑的具体因素包括病情严重程度和疾病阶段、体重、饮食和 同用药物。这些因素与决定所公开的化合物的治疗有效量之间的关系 是本领域技术人员所了解的。

用于给药受试者的药物组合物除了选择的分子之外可包括至少一 种其他可药用的添加剂如载体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、 表面活性剂等。药物组合物也可包括一种或多种额外活性成分如抗菌 剂、消炎药、麻醉剂等。可用于这些制剂的可药用的载体是常规的。 Remington’s Pharmaceutical Sciences，E.W.Martin，Mack Publishing  Co.，Easton，PA，第19版(1995)记载了适用于此处公开化合物的药物 递送的组合物和制剂。

通常，载体的种类取决于采用的具体给药形式。例如，肠外制剂 通常含有可注射液体作为载体，所述液体包括药用且生理可接受液体 如水、生理盐水、平衡盐溶液、水性葡萄糖、丙三醇等。对于固体组 合物(例如粉剂、丸剂、片剂、或胶囊形式)，常规无毒固体载体可 包括，例如，药用级甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物中性 载体，待给药的药物组合物可含有少量无毒辅助物质，如润湿剂或乳 化剂、防腐剂、和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或山梨醇单月桂酸酯。

此处公开的药物组合物包括那些由此处公开化合物的可药用的盐 和/或溶剂化物形成的组合物。可药用的盐包括那些衍生自可药用的无 机或有机碱和酸的盐。特别公开的化合物具有至少一个碱性基团，其 可与酸形成酸-碱盐。碱性基团的实例包括但不限于氨基和亚氨基。可 以与这种碱基形成盐的无机酸的实例包括但不限于矿物酸如盐酸、氢 溴酸、硫酸或磷酸。所述碱性基团也可与有机羧酸、磺酸、硫代酸(sulfo  acid)或磷酸或N-取代氨基磺酸，如乙酸、丙酸、乙醇酸、丁二酸、 马来酸、羟基马来酸、甲基马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、葡糖 酸、葡糖二酸、葡糖醛酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、水杨 酸、4-氨基水杨酸、2-苯氧基苯甲酸、2-乙酰基苯甲酸、亚甲基双羟基 萘酸(embonic acid)、烟酸或异烟酸成盐，且此外，与氨基酸，例如 α-氨基酸，以及与甲磺酸、乙磺酸、2-羟基甲磺酸、乙烷-1，2-二磺酸、 苯二磺酸、4-甲基苯磺酸、萘-2-磺酸、2-或3-磷酸甘油酸、葡萄糖-6- 磷酸或N-环己基氨基磺酸(形成环己基氨基磺酸(cyclamate))或与 其他酸性有机化合物，如抗坏血酸形成盐。特别地，合适的盐包括那 些源自碱金属如钾和钠、碱土金属如钙和镁，以及药物领域熟知的多 种其他酸的盐。

某些化合物包括至少一种酸性基团，其可与无机或有机碱形成酸- 碱盐。由无机碱形成的盐的实例包括本文公开的化合物与碱金属如钾 和钠、碱土金属，包括钙和镁等形成的盐。同样地，涉及酸性化合物 与一种有机碱，如胺(此处使用的称作胺的术语应理解为包括它们的 共轭酸，除非上下文中明确指出为游离胺)的盐，包括与碱性氨基酸、 脂肪胺、杂环胺、芳香胺、吡啶、胍和脒形成的盐。对于脂肪胺而言， 无环脂肪胺、和环状以及无环二-和三-烷基胺特别适用于本公开的化 合物。此外，也可以使用季铵抗衡离子。

用于本发明化合物的合适胺碱(及其相应铵离子)的具体实例包 括，但不限于，吡啶、N，N-二甲基氨基吡啶、二氮杂二环壬烷、二氮 杂二环十一烯、N-甲基-N-乙胺、二乙胺、三乙胺、二异丙基乙胺、单 -、双-或三-(2-羟乙基)胺、2-羟基-叔丁基胺、三(羟甲基)甲胺、N，N-二 甲基-N-(2-羟乙基)胺、三(2-羟乙基)胺和N-甲基-D-葡糖胺。“可药用 的盐”的其他实例参见Berge等人，J.Pharm.Sci.66：1(1977)。

此处公开的化合物可以是结晶的且可以单晶形式或作为不同晶形 的结合物提供。因此，化合物能够以一种或多种物理形式提供，如不 同晶形、结晶、液晶或非晶形(无定形)。化合物的所述不同物理形 式可使用例如用于重结晶的不同溶剂或不同溶剂混合物而制备。替代 地或另外地，不同的多晶型可通过例如在不同温度下进行再结晶和/ 或通过改变再结晶过程中的冷却速度制备。多晶型的存在可通过X射 线晶体学测定，或在有些情况下通过另一种光谱技术，如固相NMR 光谱、IR光谱测定，或通过差示扫描量热法测定。

药物组合物可通过各种黏膜给药形式给药受试者，包括通过口腔、 直肠、鼻腔、肺内、或透皮给药，或通过局部递送至其他表面。任选 地，组合物可通过非黏膜路线给药，包括通过肌肉内、皮下、静脉内、 动脉内、关节内、腹膜内、鞘内、侧脑室、或肠胃外路线。在其他替 代实施方案中，化合物可体外给药，通过直接暴露于源自受试者的细 胞、组织或器官进行。

为制成药物组合物，可将化合物与各种可药用的添加剂，以及一 种用于化合物分散的底物(base)或载体(vehicle)结合。可用的添 加剂包括，但不限于，pH控制剂，如精氨酸、氢氧化钠、甘氨酸、盐 酸、柠檬酸等。此外，可以包括局部麻醉药(例如，苄醇)、等张化 剂(isotonizing agents)(例如，氯化钠、甘露醇、山梨醇)、吸附抑 制剂(例如，Tween 80或Miglyol812)、增溶剂(例如，环糊精及其 衍生物)、稳定剂(例如，血清白蛋白)、以及还原剂(例如，谷胱 甘肽)。在组合物中可包括佐剂，如氢氧化铝(例如，Amphogel、 Wyeth Laboratories、Madison、NJ)、佛氏佐剂、MPL^TM(3-O-脱酰 单磷酰基脂A，Corixa，Hamilton，IN)、和IL-12(Genetics Institute、 Cambridge、MA)，以及许多本领域已知的其他适当佐剂。当组合物 是液体时，制剂的张力(tonicity)——参考作为单位的0.9％(w/v) 生理盐水的张力而测定——通常调节为在给药点不会导致明显的不可 逆转的组织损伤的数值。通常地，溶液的张力调节为约0.3至3.0的数 值，如约0.5至约2.0，或约0.8至约1.7。

所述化合物可以分散在一种底物或载体(其可包括能够分散该化 合物的亲水性化合物)和任何所需的添加剂中。所述底物可选自宽范 围的适当化合物，包括但不限于，聚羧酸或其盐、羧酸酐(例如马来 酸酐)与其他单体(例如(甲基)丙烯酸甲酯、丙烯酸等)的共聚物； 亲水性乙烯基聚合物，如聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮； 纤维素衍生物，如羟甲基纤维素、羟丙基纤维素等；以及天然聚合物， 如壳聚糖、胶原质、海藻酸钠、凝胶、透明质酸、及其无毒金属盐。 通常。选择生物可降解的聚合物作为底物或载体，例如，聚乳酸、聚 (乳酸-乙醇酸)共聚物、聚羟基丁酸、聚(羟基丁酸-乙醇酸)共聚 物及它们的混合物。替代地或额外地，合成脂肪酸酯如聚甘油脂肪酸 酯、蔗糖脂肪酸酯等也可用作载体。亲水性聚合物和其他载体可单独 使用或结合使用，且可通过部分结晶、离子结合、交联等增强所述载 体的结构完整性。载体能够以多种形式提供，包括液体或粘性溶液、 凝胶、膏状、粉末、微球体以及直接用于黏膜表面的薄膜。

所述化合物可依照多种方法与底物或载体结合，且化合物的释放 可通过扩散、载体的分解，或伴随形成水通道。在有些情况下，所述 化合物在由合适聚合物，如2-氰基丙烯酸异丁酯制备的微胶囊(微球 体)或纳米胶囊(纳米球体)中分散(参见，例如，Michael等人， J.Pharmacy Pharmacol.43：1-5，1991)，以及在生物相容性分散介质中 分散，在延长的时间里产生持续递送和生物活性。

或者，本公开的组合物可包括为接近生理条件所需的可药用的载 体物质，如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等，例如，乙 酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、单月桂酸山梨醇酯和油酸 三乙醇胺。对于固体组合物，可使用常规无毒可药用的载体包括，例 如，药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、 葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。

用于给药所述化合物的药物组合物也可制成溶液、微乳液、或其 他适用于高浓度活性成分的有序结构。载体可以是溶剂或分散介质， 其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液态聚乙二醇 等)，及其合适混合物。溶液的适当流动性可通过例如以下方式保持： 使用一种涂料(coating)如卵磷脂、在可分散制剂情况下保持所需的 颗粒尺寸、以及使用表面活性剂。在许多情况下，可取的是组合物中 包括等渗剂，例如，糖类、多元醇，如甘露醇和山梨醇、或氯化钠。 可通过在组合物中包含延迟吸附的试剂——例如，单硬脂酸盐和明 胶——延长化合物的吸附。

在某些实施方案中，所述化合物可以作为延时释放剂型给药，例 如在包括缓慢释放聚合物的组合物中。这些组合物可使用防止快速释 放的载体制备，所述载体例如控制释放载体，如聚合物、微包封递送 体系或生物黏附凝胶。可通过在组合物中包括延迟吸附的试剂——例 如单硬脂酸铝水凝胶和明胶——而使得本公开的各种组合物延时递 送。当需要控制释放制剂时，适用于本公开用途的控制释放粘合剂包 括任何对活性试剂惰性且化合物和/或其他生物活性剂可容入的生物 相容控制释放材料。许多这种材料是本领域已知的。有用的控制释放 粘合剂是在其递送后的生理条件下(例如，在粘膜表面、或在体液存 在下)缓慢代谢的材料。合适的粘合剂包括，但不限于，本领域已知 的用于缓释制剂的生物相容聚合物和共聚物。所述生物相容化合物是 无毒的且对周围组织是惰性的，并不会引起明显不良副作用，如鼻腔 刺激、免疫响应、炎症等。它们代谢为同样生物相容且易于从体内消 除的代谢产物。

在本公开中使用的示例聚合材料包括，但不限于，源自含有可水 解酯键的共聚和均聚聚酯的聚合物基体(matrix)。本领域已知其中 许多是可生物降解且产生无毒或低毒降解产物。示例聚合物包括聚乙 醇酸和聚乳酸、聚(DL-乳酸-共-乙醇酸)、聚(D-乳酸-共-乙醇酸)、 和聚(L-乳酸-共-乙醇酸)。其他有用的可生物降解或生物可蚀性聚 合物包括，但不限于，聚(ε-己内酯)、聚(ε-己内酯-共-乳酸)、聚 (ε-己内酯-共-乙醇酸)、聚(β-羟基丁酸)、聚(烷基-2-氰基丙烯酸 酯)、水凝胶，如聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、聚酰胺、聚(氨基酸) (例如，L-亮氨酸、谷氨酸、L-天门冬氨酸等)、聚(酯尿素)、聚 (2-羟乙基DL-天冬酰胺)、聚缩醛聚合物、聚原酸酯、聚碳酸酯、 聚马来酰胺、聚多糖、及其共聚物。本领域技术人员已知许多用于制 备这种制剂的方法(参见，例如，Sustained and Controlled Release Drug  Delivery Systems，J.R.Robinsond，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York， 1978)。其他有用的制剂包括控制-释放微胶囊(美国专利4,652,441 和4,917,893)、用于制造微胶囊和其他制剂的乳酸-乙醇酸共聚物(美 国专利4,677,191和4,728,721)以及用于水溶肽的缓释组合物(美国 专利4,675,189)。

本公开的药物组合物在制造、储存和使用条件下通常是无菌且稳 定的。无菌溶液的制备可通过在适当溶剂中视所需地将所需用量的化 合物与此处列举的成分的一种或其结合物相合并，随后过滤除菌。通 常，分散体的制备通过将化合物和/或其他生物活性剂结合进含有基本 分散介质和此处列举的所需其他成分的无菌载体中而进行。在无菌粉 末的情况下，制备方法包括真空干燥和冻干，由事先无菌-过滤的溶液 产生化合物加上任何额外需要的成分的粉末。防止微生物作用可通过 各种抗菌和抗真菌剂实现，例如苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、 硫柳汞(thimerosal)等。

根据本发明的各种治疗方法，所述化合物可以用与处理寻求治疗 和预防的疾病的方法相关的常规方法一致的方式递送至受试者。根据 此处的公开，预防或治疗有效量的化合物和/或其他生物活性剂在一段 时间内并在足以预防、抑制和/或改善所选择的疾病或状况或其一种或 多种症状的条件下给药需要这种治疗的受试者。

所公开的化合物的给药可用于预防或治疗目的。当为预防提供时， 在任何症状出现前提供化合物。化合物的预防给药用于防止或改善任 何随后的疾病进程。当为治疗提供时，化合物在疾病或感染症状发作 时(或发作后不久)提供。

对于预防和治疗目的，化合物可通过口服或单剂量递送，或在延 长的时间期限内连续递送(例如，连续地通过皮肤、黏膜或静脉递送)、 或以重复给药方案(例如，通过每小时、每天或每周地重复给药方案) 给药受试者。治疗有效剂量的化合物可作为重复剂量在延长的预防或 治疗方案中提供，其将产生临床上显著结果，从而减轻与本文所述的 目标疾病或病况相关的一种或多种症状或可检测情况。在这一方面有 效剂量的测定通常基于动物模型试验及随后的人体临床试验，且通过 在受试者中明显降低目标疾病症状或状况的出现和严重性的给药方案 引导。在这方面合适的模型包括，例如，小鼠、大鼠、鸟类、猪、猫 科动物、非人类灵长类动物、和其他本领域已知的可用动物模型受试 体。或者，有效剂量可使用体外模型测定。使用这种模型，仅需要普 通计算和调整以测定治疗有效量化合物给药的适当浓度和剂量(例如， 有效减轻一种或多种目标疾病症状的用量)。在替代实施方案中，为 了治疗或预防目的，化合物的有效量或有效剂量可仅抑制或增强一种 或多种所选择的与此处给出的疾病或状况相关的生物活性。

化合物的实际剂量将根据多种因素变化，所述因素如疾病指征和 受试者的具体情况(例如，受试者年龄、身材、健康程度、症状程度、 易感因素等)、给药时间和途径、同时给药的其他药物或治疗、以及 用于在受试者体内引起想要的活性或生物响应的化合物的具体药理 学。可调节剂量方案从而提供最优的预防或治疗响应。治疗有效剂量 也是临床上任何化合物和/或生物活性剂的治疗有益效果超过毒性或 有害副作用的用量。本公开的方法和制剂中的化合物和/或其他生物活 性剂的治疗有效量的非限制范围为约0.01mg/kg体重至约20mg/kg体 重，如约0.05mg/kg至约5mg/kg体重，或约0.2mg/kg至约2mg/kg 体重。

主治医生可改变剂量从而在目标部位(例如，肺或全身循环)保 持想要的浓度。可基于递送形式选择更高或更低的浓度，例如经皮肤、 直肠、口服、肺部、或鼻腔递送的浓度相对于静脉或皮下递送的浓度。 也可以根据给药制剂的释放速率，例如，肺内喷雾相对于粉剂的释放 速率、缓释口服相对于注射微粒或透皮递送制剂的释放速率等，调整 剂量。

此处公开的化合物也可与其他治疗药剂共给药。所述药剂包括， 但不限于，消炎剂、基质金属蛋白酶抑制剂、脂氧合酶抑制剂、细胞 因子(cytokine)拮抗剂、免疫抑制剂、抗癌剂、抗病毒剂、细胞因子、 生长因子、免疫调节剂、前列腺素或抗血管增生化合物。

本发明也包括含有此处记载的药物组合物、活性成分和/或将其用 在哺乳动物受试者中预防和治疗疾病和其他状况的给药工具的试剂 盒、包装体(package)和多容器单位。也提供用于诊断用途的试剂盒。 在一个实施方案中，这些试剂盒包括含有一种或多种此处公开的化合 物的容器或制剂。在一个示例中，该成分被制成药物制剂用于递送至 受试者。所述化合物任选包含于散装配药容器或单位或多单位剂型中。 可提供任选配药工具，例如，肺部或鼻腔喷雾器具。包装材料任选包 括标签或说明，指出包装于其中的药剂用于何种治疗目的和/或以何种 方式使用。

实施例

发现化合物1(2-(3-((2，6-二甲基苯氧基)甲基)-4-甲氧基苯基)-3-(呋 喃-2-基甲基)-2，3-二氢喹唑啉-4(1H)-酮)[NCGC00161856](图1A)是 一种反向激动剂(参见图1B)。化合物1抑制通过TSHRs的基础cAMP 的生产58％，且IC₅₀＝3.0μM。图2说明1抑制TSH-刺激cAMP生 产86％，IC₅₀＝0.78μM。此外，TSH-刺激cAMP生产(图2B)的Schild 分析显示，1起到TSH信号的竞争性拮抗剂的作用(未示出)。竞争 性拮抗通常由拮抗剂和激动剂之间的结合竞争引起。然而，1对 ¹²⁵I-TSH结合至HEK-EM 293细胞表面的TSHRs没有作用(数据未 示出)。预计1对TSH结合缺少作用，因为之前已经示出1的母化合 物不影响TSH结合且有证据显示其结合于TSHR跨膜区域。推断1 结合于TSHR的相同区域。

少数甲状腺机能亢进症病人表现出由组成性活性突变TSHRs (CAMs)的基础信号引发的增强的甲状腺功能。测定了野生型TSHR 和四种甲状腺机能亢进症病人体内的CAMs-S281N、M453T、I568T 和F631I的基础活性、即60分钟内在瞬时表达TSHRs的HEK-EM 293 细胞中的cAMP生产。这些CAMs表现出15至27倍于野生型TSHR 的组成性信号。图3说明化合物1抑制所有4种CAMs的基础信号， 其测定具有下述IC₅₀和最大抑制水平：S281N为1.4μM和78％，I568T 为3.7μM和77％，F631I为0.5μM和36％，以及M453T为0.6μM 和42％。化合物1的基础信号抑制水平似乎将这些CAMs分为两组， 对其中一组的抑制高于另一组。

化合物1的拮抗剂和反向激动剂活性在原代培养的人类甲状腺细 胞中测定，所述细胞为更生理相关的细胞体系，允许测定TSHR配体 对分化型甲状腺功能中重要基因表达的作用。这是很重要的，因为已 经显示TSHR突变信号在不同细胞型中不同。首先证实了化合物1减 少了人类甲状腺细胞中的cAMP积聚(图4A)。由于1没有减少由异 丙肾上腺素(用于7TMR β-肾上腺素受体即血管活性肠肽的激动剂， 所述肠肽通过7TMR发信号)，或毛喉素(forskolin)(一种腺苷环 化酶激活剂)在这些细胞中刺激的cAMP积聚(未示出)，我们推断 化合物1在人类甲状腺细胞中起到TSHR反向激动剂的作用。TSH和 上文具体确定的小分子配体激动剂提高甲状腺细胞中一些基因的表达 (J Biomol Screen 13，120，2008；Proc Nat Acad Sci 106，12471，2009)。 在不存在任何激动剂的情况下对于这些基因TPO、TSHR、TG和DIO2 测定了化合物1对mRNAs表达的效果(图4B)。在IBMX存在下未 用或单独用化合物1处理甲状腺细胞48小时。化合物1降低了TPO、 TSHR、TG、NIS和DIO2的mRNAs水平。因此，化合物1是这样一 种人类甲状腺细胞中的反向激动剂，其最可能通过抑制转录而降低一 些在分化型甲状腺细胞中表达基因的mRNAs水平。这些结果支持了 化合物1或其类似物能在人体中用于抑制非TSH依赖信号的观点。

化合物1的一种新型类似物，S2-6[2-(3-((2，6-二甲基苯氧基)甲 基)-4-甲氧基苯基)-3-(吡啶-3-基甲基)-2，3-二氢喹唑啉-4-酮] (NCGC00229600)如化合物1(NCGC00161856)是强力且有效的 TSHR拮抗剂，但由于其增加的溶解性(J.Clin.Endocrinol.Metab.96， 548，2011)是更好的药物。我们证明了S2-6是人类细胞中TSHR的基 础刺激和TSH刺激拮抗剂(参见图6-9)。S2-6在30μM时抑制通过 TSHRs的基础cAMP生产53％，并在30μM时抑制通过TSH的EC₅₀浓度刺激的cAMP生产53％。S2-6对cAMP生产的抑制是在TSH高 剂量下被克服的，并因此是“竞争性”的。竞争性抑制可通过由S2-6 竞争TSH结合而引起，然而，S2-6对¹²⁵I-TSH结合至HEKTSHR细 胞没有影响，且因此是一种变构反向激动剂。最重要地，S2-6在源自 30名格雷夫斯甲状腺机能亢进症的病人，包括至少一名格雷夫斯眼眶 病病人的血清中测试(图13)。S2-6抑制了测试的所有30份格雷夫 斯病血清的cAMP生产39±2.6％。在原代培养人类甲状腺细胞中，S2-6 在格雷夫斯病血清上调的甲状腺过氧化物酶mRNA水平中抑制 TSHR-介导的基础和甲状腺-刺激抗体65±2.0％(图14)。因此， S2-6——一种TSHR的小分子变构反向激动剂，是一种通过格雷夫斯 病患者血清中的甲状腺-刺激抗体活化TSH受体的常规拮抗剂。

在至少两组病人中治疗地使用反向激动剂。由组成性活性突变 (CAMs)——尤其是胚系突变——引起非自体免疫甲状腺机能亢进 症患者是一组，其中反向激动剂能够见效，因为已经示出化合物1和 甲状腺抑制抗体抑制通过在组织培养的细胞中表达的疾病相关CAMs 的基础信号。小分子配体反向激动剂的使用可能在遗传这类疾病的儿 童上最有价值，在这类疾病中放射碘和手术切除较不受欢迎。其中这 种药物有用的较多一类病人是患有复发或转移甲状腺癌的病人，其正 在服用甲状腺激素用于抑制TSH，但由于TSHR的非激动剂依赖信号， 其癌细胞仍被刺激增生和转移。

在初步试验中，已经显示化合物S2-6抑制从格雷夫斯眼眶病患者 得到的眼球后纤维原细胞上的TSHRs的活化。眼球后纤维原细胞从正 在进行格雷夫斯眼眶病的眼部减压手术的患者得到并进行处理以用于 细胞培养。显示出S2-6在这些细胞培养的纤维原细胞中抑制基础信号 75％并抑制甲状腺-刺激抗体-刺激的信号(85％)。

上述结果显示，在一个示例性实施方案中，反向激动剂和中性拮 抗剂用于格雷夫斯眼眶病(其源自作用于眼球后TSHRs的刺激TSHR 抗体)的治疗(例如，作为初始治疗)，以及，在另一示例性实施方 案中，作为格雷夫斯甲状腺机能亢进症手术的替代治疗剂，例如，用 于复发格雷夫斯甲状腺机能亢进症(在放射碘或抗-甲状腺药物治疗之 后)。反向激动剂可用于复发或转移甲状腺癌病人，其正在服用甲状 腺激素用于抑制TSH，但由于TSHR的非TSH激动剂依赖信号，其 癌细胞仍被刺激增生和转移。

材料和方法

一般合成

购买得到所有市售制剂和溶剂，不经过进一步纯化直接使用。所 有微波反应都在配有磁力搅拌棒的密封微波瓶中进行，并在Biotage 引发微波合成器(Initiator Microwave Synthesizer)中加热。使用Inova 400MHz光谱仪(Varian)记录¹H谱图。使用LCMS分析样品纯度： 配有Zorbax^TM Eclipse XDB-C18反相柱(5微米，4.6x150mm)且流 动速度为1.1mL/分钟的Agilent 1200系列LC/MS。流动相是各含有 0.05％三氟乙酸的乙腈和H₂O的混合物。在分析型分析过程中于8分 钟内使用5％至100％梯度的乙腈。在Agilent 6210 Electrospray TOF 质谱仪上进行高分辨质谱测量。

使用下述一般过程合成具有不同但相似结构的化合物。如果必需， 本领域技术人员将了解如何改变这些一般过程而实现想要的转化。

路线1.合成二氢喹唑啉-4-酮7

如路线1所描述，通过将2-氨基苯甲酸1与不同胺进行酰胺耦合， 或将衣托酸酐(isatoic anhydride)2与胺反应制备2-氨基苯甲酰胺3。 苄基氯5与不同苯酚(或苯硫酚)4在微波辐射下的反应产生醛6。醛 6与2-氨基苯甲酰胺3缩合产生2，3-二氢喹唑啉-4-酮7。

由衣托酸酐合成2-氨基苯甲酰胺(3)的一般过程：

在室温下将胺(1.05mmol，1.05当量)加入衣托酸酐(0.16g，1.0 mmol，1.0当量)的10mL无水乙腈溶液。得到的混合物在室温下搅拌 2h并在50℃加热4小时。随后，真空浓缩得到产率为90-99％的固 体产物。

2-氨基-N-(呋喃-2-基甲基)苯甲酰胺：

¹H NMR(400MHz，CHLOROFORM-d)δ4.60(s，1H)，4.61(s， 1H)，5.57(br.s.，2H)，6.24-6.42(m，3H)，6.59-6.74(m，2H)， 7.16-7.25(m，1H)，7.33-7.39(m，2H)；LCMS：(电喷+ve)，m/z 217.1 (MH)⁺；HPLC：t_R＝3.77分钟，UV₂₅₄＝98％。

2-氨基-N-(2-甲氧基乙基)苯甲酰胺：

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)ppm 3.23(s，3H)，3.28-3.49(m， 4H)，6.36(br.s.，2H)，6.47(t，J＝7.4Hz，1H)，6.65(d，J＝7.4Hz， 1H)，7.00-7.18(m，1H)，7.44(d，J＝6.7Hz，1H)，7.99-8.31(m， 1H)；LCMS：(电喷+ve)，m/z 195.1(MH)⁺；HPLC：t_R＝2.70分钟，UV₂₅₄＝95％.

2-氨基-N-(吡啶-3-基甲基)苯甲酰胺：

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)ppm 4.41(d，J＝5.9Hz，2H)，6.40 (br.s.，2H)，6.49(t，J＝7.4Hz，1H)，6.67(d，J＝7.4Hz，1H)，7.12 (t，J＝7.0Hz，1H)，7.32(dd，J＝7.6，4.9Hz，1H)，7.51(d，J＝7.0Hz， 1H)，7.68(d，J＝7.8Hz，1H)，8.28-8.69(m，2H)，8.79(t，J＝5.7Hz， 1H)；LCMS：(电喷+ve)，m/z 228.1(MH)⁺；HPLC：t_R＝2.21分钟，UV₂₅₄＝95％。

合成1[2-(3-((2，6-二甲基苯氧基)甲基)-4-甲氧基苯基)-3-(呋喃-2- 基甲基)-2，3-二氢喹唑啉-4(1H)-酮(NCGC00161856)]。

向3-(氯甲基)-4-甲氧基苯甲醛(85mg，0.46mmol，1.0当量)和2，6- 二甲基苯酚(62mg，0.51mmol，1.1当量)的3.0mL无水乙腈溶液中 加入K₂CO₃(320mg，2.3mmol，5.0当量)。将混合物在微波反应器中 150℃加热30分钟。滤除固体并移除溶剂后，加入5mL EtOH中的 2-氨基-N-(呋喃-2-基甲基)苯甲酰胺(110mg，0.51umol，1.1当量)， 随后加入三氟甲磺酸镱(57mg，0.02umol，0.2当量)。将混合物在80 ℃下加热2小时。通过制备型HPLC纯化分离产物并通过减压冻干法 移除溶剂，以二乙醚研磨后得到白色固体2-(3-((2，6-二甲基苯氧基)甲 基)-4-甲氧基苯基)-3-(呋喃-2-基甲基)-2，3-二氢喹唑啉-4(1H)-酮(64.5 mg，30％)。¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δppm 2.16(s，6H)，3.77 (s，3H)，3.86(d，J＝15.6Hz，1H)，4.69(d，J＝1.9Hz，2H)，5.19(d， J＝15.4Hz，1H)，5.75(d，J＝2.3，Hz，1H)，6.30(d，J＝3.2Hz，1H)， 6.39(dd，J＝3.2，1.9Hz，1H)，6.62-6.70(m，2H)，6.86-6.97(m，1 H)，6.99-7.04(m，3H)，7.19-7.29(m，2H)，7.32(d，J＝2.3Hz，1H)， 7.49(d，J＝2.4，Hz，1H)，7.57(dd，J＝1.8，0.7Hz，1H)，7.68(dd， J＝7.9，1.5Hz，1H)；HPLC：t_R＝6.88分钟，UV₂₅₄＝97％；HRMS(ESI)： m/z计算C₂₉H₂₈N₂O₄[M+1]⁺469.2132，实际469.2138。

合成S2-6。向3-(氯甲基)-4-甲氧基苯甲醛(300mg，1.625mmol，1.0 当量)和2，6-二甲基苯酚(218mg，1.787mmol，1.1当量)的10ml乙 腈溶液中加入碳酸钾(1.1g，8.12mmol，5.0当量)。将混合物在150℃ 微波加热30分钟。完成后立即过滤混合物并干燥得到黄色固体3-[(2，6- 二甲基苯氧基)甲基]-4-甲氧基苯甲醛(400mg，产率91％)。将其中 一部分(100mg，0.370mmol，1.0当量)溶于乙醇(4ml)，并向其中 加入2-氨基-N-(吡啶-3-基甲基)苯甲酰胺(92mg，0.407mmol，1.1当 量)，随后加入三氟甲磺酸镱(III)(45.9mg，0.074mmol，0.2当量)。 将混合物在80℃下加热2小时。完成后立即将混合物干燥并在硅胶 上使用0-30％EtOAc(乙酸乙酯)/己烷梯度洗提液层析得到想要的棕 褐色固体2-{3-[(2，6-二甲基苯氧基)甲基]-4-甲氧基苯基}-3-(吡啶-3-基 甲基)-2，3-二氢喹唑啉-4(1H)-酮(110mg，产率62.0％)。1H核磁共 振(400MHz，DMSO-d6)δppm 8.39-8.45(m，2H)，7.60-7.67(m，2 H)，7.48(d，J＝2.35Hz，1H)，7.15-7.35(m，4H)，6.94-7.02(m，3 H)，6.84-6.93(m，1H)，6.60-6.69(m，2H)，5.82(d，J＝2.35Hz，1 H)，5.07(d，J＝15.65Hz，1H)，4.64(d，J＝2.74Hz，2H)，3.99(d， J＝15.45Hz，1H)，3.73(s，3H)，2.12(s，6H)；液相色谱质谱联用 仪：(电喷+ve)，m/z 480.2(MH)⁺(分子量加1)；HPLC：t_R＝5.05分 钟，UV₂₅₄＝100％.高分辨质谱(电喷离子化)：m/z c计算C₃₀H₃₀N₃O₃[M+H]⁺480.2282，实际480.2291。

合成N-(4-(5-(3-(呋喃-2-基甲基)-4-氧-1，2，3，4-四氢喹唑啉-2-基)-2- 甲氧基苄氧基)-3，5-二甲基苯基)乙酰胺(7a；化合物S2-7)：

用乙酸酐(6ml，63.6mmol)和PtO₂(200mg，0.881mmol)处理氢 化反应器中AcOH(20ml)、MeOH(15ml)、和THF(10ml)中的 2，6-二甲基-4-硝基酚(4a，1.58g，9.45mmol)悬浮液，并使用H₂加压至 50p.s.i并振荡24h。将反应混合物减压至大气压，用EtOAc稀释，用 H₂O清洗，干燥(MgSO₄)，过滤并在减压下浓缩。分离白色固体N-(4- 羟基-3，5-二甲基苯基)乙酰胺(4b)，其基于LCMS分析是纯的、不经 进一步纯化使用。将碳酸钾(810mg，5.34mmol)加入四丁基碘化铵 (78.9mg，0.534mmol)、3-(氯甲基)-4-甲氧基苯甲醛(5a，197mg， 1.07mmol)和N-(4-羟基-3，5-二甲基苯基)乙酰胺(4b，211mg， 1.18mmol)的20ml乙腈溶液中。将反应混合物在微波中加热至150℃ 1小时，过滤并减压浓缩。残余物使用5-50％EtOAc/DCM梯度通过 硅胶柱层析纯化得到想要的白色固体产物6a(196mg，56％)。¹H NMR (400MHz，CHLOROFORM-d)ppm 2.15(s，3H)，2.28(s，6H)，3.93 (s，3H)，4.83(s，2H)，7.02(d，J＝8.4Hz，1H)，7.13(s，1H)，7.17 (s，2H)，7.89(dd，J＝8.4，2.0Hz，1H)，8.12(d，J＝1.8Hz，1H)， 9.94(s，1H)；LCMS：(电喷+ve)，m/z 328.2(MH)⁺，t_R＝3.16分钟， UV₂₅₄＝＞95％。将5ml EtOH中的N-(4-(5-甲酰基-2-甲氧基苄氧基)-3，5- 二甲基苯基)乙酰胺(6a，145mg，0.441mmol)、2-氨基-N-(呋喃-2-基甲 基)苯甲酰胺(3b，105mg，0.486mmol)和0.2当量Yb(OTf)₃在80℃ 下加热4h。将反应混合物减压浓缩，并将残余物使用己烷中7-60％乙 酸乙酯在硅胶柱上层析得到想要的产物7a(40.9mg，0.078mmol，产 率17.6％)。¹H NMR(400MHz，CHLOROFORM-d)ppm 2.15(s，3H)， 2.21(s，6H)，3.77(d，J＝15.7Hz，1H)，3.84(s，3H)，4.41(s，1H)， 4.70-4.87(m，2H)，5.35(d，J＝15.7Hz，1H)，5.78(s，1H)，6.20(d， J＝2.9Hz，1H)，6.24-6.32(m，1H)，6.53(d，J＝8.0Hz，1H)，6.76 -6.91(m，2H)，7.03(br.s.，1H)，7.13(s，2H)，7.30-7.37(m，2H)， 7.49(d，J＝2.0Hz，1H)，7.92-8.03(m，1H)；LC/MS(电喷+ve)， m/z 526.2(MH)⁺，保留时间t＝5.71分钟；纯度：UV₂₂₀＞98％，UV₂₅₄＞98％；HRMS(ESI)：m/z计算C₃₁H₃₁N₃O₅[M+H]⁺526.2351，实际 526.2350。

合成2-(3-((2，6-二甲基苯硫基)甲基)-4-甲氧基苯基)-3-(呋喃-2-基甲 基)-2，3-二氢喹唑啉-4(1H)-酮(化合物S2-8)：

向3-(氯甲基)-4-甲氧基苯甲醛(91.0mg，0.5mmol，1.0当量)和 2，6-二甲基苯硫醇(68.4mg，0.5mmol，1.0当量)的4mL乙腈溶液中 加入碳酸钾(0.55g，4.0mmol，8.0当量)。将混合物在微波中加热至 150℃10分钟。滤除固体并移除溶剂后，加入5mL EtOH中的2-氨 基-N-(呋喃-2-基甲基)苯甲酰胺(107mg，0.5mmol，1.0当量)，随后加 入三氟甲磺酸镱(62mg，0.1mmol，0.2当量)。将混合物在80℃下 加热2小时。完成后立即干燥混合物并使用10-60％EtOAc/己烷梯度 洗脱液在硅胶柱上层析，并以二乙醚研磨后得到白色固体2-(3-((2，6- 二甲基苯硫基)甲基)-4-甲氧基苯基)-3-(呋喃-2-基甲基)-2，3-二氢喹唑啉 -4(1H)-酮(101.4mg，42％)。¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)ppm 2.26 (s，6H)，3.56(d，J＝15.7Hz，1H)，3.66(s，3H)，3.72(d，1H)， 3.79(d，1H)，5.12(d，J＝15.7Hz，1H)，5.55(d，J＝2.2Hz，1H)， 6.25(d，J＝3.1Hz，1H)，6.41(dd，J＝3.0，1.9Hz，1H)，6.59(d，J＝8.0 Hz，1H)，6.66(t，J＝7.5Hz，1H)，6.78-6.94(m，2H)，7.00-7.28(m， 6H)，7.59-7.66(m，2H)；LCMS：(电喷+ve)，m/z 485.2(MH)⁺，t_R＝7.16 分钟，UV254＝98％。HRMS(ESI)：m/z计算C₂₉H₂₈N₂O₃S[M+H]⁺485.1905，实际485.1905。

合成N-(4-(2-甲氧基-5-(4-氧-3-(吡啶-3-基甲基)-1，2，3，4-四氢喹唑啉 -2-基)苄氧基)-3，5-二甲基苯基)乙酰胺(化合物S2-17)：

将5mL EtOH中的N-(4-(5-甲酰基-2-甲氧基苄氧基)-3，5-二甲基苯 基)乙酰胺(100mg，0.305mmol)、2-氨基-N-(吡啶-3-基甲基)苯甲酰 胺(83mg，0.367mmol)和0.2当量Yb(OTf)₃在80℃下加热4h。 减压浓缩反应混合物，将剩余物使用DCM中的2-40％甲醇在硅胶柱 上层析得到想要的白色固体产物N-(4-(2-甲氧基-5-(4-氧-3-(吡啶-3-基 甲基)-1，2，3，4-四氢喹唑啉-2-基)苄氧基)-3，5-二甲基苯基)乙酰胺(68.2 mg，0.127mmol，产率41.6％)。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)ppm 1.96(s，3H)，2.08(s，6H)，3.74(s，3H)，3.98(d，J＝15.7Hz，1H)， 4.61(s，2H)，5.07(d，J＝15.3Hz，1H)，5.82(d，J＝2.3Hz，1H)， 6.58-6.74(m，2H)，6.97(d，J＝8.2Hz，1H)，7.12-7.37(m，6H)， 7.46(d，J＝2.0Hz，1H)，7.64(t，J＝6.8Hz，2H)，8.35-8.47(m，2H)， 9.67(s，1H)；LC/MS(电喷+ve)，m/z 537.2(MH)⁺，保留时间t＝4.23 分钟；纯度：UV₂₂₀＞98％，UV₂₅₄＞98％；HRMS(ESI)：m/z计算 C₃₂H₃₂N₄O₄[M+H]⁺537.2511，实际537.2511.

合成N-(4-(2-甲氧基-5-(3-(2-甲氧基乙基)-4-氧-1，2，3，4-四氢喹唑啉 -2-基)苄氧基)-3，5-二甲基苯基)乙酰胺(化合物S2-29)：

将5mLEtOH中的2-氨基-N-(2-甲氧基乙基)苯甲酰胺(71.2mg， 0.367mmol)、N-(4-(5-甲酰基-2-甲氧基苄氧基)-3，5-二甲基苯基)乙酰 胺(100mg，0.305mmol)和0.2当量Yb(OTf)₃在80℃下加热2h。 减压浓缩反应混合物，并将剩余物使用DCM中10-80％的乙酸乙酯在 硅胶柱上层析得到N-(4-(2-甲氧基-5-(3-(2-甲氧基乙基)-4-氧-1，2，3，4-四 氢喹唑啉-2-基)苄氧基)-3，5-二甲基苯基)乙酰胺(77.9mg，0.155mmol， 产率50.6％)。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)ppm 1.97(s，3H)，2.09 (s，6H)，2.90(ddd，J＝13.5，6.7，6.5Hz，1H)，3.19(s，3H)，3.31 -3.53(m，2H)，3.74(s，3H)，3.86-4.06(m，1H)，4.63(s，2H)， 5.85(d，J＝2.3Hz，1H)，6.53-6.69(m，2H)，6.98(d，J＝8.6Hz，1H)， 7.12-7.22(m，3H)，7.22-7.31(m，2H)，7.47(d，J＝2.3Hz，1H)， 7.61(d，J＝6.7Hz，1H)，9.67(s，1H)；LC/MS(电喷+ve)，m/z 504.2 (MH)⁺，保留时间t＝5.27分钟；纯度：UV₂₂₀＞98％，UV₂₅₄＞98％； HRMS(ESI)：m/z计算C₂₉H₃₃N₃O₅[M+H]⁺504.2496，实际504.2498。

培养HEK-EM 293细胞系和瞬时转染。HEK-EM 293细胞在补充 有10％胎牛血清、100单位/ml青霉素和10μg/ml链霉素(Life  Technologies Inc.)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中于37℃ 在潮湿的5％CO₂培养箱中生长。表达TSHRs的稳定HEK-EM 293 细胞系的产生已有记载(Endocrinology 149，5945，2008)。在含有0.2 μg DNA/孔的24孔板(每孔7.5x10⁴细胞)中根据制造商的方案使用 FuGENE^TM6试剂(Roche)用野生型TSHR或突变受体瞬时转染细胞。

培养原发性人甲状腺细胞。从在美国国家卫生研究院临床中心 (National Institutes of Health Clinical Center)为治疗甲状腺癌进行 甲状腺全切除术的病人的正常甲状腺组织收集甲状腺组织样本，如先 前所记载的(Proc Nat Acad Sci 106，12471，2009)。简而言之，手术 样本在于冰上的Hanks平衡盐溶液(HBSS)中保存，切成小块并用3 mg/ml IV型胶原酶(Gibco)消化。将单分散细胞放置于10cm组织 培养皿中的含有10％FBS的10ml DMEM的板中，并于37℃在潮湿 的5％CO₂培养箱中培养，24h后得到原代培养的粘附甲状腺细胞。 为了测定甲状腺球蛋白(TG)、甲状腺过氧化物酶(TPO)、TSHR 或2型脱碘酶(DIO2)mRNA表达，将甲状腺细胞以0.6x10⁴细胞/ 孔的密度接种于24孔板。24h后，用含2％FBS的DMEM清洗细胞 并在含2mM IBMX的介质中培养48小时。使用HBSS清洗细胞并加 入裂解液而结束培养。

TSHR基因定点诱变。通过QuickChange XL基因定点诱变试剂盒 (Stratagene)将S281N、M453T、I568T和F631I突变引入野生型 TSHR-pcDNA3.1。结构通过测序验证(MWG Biotech)。

cAMP生产测定。将瞬时转染HEK-EM293细胞或稳定表达TSHRs 的细胞以70,000细胞/孔的密度接种于含有10％胎牛血清(FBS)的 DMEM的96孔板中。培育细胞24小时后，在HBSS/HEPES，pH7.4 中培养细胞20至40分钟前并随后在含有1mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌 呤(IBMX)(SIGMA)的37℃潮湿培养箱中培养，其中IBMX不 含(基础)或含TSH或1；减去不含IBMX的HBSS/HEPES中培养 的细胞中的cAMP水平。抽出介质后，使用cAMP-Screen Direct^TM  System裂解缓冲液(Applied Biosystems)裂解细胞。细胞裂解物的 cAMP含量使用制造商说明中记载的方法测定。使用用于Windows的 GraphPad Prism 4通过数据分析由量效曲线得到配体的效价(potency) (EC₅₀)。

1对¹²⁵I-TSH结合的作用。将稳定表达TSHRs的HEK-EM293细 胞接种于24孔板并生长为毗邻合生(near confluency)。通过在室温下 于0.25ml含有60,000cpm牛¹²⁵I-TSH——其不含或含有xxμM1—— 的结合缓冲液(含有2.5％奶粉和0.2％BSA的HBSS)中培养2小时 测定细胞表面结合；在1.8μM未标记牛TSH的存在下测定非特异性 结合。用0.5ml冰冷HBSS清洗细胞3次并用0.5ml 0.4N NaOH裂解， 且在伽马计数器中计算细胞相关的放射性。

定量RT-PCR。使用Applied Biosystems引物和探针测定mRNA 水平。将定量RT-PCR结果标准化为GAPDH以纠正RNA输入差异。

统计分析。数据表示为平均值±SE。通过Students’t-测试或单因 素方差分析(One-Way Anova)分析数据；认为P＜0.05是显著的。

鉴于公开的试剂和方法的原则可适用的许多可能的实施方案，应 了解所示例的实施方案仅仅是优选实施例且不应用于限制本发明的范 围。