上皮型钙黏蛋白表达基因CDH1 pre-mRNA选择性剪接检测试剂盒及其用途

摘要

本发明涉及

说明书

技术领域

本发明涉及一种CDH1基因pre-mRNA选择性剪接检测试剂盒，特别涉及其在东亚胃癌高发人群的mRNA 表达分析与后果评估。

背景技术

CDH1 基因位于人类染色体16q22. 1，正常转录的mRNA产物长度为4875bp, 包含16个外显子，编码包含882氨基酸的上皮型钙黏蛋白（E-cadherin）。CDH1基因所编码的钙粘蛋白是一种Ca⁺⁺依赖性的上皮细胞间的粘附分子，其表达量的下调预示着人类肿瘤的强侵袭性和不良预后，这在胃癌中表现得尤为明显。已经知道，基因转录的pre-mRNA通过剪接过程得到成熟的mRNA，剪接识别信号的异常活化或者沉默，将干扰正常的剪接过程，形成长度和构成异常的mRNA，这些异常的mRNA可能由于无义介导的缺失而降解，或者编码截短型的蛋白质，干扰全长E-cadherin的功能。因此，剪接体异常在胃癌形成中具有重要作用。但是目前尚缺乏检测CDH1基因剪接体异常的系统方法。因此有必要开发一种方便快捷的CDH1基因pre-mRNA选择性剪接检测方法，以用于胃癌的病因学分析及患者预后评判。

发明内容

本发明的目的是提供一种CDH1基因pre-mRNA选择性剪接检测试剂盒及其应用。

本检测试剂盒主要包括以下成分：

(1) CDH1基因cDNA PCR扩增与测序引物7对，各对引物序列见表1；

（2）逆转录酶， PCR扩增试剂，如dNTP、Ex Taq Hot Start 聚合酶等。

                                                 

 本试剂盒扩增出的PCR产物可以采用以下方式进行mRNA表达检测：将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带位置进行分析，并对于电泳条带纯化后测序分析。

试剂盒中，还可以有琼脂糖凝胶、DNA纯化试剂等。

本发明所说的试剂盒用于检测CDH1基因pre-mRNA选择性剪接产物。

本试剂盒的检测选择性剪接步骤包括：

（1）    提取样本外周血或组织RNA。 

（2）    RNA逆转录。

（3） CDH1基因cDNA PCR扩增。

在7个重叠区域扩增CDH1基因编码区，分别是5’UTR–外显子3、外显子4–6、外显子5–8、外显子7-10、外显子10–13、外显子12-15及外显子14–3‘UTR。引物如表1所示。反应体系为20μl ：TaKaRa Ex Taq HS 聚合酶0.2ml、10×EX Taq buffer 2ml、dNTP Mixture（2.5mM each）2ml、上游引物（10μM）1μl、下游引物（10μM）1μl、cDNA 1.5μl 、ddH₂O 12.3ml。反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30sec，60℃左右（相应退火温度）复性30sec，72℃延伸30sec，40个循环；再72℃延伸10min，4℃保存。

（4）将PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB分辨条带，通过条带差异区分野生型或外显子跳跃型。条带经切胶纯化测序鉴定。 

本试剂盒具有高效的选择性剪接检测作用。实施实例1中报道，对于胃癌患者，针对CDH1基因外显子7-10区域，采用试剂盒的功能评估方法提出，除了正常剪接的mRNA产物，还存在CDH1外显子9跳跃及外显子8处83bp缺失的选择性剪接产物，对于胃癌形成可能具有病因学意义。实施实例2中报道，针对CDH1基因外显子5的突变c.604G>A(V202I)开展RNA层面的功能后果评估，采用试剂盒的评估方法提出该突变未引起外显子跳跃，可能对胃癌形成不具有病因学意义。本试剂盒在胃癌患者选择性剪接与突变的病因学意义评估上具有重要作用。

附图说明

图1是胃癌患者T278瘤组织（T）及癌旁正常组织（N） RT-PCR图：图示CDH1基因外显子7-10的扩增条带。M为分子量标记。

图2 是图1中截短条带1的测序图：图示CDH1基因外显子8缺失后段83bp的序列。

图3 是图1中截短条带2的测序图：图示CDH1基因外显子9跳跃的序列。

图4是CDH1基因外显子5区域c.604G>A(V202I)突变携带者G150胃癌组织（T）及癌旁组织（N）RNA的RT-PCR图：图示CDH1基因外显子4-6的扩增条带。M为分子量标记，WT为非突变携带胃癌患者。

具体实施方式

实施例1 ：中国胃癌患者CDH1基因外显子9及其周边区域pre-mRNA剪接的分析

针对CDH1基因外显子9检出突变的中国胃癌患者，分析突变对pre-mRNA剪接的影响。 患者为：T278，携带CDH1 c.1296 C>G (N432K)突变。提取患者瘤组织及癌旁正常组织RNA，逆转录为cDNA，选择表1中第4对引物（F:5'-GGACCGAGAGAGTTTCCCTACG-3' ，R: 5’-GTTATTTTCTGTTCCATAAATG-3’）扩增CDH1基因外显子7-10区域。反应体系为20ml：TaKaRa Ex Taq HS 聚合酶0.2ml、10×EX Taq buffer 2ml、dNTP Mixture（2.5mM each）2ml、上游引物（10μM）1μl、下游引物（10μM）1μl、cDNA 1.5μl 、ddH₂O 12.3ml。反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30sec，53℃复性30sec，72℃延伸30sec，40个循环；再72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB分辨条带，观察条带位置，判别扩增产物长度。图1为CDH1基因外显子7-10的PCR扩增图，由图1可见，患者癌旁组织除了扩增出567bp的正常长度的mRNA产物，还存在明显的缩短约80bp的截短条带1，而患者瘤组织只扩增出弱的正常长度的条带，以及弱的截短条带1，却在接近400bp处显示强的截短条带2。条带经切胶纯化，采用BigDye Terminator V3.1试剂盒，在ABI 3130基因分析仪（美国ABI公司）上测序，显示截短条带1为CDH1基因外显子8后段83bp缺失的484bp的选择性剪接产物（图2），序列如SEQ ID NO.15所示，将形成编码358个氨基酸的截短蛋白；而截短条带2为CDH1基因外显子9完整跳跃的384bp的剪接产物（图3），序列如SEQ ID NO.16所示，将形成丢失外显子9区域61个氨基酸的编码821个氨基酸的截短蛋白。该患者组织中CDH1基因pre-mRNA异常剪接的表达产物，将形成异常的上皮型钙黏蛋白，进而影响其功能作用，从而可能是患者肿瘤形成的原因。而CDH1 c.1296 C>G (N432K)突变对于异常的pre-mRNA剪接具有作用，为病理性突变。

 实施例2 ：中国胃癌患者CDH1基因外显子5区域c.604G>A(V202I)突变对于pre-mRNA剪接的影响分析

针对CDH1基因外显子5区域检出突变的中国胃癌患者，分析突变对pre-mRNA剪接的影响。 患者为：患者G150，携带CDH1 c.604G>A(V202I)突变。并选取不带突变的胃癌患者作为对照。提取患者组织RNA，逆转录为cDNA，选择表1中第2对引物（F:5'- GCCTCCGTTTCTGGAATCCAAG-3' ，R: 5'-CTGGAAGAGCACCTTCCATGAC-3'）扩增CDH1基因外显子4-6区域。反应体系为20μl ：TaKaRa Ex Taq HS 聚合酶0.2ml、10×EX Taq buffer 2ml、dNTP Mixture（2.5mM each）2ml、上游引物（10μM）1μl、下游引物（10μM）1μl、cDNA 1.5μl 、ddH₂O 12.3ml。反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30sec，55℃复性30sec，72℃延伸30sec，40个循环；再72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB分辨条带，观察条带位置，判别扩增产物长度。图4为CDH1基因外显子4-6区域的PCR扩增图，由图4可见，患者G150及对照患者均扩增出正常长度（445bp）的条带，显示该条带为CDH1基因正常剪接产物。该突变在RNA层面未影响CDH1基因功能。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  南京大学

 

<120>  上皮型钙黏蛋白表达基因CDH1 pre-mRNA选择性剪接检测试剂盒及其用途

 

<130> 

 

<160>  16   

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

gaactgcaaa gcacctgtga gc                                              22

 

 

<210>  2

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

gactgtaatc acaccatctg tg                                              22

 

 

<210>  3

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

gcctccgttt ctggaatcca ag                                              22

 

 

<210>  4

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

ctggaagagc accttccatg ac                                              22

 

 

<210>  5

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

gagaacgcat tgccacatac ac                                              22

 

 

<210>  6

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

gtgtcagtga ctgtgatcac ag                                              22

 

 

<210>  7

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  7

ggaccgagag agtttcccta cg                                              22

 

 

<210>  8

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  8

gttattttct gttccataaa tg                                              22

 

 

<210>  9

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  9

catttatgga acagaaaata ac                                              22

 

 

<210>  10

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  10

cttcaaaatg atagattctt ggg                                             23

 

 

<210>  11

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  11

ggaccattca gtacaacgac cc                                              22

 

 

<210>  12

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  12

cgtcgttacg agtcacttca gg                                              22

 

 

<210>  13

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  13

ctatgatgaa gaaggaggcg gag                                             23

 

 

<210>  14

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  14

cgtgatttct gcatttccca gcac                                            24

 

 

<210>  15

<211>  484

<212>  DNA

<213>  人

 

<400>  15

ggaccgagag agtttcccta cgtataccct ggtggttcaa gctgctgacc ttcaagtaca     60

 

agggtcaggt gcctgagaac gaggctaacg tcgtaatcac cacactgaaa gtgactgatg    120

 

ctgatgcccc caatacccca gcgtgggagg ctgtatacac catattgaat gatgatggtg    180

 

gacaatttgt cgtcaccaca aatccagtga acaacgatgg cattttgaaa acagcaaagg    240

 

gcttggattt tgaggccaag cagcagtaca ttctacacgt agcagtgacg aatgtggtac    300

 

cttttgaggt ctctctcacc acctccacag ccaccgtcac cgtggatgtg ctggatgtga    360

 

atgaagcccc catctttgtg cctcctgaaa agagagtgga agtgtccgag gactttggcg    420

 

tgggccagga aatcacatcc tacactgccc aggagccaga cacatttatg gaacagaaaa    480

 

taac                                                                 484

 

 

<210>  16

<211>  384

<212>  DNA

<213>  人

 

<400>  16

ggaccgagag agtttcccta cgtataccct ggtggttcaa gctgctgacc ttcaaggtga     60

 

ggggttaagc acaacagcaa cagctgtgat cacagtcact gacaccaacg ataatcctcc    120

 

gatcttcaat cccaccacgg gcttggattt tgaggccaag cagcagtaca ttctacacgt    180

 

agcagtgacg aatgtggtac cttttgaggt ctctctcacc acctccacag ccaccgtcac    240

 

cgtggatgtg ctggatgtga atgaagcccc catctttgtg cctcctgaaa agagagtgga    300

 

agtgtccgag gactttggcg tgggccagga aatcacatcc tacactgccc aggagccaga    360

 

cacatttatg gaacagaaaa taac                                           384