检测艾滋病相关支原体的引物、探针组合及试剂盒

摘要

本发明通过对艾滋病相关支原体（穿透支原体、发酵支原体和梨支原体）基因序列分析和比对，提供了适于同时检测这3种艾滋病相关支原体的三重荧光PCR检测的引物和探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-9所示，本发明还提供了对艾滋病相关支原体进行检测的方法和检测试剂盒。本发明的检测试剂盒及检测试剂具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，具有良好的检测能力。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用于检测艾滋病相关 支原体的荧光定量PCR引物和探针及试剂盒。艾滋病相关支原体分 别为穿透支原体（Mycoplasma penetrans）、发酵支原体（Mycoplasma  fermentans）和梨支原体（Mycoplasma pirum）。

背景技术

艾滋病相关支原体通常指穿透支原体（Mycoplasma penetrans）、 发酵支原体（Mycoplasma fermentans）和梨支原体（Mycoplasma  pirum）。这三种支原体在HIV感染及AIDS的发展过程中起着辅助 因子或者促进因子的作用，与艾滋病的发病具有显著的相关性，因 此称为艾滋病相关支原体（参考文献：Montagnier L,Blanchard A. Mycoplasmas as co-factors in infection due to the human  immunodeficiency virus[J].Clin infect Dis,1993,17:5309.）。如果诊断出 艾滋病患者带有穿透支原体、发酵支原体和梨支原体，在现有的治 疗方案上进行针对性治疗，就能够减少感染机会，也就可以在一定 程度上延长患者的生命。

目前国内临床对于上述3种支原体的诊断技术十分有限，造成 部分携带艾滋病相关支原体的患者不能及时有效诊断和治疗，加重 了艾滋病病毒对机体免疫抑制，增大了机会感染其他病原，严重威 胁艾滋病患者生命。及时有效诊断艾滋病感染者是否感染上述3种 艾滋病相关支原体对于艾滋病的辅助治疗十分有效，但常规的病原 体分离培养方法较难实施。这是因为艾滋病相关支原体的生长速度 缓慢，分离培养困难，既增加了诊断成本，又延误了确诊时机，因 此临床上不使用分离培养作为检测手段。目前，国内外尚无成熟的 艾滋病相关支原体血清学检测试剂盒。

尽管临床对艾滋病相关支原体在艾滋病发展进程中的作用及其 临床检测技术越来越重视，但是目前已报道的PCR检测技术主要为普 通PCR技术。国内对于艾滋病相关支原体检测主要依靠PCR方法（参 考文献：糜祖煌,赵季文,秦玲.淋病患者AIDS相关支原体的分离培养与 核酸检测[J].中国人兽共患病杂志，2003，19(3):79-81.贾成梅,施素洁, 羊海涛,等.从艾滋病患者和HIV感染者中分离2株支原体[J].中国人兽 共患病杂志,2003,19(6):77-79.）。PCR检测灵敏度一般，且对于3种支 原体分别进行检测和电泳判读结果耗时费力，极大的增加了临床检测 工作量和检测成本，降低了检测效率。因此，急需建立一种快速、灵 敏、特异的检测技术来提高临床对艾滋病相关支原体的检测能力。

发明内容

本发明的目的在于一种能同时检测3种检测艾滋病相关支原体 的试剂盒和诊断试剂，以克服上述不足。

本发明首先提供一种用于同时检测艾滋病相关支原体的三重荧 光PCR引物组合，所述艾滋病相关支原体分别为穿透支原体 （Mycoplasma penetrans）、发酵支原体（Mycoplasma fermentans）和 梨支原体（Mycoplasma pirum）。

本发明通过对NCBI数据库中报道的穿透支原体的ftsZ基因、发酵 支原体的ftsZ基因和梨支原体的rpoB基因中保守区域使用Beacon  Desinger7软件设计探针和引物。探针类型均为TaqMan探针，其中穿 透支原体探针5’标记荧光基团FAM，3’标记淬灭基团BHQ1；发酵支 原体探针5’标记荧光基团HEX，3’标记淬灭基团BHQ1；梨支原体探 针5’标记荧光基团ROX，3’标记淬灭基团BHQ2。

进一步地，本发明提供的引物组合中，检测穿透支原体的引物 序列为：

Mpen-F:ACGTGAGTTAACCATGTA（SEQ ID NO.1）

Mpen-R:GGTTCGTCTTCTATCTAATAG（SEQ ID NO.2）；

检测发酵支原体的引物序列为：

Mfer-F:TGCTGTTTCAATGTCATC（SEQ ID NO.3）

Mfer-R:AGACCGAGCTATTAAAGC（SEQ ID NO.4）；

检测梨支原体的引物序列为：

Mpi-F:CGTGATTTCTTTAATACTCATC（SEQ ID NO.5）

Mpi-R:CACGAATATCCAAGTTAGG（SEQ ID NO.6）。

本发明提供了与上述引物组合配合使用的荧光探针组合，其中 与穿透支原体的引物配合使用的探针核苷酸序列为：

Mpen-P:FAM-TTACCAGCACCACCAATACCAATAAT-BHQ1 （SEQ ID NO.7）

与发酵支原体的引物配合使用的探针核苷酸序列为：

Mfer-P:HEX-TTGATGATGCTTTAATGACTCCACTTT-BHQ1 （SEQ ID NO.8）

与穿透支原体的引物配合使用的探针核苷酸序列为：

Mpi-P:ROX-CCAGGTCCCATTGCTGAAATTCT-BHQ2（SEQ  ID NO.9）。

本发明还提供了上述引物组合和荧光探针组合在制备艾滋病相 关支原体的检测试剂盒或诊断试剂中的应用。

具体地，上述应用是将Platium quantitative PCR super Mix UDG 12.5μl，50mM MgCl₂ 2.0μl；Platium Taq0.25μl；dNTP混合溶液 1.0μl；Mfer-F和Mfer-R各0.8μl；Mfer-P0.4μl；Mpen-F和 Mpen-R各0.5μl；Mpen-P0.2μl；Mpi-F和Mpi-F各0.3μl；Mpi-P 0.1μl，无核酸酶水0.35μl；待测样品DNA模板5.0μl构成25μl 的检测反应体系；上述引物和探针浓度均为25μM。

具体地，上述应用中，试剂盒的工作条件为95℃预变性3min， 1个循环；95℃变性15s，57℃-60℃退火15s，40个循环；然后终止 反应。

优选地，试剂盒的工作条件中退火温度为59℃。

本发明提供一种艾滋病相关支原体的诊断试剂，含有SEQ ID  NO.1-6所示的引物组合和SEQ ID NO.7-9所示的荧光探针组合；所 述艾滋病相关支原体为穿透支原体（Mycoplasma penetrans）、发酵 支原体（Mycoplasma fermentans）和梨支原体（Mycoplasma pirum）。

本发明还提供一种艾滋病相关支原体的检测试剂盒，含有SEQ  ID NO.1-6所示的引物组合和SEQ ID NO.7-9所示的荧光探针组合； 所述艾滋病相关支原体为穿透支原体（Mycoplasma penetrans）、发 酵支原体（Mycoplasma fermentans）和梨支原体（Mycoplasma pirum）。

本发明提供的试剂盒，还包括荧光定量反应液，阴性模板和阳 性模板，所述阴性模板为无核酸酶水，所述阳性模板为艾滋病相关 支原体穿透支原体、发酵支原体和梨支原体基因组DNA。

进一步地，所述的试剂盒中，其25μl的检测反应体系的具体 配置为：Platium quantitative PCR super Mix UDG12.5μl，50mM  MgCl₂ 2.0μl；Platium Taq0.25μl；dNTP混合溶液1.0μl；Mfer-F 和Mfer-R各0.8μl；Mfer-P0.4μl；Mpen-F和Mpen-R各0.5μl； Mpen-P0.2μl；Mpi-F和Mpi-F各0.3μl；Mpi-P0.1μl，无核酸酶 水0.35μl；待测样品DNA模板5.0μl；上述引物和探针浓度均为 25μM。

进一步地，所述试剂盒的工作条件为95℃预变性3min，1个循 环；95℃变性15s，57℃-60℃退火15s，40个循环。

本发明提供的同时检测3种艾滋病相关支原体的试剂盒是以三 重荧光PCR方法为基础进行检测的，包括以样品总DNA为模板， 利用本发明提供的引物和探针进行实时荧光定量PCR，同时设立阴 性对照和阳性对照，根据扩增曲线的Ct值判定结果。

本发明试剂盒每次检测标本时必须设立NEG对照（阴性对照）和 POS对照（阳性对照），两种对照对于结果判读起决定性作用：

有效扩增：NEG（－）和POS（+）

无效扩增：NEG（+）和POS（+）提示体系污染

无效扩增：NEG（－）和POS（－）提示体系错误或者试剂失效。

在对照有效扩增的情况下，样品检测结果可信，否则试验需要重 复；在检测中两种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：

Ct值小于等于36的标本为阳性结果；

Ct值大于38的标本为阴性结果；

Ct值在36-38之间的标本需要重复，重复试验如Ct值依然低于38 判定为阳性扩增，超过38判定为阴性扩增。

本发明试剂盒采用的实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预 变性3min，1个循环；95℃变性15s，57℃-60℃退火15s，40个循 环。

本发明在实施例5对试剂盒的检测灵敏度进行了比较：实验发 现本发明试剂盒检测的灵敏度与普通PCR检测方法检测灵敏度高 10-100倍。

本发明针对三种艾滋病相关支原体的基因中保守区域设计多重 特异性探针和引物。通过实验室条件优化，建立了单个反应可同时 检测这三种病原的简便、准确、快速的方法以及以该方法为基础构 建的灵敏度高、特异性强的检测试剂盒，简化了现有检测三种病原 支原体2/3以上的检测工作量，并缩短检测时间1小时左右。本发 明提供的检测三种艾滋病相关支原体的试剂盒对于穿透支原体的检 测灵敏度为10³拷贝，高于普通PCR 10倍；发酵支原体的检测灵敏 度为10³拷贝，高于普通PCR 10倍；梨支原体的检测灵敏度为10²拷贝，高于普通PCR 100倍。且本发明试剂盒对临床常见21种病原 体以及人类染色体均无非特异扩增，显示出良好的特异度。

附图说明

图1为穿透支原体单重荧光PCR退火温度优化结果图，其中59 ℃为最优退火温度。

图2为发酵支原体单重荧光PCR退火温度优化结果图，其中59 ℃为最优退火温度。

图3为梨支原体单重荧光PCR退火温度优化结果图，其中57 ℃为最优退火温度。

图4为穿透支原体荧光PCR检测体系的对数标准曲线。

图5为发酵支原体荧光PCR检测体系的对数标准曲线。

图6为梨支原体荧光PCR检测体系的对数标准曲线。

图7为本发明三重荧光定量PCR检测方法对三种艾滋病相关支 原体的检测灵敏度评价结果图，其中图7a为穿透支原体灵敏度结果， 图7b为发酵支原体灵敏度结果，图7c为梨支原体灵敏度结果。其 中1：10⁸拷贝阳性质粒，2：10⁷拷贝阳性质粒，3：10⁶拷贝阳性质 粒，4：10⁵拷贝阳性质粒，5：10⁴拷贝阳性质粒，6：10³拷贝阳性 质粒，7：10²拷贝阳性质粒，8：10拷贝阳性质粒，9：阴性对照。

图8为普通PCR方法对三种支原体检测灵敏度结果，其中图8a 为穿透支原体结果，图8b为发酵支原体结果，图8c为梨支原体结 果；其中M：Marker，1：阴性对照，2：10⁸拷贝阳性质粒，3：10⁷拷贝阳性质粒，4：10⁶拷贝阳性质粒，5：10⁵拷贝阳性质粒，6：10⁴拷贝阳性质粒，7：10³拷贝阳性质粒，8：10²拷贝阳性质粒，9：10 拷贝阳性质粒。

图9为本发明对艾滋病相关支原体混合感染模拟标本检测结果 图，其中图9a为穿透支原体和发酵支原体双重感染检测结果，图9b 为穿透支原体和梨支原体双重感染检测结果，图9c为发酵支原体和 梨支原体双重感染检测结果，图9d为穿透支原体、发酵支原体和梨 支原体三重混合感染检测结果；其中1：穿透支原体，2：发酵支原 体，3：梨支原体，4：阴性对照。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明 的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步 骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所 熟知的常规手段。

实施例1三重荧光PCR引物和探针的设计

通过对NCBI数据库中报道的穿透支原体的ftsZ基因、发酵支 原体的ftsZ基因和梨支原体的rpoB基因中保守区域使用Beacon  Desinger7软件设计探针和引物。探针类型均为TaqMan探针，其中 穿透支原体探针5’标记荧光基团FAM，3’标记淬灭基团BHQ1；发 酵支原体探针5’标记荧光基团HEX，3’标记淬灭基团BHQ1；梨支 原体探针5’标记荧光基团ROX，3’标记淬灭基团BHQ2。

检测穿透支原体的引物序列为：

Mpen-F:ACGTGAGTTAACCATGTA（SEQ ID NO.1）

Mpen-R:GGTTCGTCTTCTATCTAATAG（SEQ ID NO.2）；

检测发酵支原体的引物序列为：

Mfer-F:TGCTGTTTCAATGTCATC（SEQ ID NO.3）

Mfer-R:AGACCGAGCTATTAAAGC（SEQ ID NO.4）；

检测梨支原体的引物序列为：

Mpi-F:CGTGATTTCTTTAATACTCATC（SEQ ID NO.5）

Mpi-R:CACGAATATCCAAGTTAGG（SEQ ID NO.6）。

本发明提供了与上述引物组合配合使用的荧光探针组合，其中 与穿透支原体的引物配合使用的探针核苷酸序列为：

Mpen-P:FAM-TTACCAGCACCACCAATACCAATAAT-BHQ1 （SEQ ID NO.7）

与发酵支原体的引物配合使用的探针核苷酸序列为：

Mfer-P:HEX-TTGGATGATGCTTTAATGACTCCACTTT-BHQ1 （SEQ ID NO.8）

与穿透支原体的引物配合使用的探针核苷酸序列为：

Mpi-P:ROX-CCAGGTCCCATTGCTGAAATTCT-BHQ2（SEQ  ID NO.9）。

实施例2三重荧光定量PCR退火温度的优化

本发明分别对穿透支原体（Mycoplasma penetrans）ATCC55252、 发酵支原体（Mycoplasma fermentans）ATCC19989和梨支原体 （Mycoplasma pirum）ATCC25960进行单重荧光PCR检测（图1～3）， 并改变退火温度，选择最优化的多重体系退火温度。检测发现，穿 透支原体和发酵支原体最优反应退火温度为59℃，梨支原体的最优 退火温度为57℃，在此温度下体系扩增效果最好。综合考虑上述因 素将三重荧光定量PCR体系检测的退火温度范围设定为57℃～60 ℃。

实施例3三重荧光定量PCR扩增体系和扩增条件

实时荧光定量PCR扩增体系为：

扩增条件：

95℃            3min

实施例4体系标准曲线的制作

以标准浓度模板的lg值为横坐标，以相应的Ct值为纵坐标，建 立体系对3种支原体的检测标准曲线。三种阳性质粒依次使用浓度 2.0拷贝/μl~2.0×10⁷拷贝/μl的标准品各5ul扩增，模板量为10~10⁸拷贝。使用已优化的三重荧光PCR分别对10~10⁸拷贝的穿透支原体、 发酵支原体和梨支原体模板扩增，检测体系建立标准曲线（图4~6） 和灵敏度结果见图7。

本发明建立的三重荧光PCR体系对穿透支原体（FAM荧光）检 测灵敏度为10³拷贝，扩增效率=87.3%，R²=0.996，说明对于10³~10⁸拷贝穿透支原体DNA，该体系有良好线性扩增。

本发明建立的三重荧光PCR体系对发酵支原体（HEX荧光）检 测灵敏度为10³拷贝，扩增效率=92.9%，R²=0.961，说明对于10³~10⁸拷贝发酵支原体DNA，该体系有良好线性扩增。

本发明建立的三重荧光PCR体系对梨支原体（ROX荧光）检测 灵敏度为10²拷贝，扩增效率=94.4%，R²=0.995，说明对于10²~10⁸拷贝梨支原体DNA，该体系有良好线性扩增。

实施例5三重荧光PCR检测体系的特异度评价

用本发明优化了的三重荧光PCR方法检测常见21种病原菌及 人类染色体(表1)，分别以艾滋病相关支原体穿透支原体、发酵支原 体和梨支原体DNA为阳性对照。结果除阳性对照外，其余21种非 艾滋病相关病原菌模板均为阴性。

表1用于检测艾滋病相关支原体的三重荧光PCR体系特异性模板

ATCC,美国模式培养物集存库

实施例6本发明检测艾滋病相关支原体的三重荧光PCR方法与普 通PCR方法的对比试验

三种支原体（穿透支原体、发酵支原体和梨支原体）阳性质粒 依次配制为浓度2.0拷贝/μl~2.0×10⁷拷贝/μl的标准品各5μl扩增， 模板量为10~10⁸拷贝。分别使用普通PCR方法对10~10⁸拷贝的穿 透支原体、发酵支原体和梨支原体DNA模板扩增。穿透支原体普通 PCR扩增用引物为：Mpe-A: 5’-CCCGGATCCTTGGTTCGTCTTCTATCTAATAGAGA-3’和 Mpe-S:5’-CCCCTCGAGTTATTTATTTCTTCTAAAAATTCTATCAA- 3’;发酵支原体普通PCR扩增用引物为：Mfe-A: 5’-CCCGGATCCATGGACTTAAATGCTGAAGATTTGGAA-3’和 Mfe-S:5’-CCCCTCGAGTTAATGATTTTCATCAAAGAAATTTGGC-3 ’;梨支原体普通PCR扩增用引物为：Mpi-A: 5’-CCCGGATCCGTGAACATCACGAATATCCAAG-3’和 Mpi-S:5’-CCCCTCGAGTTAATTAATGAACTTTTATATAGCAGAA-3 ’。普通PCR反应体系：5μl5×Primer STAR buffer;2μl dNTP;上下游 引物各0.5μl；0.25μl Prime STAR^TM HS DNA Polymerase；11.75μl去 核酸酶水；5μl DNA模板。反应条件：94℃5min，然后94℃10s， 55℃15s，72℃1min，共30个循环。使用1.5%琼脂糖凝胶电泳查看 PCR扩增结果，扩增产物大小分别为1431bp、1149bp和354bp。结 果显示普通PCR对三种支原体检测灵敏度均为10⁴拷贝（图8）。本 发明的三重荧光定量PCR方法检测三种支原体的灵敏度结果参见实 施例4和图7。由此可见，本发明提供的优化的三重荧光PCR检测 方法对穿透支原体和发酵支原体检测灵敏度比普通PCR高约10倍， 对梨支原体检测灵敏度比普通PCR高约100倍。说明本发明检测方 法较现有技术具有高于10-100倍的灵敏度。

实施例7检测艾滋病相关支原体试剂盒的组装与应用

将本发明实施例1设计的3对引物和相应配套的探针组合以及 荧光定量PCR使用的酶、Buffer、dNTPs、去核酸水、三种支原体 （穿透支原体、发酵支原体和梨支原体）DNA的阳性对照等试剂进 行组装，构建检测同时检测艾滋病相关支原体（穿透支原体、发酵 支原体和梨支原体）的试剂盒。试剂盒工作体系和工作条件参照实 施例3进行。

实施例8试剂盒用于单一感染及混合感染模拟临床标本的检测

使用本发明实施例7的试剂盒对临床模拟标本进行了检测。模 拟标本成分以及标本处理过程与临床标本存在高度一致性，因此在 本领域，某些特殊情况导致的临床标本收集困难时，模拟标本可有 效进行验证。本发明收集了50名健康临床志愿者的泌尿生殖道拭子 标本，随机分成A、B、C、D、E五组，每组10个标本。A组拭子 标本在实验室内添加10³拷贝的穿透支原体作为单一感染模拟标本； B组拭子标本在实验室内添加10³拷贝的发酵支原体作为单一感染 模拟标本；C组拭子标本在实验室内添加10²拷贝的梨支原体作为单 一感染模拟标本；D组拭子标本为混合感染模拟标本，其中D1和 D2标本在实验室内添加10³拷贝的穿透支原体和10³拷贝的发酵支 原体作为双重感染标本，D3和D4标本在实验室内添加10³拷贝的 穿透支原体和10²拷贝的梨支原体作为双重感染标本，D5和D6标 本在实验室内添加10³拷贝的发酵支原体和10²拷贝的梨支原体作为 双重感染标本，D7-10标本在实验室内添加10³拷贝的穿透支原体、 10³拷贝的发酵支原体和10²拷贝的梨支原体作为三重感染标本；E 组拭子标本不添加任何病原作为阴性对照标本。通过常规的DNA提 取方法，使用本试剂盒对五组标本分别进行检测。结果显示，A组 标本穿透支原体检测阳性率均为100%，未检出发酵支原体和梨支原 体，特异度为100%；B组标本发酵支原体检测阳性率均为100%， 未检出穿透支原体和梨支原体，特异度为100%；C组标本梨支原体 检测阳性率均为100%，未检出穿透支原体和发酵支原体，特异度为 100%；D组混合感染标本中，D1和D2标本可检测穿透支原体和发 酵支原体，未检测到梨支原体，检测灵敏度达到预期效果，特异度 良好（图9a），D3和D4标本可检测穿透支原体和梨支原体，未检 测到发酵支原体，检测灵敏度达到预期效果，特异度良好（图9b）， D5和D6标本可检测发酵支原体和梨支原体，未检测到穿透支原体， 检测灵敏度达到预期效果，特异度良好（图9c），D7-10组标本对三 种艾滋病相关支原体均可检测，检测灵敏度达到预期效果（图9d）； E组阴性标本中未检出任何艾滋病相关支原体，特异度为100%。说 明本试剂盒适用于临床标本检测，且达到了预期检测灵敏度和特异 度，对两种或者三种艾滋病相关支原体混合感染均有很好的检测能 力。