利用量子点提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法

摘要

本发明涉及生物工程领域，公开了一种提高丹参毛状根中丹参酮的含量的方法，将CdSe量子点加入丹参毛状根培养基或培养液中，培养12～48小时；所述的CdSe量子点在丹参毛状根培养基或培养液中的含量为50～200μg/L。本发明是使用量子点作为一种诱导剂刺激丹参毛状根的次生代谢产物的生产，在短时间内显著提高收获毛状根时的有效成分含量。本方法作用稳定，效果明显，同时对毛状根的生长影响小于其他诱导子，可以在实际生产中发挥重要的作用。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种利用特定粒径和种类的量子点处理丹参毛状根来提高丹参毛状根中总丹参酮的含量的方法。 

背景技术

丹参始载于《神农本草经》，为我国传统名贵中药材,具有祛瘀止痛、活血调经、养心除烦等功效。丹参主要成分包括脂溶性的二萜醌类化合物(丹参酮类成分)和水溶性的酚酸类化合物，二者均具有较强的药理活性，其中丹参酮类物质具有抗肿瘤，抗菌消炎，抗氧化，抗动脉粥样硬化等多种药理活性，因此具有巨大的市场需求。丹参酮的结构复杂导致其化学合成过程繁琐、成本较高且易造成环境污染，因此丹参酮的传统生产都是采用生物提取的方式。但是丹参为多年生草本植物,有生长周期较长，药用活性成分含量低等缺点。巨大的市场需求使得丹参野生资源日益减少，而传统的栽培模式也面临着丹参品质退化严重及品种选育成本过高等诸多弊端，因此如何满足丹参酮的市场需求成为目前研究的热点。 

毛状根培养是20世纪80年代发展起来的基因工程和细胞工程相结合的一项技术，它是将发根农杆菌的Ri质粒中含有的T-DNA整合到植物细胞的DNA上，诱导植物细胞产生毛状根。毛状根培养相对于细胞培养具有遗传和生物化学方面的稳定性，毛状根可以在不含激素的培养基上快速生长并可以大量积累经济价值较高的次生代谢产物．因此，毛状根被认为是极好的获得植物次生代谢产物的原材料。近年来毛状根培养被认为是获得有用次生代谢产物的重要途径。如何在培养过程中提高毛状根中有用次生代谢产物的积累能力成为人们关注的焦点。1996年，黄炼栋等完成了丹参毛状根再生体系的建立，并在毛状根中检测到了丹参酮类活性物质，但总体上丹参毛状根中丹参酮有效成分依然处在较低的水准，无法应用于实际生产。 

植物的次生代谢主要用于应对不利的外界环境，因此添加诱导物质是常用的提高植物次生代谢产物的方法，其中重金属离子是一种较常用的诱导剂，可以胁迫丹参毛状根产生更多的丹参酮类物质，但是研究发现，重金属离子如Cd等在提高丹参毛状根中丹参酮含量的同时也对丹参毛状根的生长产生了非常不利的影响。因此我们首先将重金属离子制备成粒径更大的量子点，这种量子点加入到毛状根培养基中后可以更加明显的提高丹参毛状根中丹参酮的含量，同时对毛状根的生长影响很小，是一种在实际生产中更为合适的诱导剂。目前对各种文献和专利进行检索尚未发现有类似的报道。因此，本发明是一种实际解决丹参酮药源紧缺性的新方法。 

发明内容

本发明的目的在于克服常规技术中的不足，提供一种有效提高丹参毛状根丹参酮含量的方法。 

本发明将CdSe量子点应用于提高丹参毛状根中丹参酮的含量，可以提高丹参酮总量，或者提高二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮TI和丹参酮ⅡA中的至少一种的含量。 

本发明是通过以下技术方案实现的，一种利用量子点提高毛状根中丹参酮的含量的方法，包括如下步骤：将CdSe量子点加入丹参毛状根培养基或培养液中，培养12～48小时，优选的培养时间为24～48小时； 

所述的CdSe量子点在丹参毛状根培养基或培养液中的含量为50～200μg/L，优选为90～120μg/L。 

优选的，所述CdSe量子点的粒径为1～3nm；更优选的，CdSe量子点的平均粒径为2nm。 

所述CdSe量子点在回流条件下水相合成，具体制备方法包括如下步骤： 

（1）将pH=9～10、含有巯基丙酸的可溶性镉盐溶液除去空气后加入硒氢化钠溶液；所述的可溶性镉盐优选为氯化镉或硝酸镉； 

混合后的反应体系中，镉元素、硒元素和巯基丙酸的含量分别为0.4～0.5mmol/L、0.4～0.5mmol/L和0.8～1μmol/L； 

硒氢化钠溶液的制备方法为：无氧水中加入液氮去除空气，加入摩尔比为1： 2.8～3.1的硒粉和硼氢化钠（优选为1：3），再加入液氮，0～6℃反应8～12小时； 

（2）98～100℃回流搅拌反应8～12小时，再用液氮速冻得到CdSe量子点。 

所述丹参毛状根的培养方法为： 

（1）丹参叶片外植体预培养后与农杆菌共培养1～3天；优选的，用含有pCAMBIAl304⁺质粒的发根农杆菌转化丹参叶片外植体； 

（2）在光照条件下继续2～3周长出毛状根，取毛状根继代培养脱菌继续培养。 

本发明的方法使用特定的种类和粒径的CdSe量子点作为诱导剂来刺激丹参毛状根，使其迅速产生更多的丹参酮，能在短时间内显著提高收获毛状根时的有效成分含量。同时对丹参毛状根的生长抑制小于其他的诱导子，有效地减轻了使用重金属离子时会产生的生长抑制，。该法简单易行，效果明显，为丹参毛状根商业化生产奠定坚实的基础，也为规模化生产具重要临床需求的丹参酮提供了一种新型优质药源，对缓解丹参酮药源的紧缺性起到积极的促进作用。 

附图说明

图1.CdSe量子点的透射电镜图。 

图2.CdSe量子点诱导丹参毛状根在不同时间的干重变化情况图。 

图3.CdSe量子点诱导丹参毛状根在不同时间的丹参酮含量变化图；柱状图从左至右依次为：DT-I-二氢丹参酮；CT-隐丹参酮；T-I-丹参酮Ⅰ；TIIA-丹参酮ⅡA；TT—总丹参酮；CdSeQDs—CdSe量子点；Control—空白对照。 

具体实施方式

下面结合具体实施例详细阐述本发明。应理解为：这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。 

实施例1  发根农杆菌介导pCAMBIAl304⁺质粒遗传转化丹参获得丹参毛状根。 

1.1．外植体的预培养 

剪取无菌丹参苗叶片(1-3cm)，接种到预培养培养基(1/2MS)上，25℃暗培养2d。 

1.2．农杆菌与外植体的共培养 

将上述经预培养的丹参叶片外植体，放入含活化好的上述发根农杆菌工程菌的1／2MS悬液中浸泡10分钟(轻轻摇晃使外植体与菌液充分接触)后，取出浸染后的丹参外植体用无菌吸水纸吸干表面菌液，转到共培养培养基1/2MS中，暗培养2d。 

1.3．毛状根的诱导和继代培养 

将上述的共培养2d的丹参外植体转接到除菌固体培养基(1/2MS+Cef 500mg／L)中，25℃ 16h/8h光照培养2-3周左右，可从外植体伤口处长出毛状根。剪下(大约1-3cm)的毛状根，接种于1/2MS+Cef 500mg/L培养基中暗培养3周。转入1/2MS+Cef250mg/L培养基中继代筛选，每2周继代培养一次。经过数次继代后即可完全脱菌。再将良好的丹参毛状根转入无抗生素的B5培养基上继续暗培养20d左右。取一段5cm左右的毛状根放入1/2MS液体培养基中100rpm、25℃黑暗下培养约40天待用。 

实施例2  CdSe量子点的制备及特征确定： 

（1）前体液硒氢化钠（NaHSe）的制备：取无氧水5ml加入试剂瓶内，加入液氮剧烈搅拌赶走空气，将8mg硒粉（0.10mmol）和11.4mg硼氢化钠（0.3mmol）放入瓶中，补加少许液氮，密封容器，在4℃下反应10小时。 

（2）回流条件下合成CdSe：取CdCl₂ 20.83mg（0.11mmol）放入250ml三颈瓶内，加入无氧水245ml，搅拌助溶后加入27.19ul MPA（巯基丙酸，0.21μmol），用10M和1MNaOH调节PH=9.5±0.2，加液氮剧烈搅拌排走空气后加入新制备的NaHSe溶液。磁力搅拌、100℃下回流10小时后取出样品液氮速冻得到CdSe量子点（CdSe QDs）。 

（3）用透射电镜扫描制备得到的量子点大致确定量子点粒径为2nm左右（结果如图1所示）。 

实施例3利用量子点诱导丹参毛状根 

取实施例2中制备好的CdSe量子点加入到实施例1中准备好的丹参毛状根培养液中，使CdSe量子点的终浓度为100μg/L，同时加入终浓度100μg/L的 CdCl₂和等量的无菌水作为对照。100rpm，25℃黑暗下培养0小时，12小时，24小时，48小时，96小时和7天后收取毛状根。 

实施例4测量毛状根在量子点诱导下的生长状况 

将实施例3中收获的毛状根放置在45℃烘箱中约2天，使其重量达到恒重，用托盘天平精确测量各个样品的干重，结果如图2所示：CdSe量子点处理丹参毛状根后毛状根的干重在7天后为水对照组干重的86.8%，而含有相同重金属浓度的CdCl₂对照组中毛状根的干重为水对照组的65.1%。 

本实施例证明了使用CdSe量子点做诱导剂可以有效的减轻重金属诱导子对毛状根的生长抑制。 

实施例5利用HPLC测定转基因丹参毛状根中丹参酮含量 

5.1.色谱条件 

色谱柱为C-18反相硅胶柱，流动相为乙腈：水（65：35），检测波长270nm，柱温30℃，流速1ml／min，进样量20μl。 

5.2.转基因毛状根丹参酮含量的提取及测定 

将实施例3中收获并烘干的转基因丹参毛状根放入研钵中充分研磨，取200mg毛状根干粉加入甲醇：二氯甲烷(3：1，v／v)16ml，超声提取60min，室温放置过夜，次日拿出离心(12000rpm，10min)，吸取上清萃取液真空干燥，残余物重新用1ml的色谱甲醇：二氯甲烷（3:1）混合液体溶解，样品用0.22μM的滤膜过滤后各取20μl，注入高效液相色谱仪测量二氢丹参酮，隐丹参酮，丹参酮I，丹参酮ⅡA的含量。 

本发明以发根农杆菌C58C1为介导将1304⁺质粒导入到丹参中去得到毛状根，同时用水相合成的方法，通过控制回流时间合成粒径约为2nm的CdSe量子点，并将这种量子点加入到毛状根培养液中，使终浓度达到100μg/L，同时分别加入终浓为度100μg/L的CdCl₂溶液和无菌水溶液作为对照，测定用量子点分别处理毛状根0小时、12小时、24小时、48小时、6小时和7天后的毛状根生物量和丹参酮含量。CdSe量子点处理丹参毛状根后毛状根的干重在7天后为水对照组 干重的86.8%，而含有相同重金属浓度的CdCl₂对照组中毛状根的干重为水对照组的65.1%。 

在本发明中CdSe量子点对丹参毛状根中丹参酮含量有较明显的 提高作用（结果如图3所示）。CdSe量子点诱导丹参毛状根在48小时后总丹参酮的含量达到最高的1.93mg/g DW，为不加量子点处理毛状根（水对照组）中含量的3.78倍，其中二氢丹参酮，隐丹参酮，丹参酮I，丹参酮ⅡA的含量分别为0.41mg/g DW，1.12mg/g DW，0.10mg/g DW，0.30mg/g DW，分别是水对照组的3.72，4.86，1.80，2.72倍。而含有相同重金属浓度的CdCl₂对照组中48小时后二氢丹参酮，隐丹参酮，丹参酮I，丹参酮ⅡA，总丹参酮的含量分别为0.18mg/g DW，0.51mg/g DW，0.07mg/g DW，0.26mg/g DW，1.03mg/g DW。 

由上述实施例可见，在丹参毛状根培养基中加入CdSe量子点，使其终浓度达到100μg/L，第12小时起丹参毛状根中丹参酮含量开始上升，在第48小时达到最大值，随后效果开始下降。 

上述实施例证明了CdSe量子点作为一种诱导剂可以明显的刺激丹参毛状根中总丹参酮的含量，并且效果优于传统的重金属离子诱导剂。