改变植物中碳水化合物含量的方法

摘要

在此描述了改变植物组织中的至少一种碳水化合物的方法。该方法典型地应用于甘蔗属的一种甘蔗植物并且包括向一种植物细胞中插入一种基因沉默盒的步骤，该基因沉默盒包括可操作地连接到转录元件(如一个单子叶植物启动子)上的核酸，这些转录元件用于在植物细胞中转录该核酸，其中该核酸的转录降低了UMP合成酶的活性。该方法进一步包括从该植物细胞再生一种转基因植物并且产生具有增加的碳水化合物含量的组织的步骤。还描述了为此使用的载体、连同一种转化的植物细胞以及含有或源于一种转化的植物细胞的一种转基因植物或植物部分。

说明书

发明领域

本发明涉及一种改变植物组织中至少一种碳水化合物的方法、为此使用 的一种载体、以及含有该载体的一种转化的植物细胞、植物部分或转基因植 物。

发明背景

蔗糖(主要从甘蔗中得到)是一种主要的人类食品并且是一种用于生产 燃料乙醇的重要原料。蔗糖的商业化生产因此可以得益于作物中蔗糖含量的 增加或甘蔗产量的增加。由于增加甘蔗的蔗糖含量导致了在相关的生产成本 相对小的增加下蔗糖产量的增加，蔗糖含量的增长被视为比相应的甘蔗产量 的增加更有经济效益。这意味着增加蔗糖含量已经成为使用基于生物技术的 方法的甘蔗育种计划和转基因研究的一个重要目标。

用于增加作物的还原碳或氮含量的多种基于生物技术的方法是针对于 增加目标产物的直接前体的浓度(Sonnewald等人，1997；Stark等人，1992)， 这些方法倾向集中于增加有关代谢产物的浓度，然而还未曾导致贮藏器官中 目标代谢产物的显著增加。

因此存在着一种用于改变作物(如甘蔗)的碳水化合物含量的替代方法、 以及对于具有相对更高的蔗糖含量的作物(如甘蔗)的需要。

发明目的

本发明的一个目的在于提供一种改变植物的至少一种碳水化合物的含 量的方法。

发明概述

根据本发明，提供了一种增加一个或多个植物细胞中至少一种碳水化合 物含量的方法，该方法包括抑制这一个或多个植物细胞中的UMP合成酶 (UMPS)活性。

在一些实施方案中，抑制UMPS活性的方法将包括向一个或多个植物 细胞中插入至少一个基因沉默盒的步骤。表达这一个或多个基因沉默盒由此 导致了降低的UMP合成酶活性以及至少一种碳水化合物(例如蔗糖)的含 量增加。降低的UMPS活性可以发生于不同的机制(参见例如以下关于用于 降低UMPS的表达的方法的详细说明中的讨论)。

在一些实施方案中，将一个或多个基因沉默盒插入到一个细胞群(例如 一种愈伤组织)中。

在一些实施方案中，从如以上所述产生的一个或多个植物细胞再生了一 种转基因植物。植物组织和植物部分(例如种子、贮藏器官等)可以从该植 物中收获。

在一些实施方案中，具有增加含量的至少一种碳水化合物的植物组织是 从如以上所述转化的一个或多个植物细胞产生的。这可以任选地包括从一个 或多个转化植物细胞再生一种转基因植物。术语“组织”在此是在广义上使用 的并且包括对于细胞聚集体的引用。组织的细胞可以是分化的或未分化的。 在一些实施方案中，这些细胞可以具有类似的结构和/或功能。在一些实施方 案中，这些细胞可以被专门化以执行特定的功能。在一个实施方案中，该组 织是一种愈伤组织。

在一些实施方案中，将一个或多个植物细胞用一个或多个基因沉默盒来 转化，这些基因沉默盒包括可操作地连接到一个或多个转录元件上的核酸， 这些转录元件用于转录该核酸，其中该核酸的转录降低了UMP合成酶的活 性。

任选地，该核酸包括(并且任选地组成为)以下中的一种或多种：

(i)一个UMPS ORF的反义序列(例如SEQ ID NO 1的核苷酸序列)、 或其一部分(例如该序列的至少10、15、20、25、30、40、50、70、100、 150、200、300、400、500、600、700个核苷酸)，

(ii)与一个UMPS ORF的反义序列(例如SEQ ID NO 1)或其一部分 至少80％、85％、90％、95％、或99％类似的一个核苷酸序列，

(iii)一个UMPS ORF的正义序列(例如SEQ ID NO 2的核苷酸序列)、 或其一部分，

(iv)与一个UMPS ORF的正义序列(例如SEQ ID NO 2)或其一部分 至少80％、85％、90％、95％、或99％类似的一个核苷酸序列，

(v)(a)如以上的(i)或(ii)，以及(b)如以上的(iii)或(iv)， 任选地具有(a)与(b)之间的一个可剪接的内含子序列，并且其中该可剪 接的内含子序列的长度优选是至少是70bp或74bp，优选长度是至少100bp、 200bp、300bp、400bp、450bp、或500bp，并且更优选长度是至少74bp。

在至少一些实施方案中，该UMPS ORF相应于转化的植物细胞的UMPS ORF。因此，例如，当该植物细胞是一种甘蔗植物细胞时，该UMPS ORF 是甘蔗的ORF并且因此例如根据以上的(i)，该核酸包括甘蔗UMPS ORF 的反义序列、或其一部分。

在一些实施方案中，可以将两个或更多个基因沉默盒插入到一个或多个 植物细胞中，例如第一基因沉默盒具有根据以上(i)或(ii)的核酸，并且 第二基因沉默盒具有根据以上(iii)或(iv)的核酸。因此，构想了这样的 实施方案，其中正义和反义分子是从单个的或分离的基因沉默盒来表达的。 这些分子可以用于双链RNA干扰，由此一个正义RNA分子和一个完全或部 分地与一个UMPS基因的正义RNA分子互补的反义RNA分子表达于相同 的植物细胞中，导致了相应的编码UMPS的内源mRNA的表达抑制。

在一些实施方案中，这一个或多个转录元件包括一个启动子、任选地一 个单子叶植物启动子(例如一个UBI启动子)。

在一些实施方案中，这至少一种碳水化合物是选自下组，该组由以下各 项组成：蔗糖、淀粉、葡萄糖、以及果糖。在一些实施方案中，该方法导致 了淀粉和蔗糖两者以及任选地一种或多种另外的碳水化合物(例如葡萄糖) 的含量增加。

在一些实施方案中，该植物是一种贮存糖的植物，任选地选自下组， 包括甘蔗、高粱、以及甜菜。在一些实施方案中，该植物是甘蔗属，任选 地是甘蔗。

通过以上所述的方法得到的或可得到的植物细胞、植物组织、植物和植 物部分(例如种子、贮藏器官、甘蔗)被包括在本发明的范围之内。

根据本发明，进一步提供了一种载体，该载体包括用于降低植物细胞中 的UMPS活性的一个或多个基因沉默盒。

在一些实施方案中，该载体是一种RNAi载体。

在一些实施方案中，这一个或多个基因沉默盒包括可操作地连接到一个 或多个转录元件上的核酸，这些转录元件用于转录该核酸，其中该核酸的转 录降低了UMP的活性。

任选地，该核酸包括(并且任选地组成为)以下中的一种或多种：

(i)一个UMPS ORF的反义序列(例如SEQ ID NO 1的核苷酸序列)、 或其一部分(例如该序列的至少10、15、20、25、30、40、50、70、100、 150、200、300、400、500、600、700个核苷酸)，

(ii)与一个UMPS ORF的反义序列(例如SEQ ID NO 1)或其一部分 至少80％、85％、90％、95％、或99％类似的一个核苷酸序列，

(iii)一个UMPS ORF的正义序列(例如SEQ ID NO 2的核苷酸序列)、 或其一部分，

(iv)与一个UMPS ORF的正义序列(例如SEQ ID NO 2)或其一部分 至少80％、85％、90％、95％、或99％类似的一个核苷酸序列，

(v)(a)如以上的(i)或(ii)，以及(b)如以上的(iii)或(iv)， 任选地具有(a)与(b)之间的一个可剪接的内含子序列，并且其中该可剪 接的内含子序列的长度优选是至少是70bp或74bp，优选长度是至少100bp、 200bp、300bp、400bp、450bp、或500bp，并且更优选长度是至少74bp。

在一些实施方案中，这一个或多个转录元件包括一个启动子、任选地一 个单子叶植物启动子(例如一个UBI启动子)。

在一些实施方案中，这至少一种碳水化合物是选自下组，该组由以下各 项组成：蔗糖、淀粉、葡萄糖、以及果糖。在一些实施方案中，该方法导致 了淀粉和蔗糖两者以及任选地一种或多种另外的碳水化合物(例如葡萄糖) 的含量增加。

在一些实施方案中，该植物是一种贮存糖的植物，任选地选自下组， 包括甘蔗、高粱、以及甜菜。在一些实施方案中，该植物是甘蔗属，任选 地是甘蔗。

根据本发明，还提供了一种转化的植物细胞，该细胞包括一种载体，该 载体包括用于降低植物细胞中的UMPS活性的一个或多个基因沉默盒。

在一些实施方案中，该载体是一种RNAi载体。

在一些实施方案中，这一个或多个基因沉默盒包括可操作地连接到一个 或多个转录元件上的核酸，这些转录元件用于转录该核酸，其中该核酸的转 录降低了UMP的活性。

任选地，该核酸包括(并且任选地组成为)以下中的一种或多种：

(i)一个UMPS ORF的反义序列(例如SEQ ID NO 1的核苷酸序列)、 或其一部分(例如该序列的至少10、15、20、25、30、40、50、70、100、 150、200、300、400、500、600、700个核苷酸)，

(ii)与一个UMPS ORF的反义序列(例如SEQ ID NO 1)或其一部分 至少80％、85％、90％、95％、或99％类似的一个核苷酸序列，

(iii)一个UMPS ORF的正义序列(例如SEQ ID NO 2的核苷酸序列)、 或其一部分，

(iv)与一个UMPS ORF的正义序列(例如SEQ ID NO 2)或其一部分 至少80％、85％、90％、95％、或99％类似的一个核苷酸序列，

(v)(a)如以上的(i)或(ii)，以及(b)如以上的(iii)或(iv)， 任选地具有(a)与(b)之间的一个可剪接的内含子序列，并且其中该可剪 接的内含子序列的长度优选是至少是70bp或74bp，优选长度是至少100bp、 200bp、300bp、400bp、450bp、或500bp，并且更优选长度是至少74bp。

在一些实施方案中，这一个或多个转录元件包括一个启动子、任选地一 个单子叶植物启动子(例如一个UBI启动子)。

在一些实施方案中，这至少一种碳水化合物是选自下组，该组由以下各 项组成：蔗糖、淀粉、葡萄糖、以及果糖。在一些实施方案中，该方法导致 了淀粉和蔗糖两者以及任选地一种或多种另外的碳水化合物(例如葡萄糖) 的含量增加。

在一些实施方案中，该植物是一种贮存糖的植物，任选地选自下组， 包括甘蔗、高粱、以及甜菜。在一些实施方案中，该植物是甘蔗属，任选 地是甘蔗。

根据本发明，进一步提供了含有或源于一种转化的植物细胞的一种转 基因植物、植物部分或植物组织，该细胞包括一种载体，该载体包括用于 降低植物细胞中的UMPS活性的一个或多个基因沉默盒。

在一些实施方案中，该载体是一种RNAi载体。

在一些实施方案中，这一个或多个基因沉默盒包括可操作地连接到一个 或多个转录元件上的核酸，这些转录元件用于转录该核酸，其中该核酸的转 录降低了UMP的活性。

可任选地，该核酸包括(并且任选地组成为)以下中的一种或多种：

(i)一个UMPS ORF的反义序列(例如SEQ ID NO 1的核苷酸序列)、 或其一部分(例如该序列的至少10、15、20、25、30、40、50、70、100、 150、200、300、400、500、600、700个核苷酸)，

(ii)与一个UMPS ORF的反义序列(例如SEQ ID NO 1)或其一部分 至少80％、85％、90％、95％、或99％类似的一个核苷酸序列，

(iii)一个UMPS ORF的正义序列(例如SEQ ID NO 2的核苷酸序列)、 或其一部分，

(iv)与一个UMPS ORF的正义序列(例如SEQ ID NO 2)或其一部分 至少80％、85％、90％、95％、或99％类似的一个核苷酸序列，

(v)(a)如以上的(i)或(ii)，以及(b)如以上的(iii)或(iv)， 任选地具有(a)与(b)之间的一个可剪接的内含子序列，并且其中该可剪 接的内含子序列的长度优选是至少是70bp或74bp，优选长度是至少100bp、 200bp、300bp、400bp、450bp、或500bp，并且更优选长度是至少74bp。

在一些实施方案中，这一个或多个转录元件包括一个启动子、任选地一 个单子叶植物启动子(例如一个UBI启动子)。

在一些实施方案中，这至少一种碳水化合物是选自下组，该组由以下各 项组成：蔗糖、淀粉、葡萄糖、以及果糖。在一些实施方案中，该方法导致 了淀粉和蔗糖两者以及任选地一种或多种另外的碳水化合物(例如葡萄糖) 的含量增加。

在一些实施方案中，该植物是一种贮存糖的植物，任选地选自下组， 包括甘蔗、高粱、以及甜菜。在一些实施方案中，该植物是甘蔗属，任选 地是甘蔗。

在一些实施方案中，该植物是甘蔗属，任选地是甘蔗，以及转基因植 物部分(一种愈伤组织)。

如在此使用的术语“碳水化合物”是指产生能量的有机化合物，如淀粉和 糖类。

如在此使用的术语“UMP合成酶”是指一种能够催化从头嘧啶生物合成 的最后两步并且具有乳清酸磷酸核糖转移酶和乳清酸核苷酸脱羧酶两者的 活性的酶。

附图简要说明

仅通过举例描述本发明的一个实施方案，参考以下这些图，其中：

图1是植物表达载体(pihUMPS)的图示，在正义和反义取向上均含有 801 bp UMPS cDNA片段，并且被一个74bp内含子分开；

图2是一种琼脂糖凝胶，显示了KpnI和XbaI pihUMPS消化的分辨的限 制性产物；

图3是一种琼脂糖凝胶，显示了在推定的pihUMPS转化的甘蔗克隆的 PCR筛选过程中获得的分辨的PCR扩增产物；

图4是一种琼脂糖凝胶，显示了转基因克隆中的内源UMP合成酶 (UMPS)表达(A)、内源二磷酸核苷磷酸酶(NDPase)表达(B)、以及 内源肌动蛋白表达(C)的半定量RT-PCR分析过程中获得的分辨的RT-PCR 扩增产物；

图5显示了在用pihUMPS转化的甘蔗中的UMPS活性的抑制。使用来自 悬浮细胞和节间8-10(节间)的粗制的脱盐的蛋白质提取物来确定UMPS活 性。数值计算为平均值±STDEV，n＝3。^*P≤0.02；^**P≤0.002；

图6显示了在用pihUMPS转化的甘蔗中的尿苷激酶(UK)活性的上调。 使用来自悬浮细胞和节间8-10(节间)的粗制的脱盐的蛋白质提取物来确定 UK活性。数值计算为平均值±STDEV，n＝3。^*P≤0.02；

图7显示了在用pihUMPS转化的甘蔗中的尿嘧啶磷酸核糖基转移酶 (UPRTase)活性。使用来自悬浮细胞和节间8-10(节间)的粗制的脱盐的 蛋白质提取物来确定UPRTase活性。数值计算为平均值±STDEV，n＝3。^*P ≤0.03；

图8展示了在用pihUMPS转化的甘蔗中的分解和合成中的蔗糖合成酶 (SuSy)活性。使用来自悬浮细胞中的粗制的脱盐的蛋白质提取物来确定SPS 活性。数值计算为平均值±STDEV，n＝3。^*P≤0.03；

图9显示了在用pihUMPS转化的甘蔗中的分解和合成两者中的蔗糖合 成酶(SuSy)活性。使用来自节间8-10的粗制的脱盐的蛋白质提取物来确定 SPS活性。数值计算为平均值±STDEV，n＝3。^*P≤0.03；

图10显示了在用pihUMPS转化的甘蔗中的ADP葡萄糖焦磷酸化酶 (AGPase)活性。使用来自悬浮细胞和节间8-10(节间)的粗制的脱盐的蛋 白质提取物来确定AGPase活性。数值计算为平均值±STDEV，n＝3。^*P≤ 0.03；

图11显示了在用pihUMPS转化的甘蔗中的UDP葡萄糖焦磷酸化酶 (UGPase)活性。使用来自悬浮细胞和节间8-10(节间)的粗制的脱盐的蛋 白质提取物来确定UGPase活性。数值计算为平均值±STDEV，n＝3。^*P≤ 0.05；

图12显示了用pihUMPS转化的甘蔗中的蔗糖含量。使用来自悬浮细胞和 节间8-10(节间)的可溶于乙醇的提取物来确定蔗糖浓度。数值计算为平均 值±STDEV，WT，n＝5并且转基因甘蔗系，n＝3。^*P≤0.05，^*P≤0.02；

图13显示了用pihUMPS转化的甘蔗中的淀粉含量。数值计算为平均值 ±STDEV，WT，n＝5并且转基因甘蔗系，n＝3。^*P≤0.05，^*P≤0.02；

图14显示了用pihUMPS转化的甘蔗中的葡萄糖含量。数值计算为平均值 ±STDEV，WT，n＝5并且转基因甘蔗系，n＝3。^*P≤0.05，^*P≤0.02；

图15显示了用pihUMPS转化的甘蔗中的果糖含量。数值计算为平均值 ±STDEV，WT，n＝5并且转基因甘蔗系，n＝3。^*P≤0.05，^*P≤0.02；

图16显示了在悬浮细胞中涉及蔗糖与淀粉代谢的代谢产物的线性 相关。除了蔗糖之外，以nmol/g FW给出了淀粉和己糖(μmol/g FW)所有的 代谢产物水平。对于蔗糖，(A)UDP-葡萄糖、(B)磷酸己糖、(C)己糖、 (D)总尿苷酸(uridinylate)；对于淀粉，(E)磷酸己糖、以及(F)总腺嘌 呤核苷酸。数据是每个系的三个独立的悬浮培养物的平均值。

图17显示了在成熟节间中涉及蔗糖与淀粉代谢的代谢产物的线性 相关。除了蔗糖之外，以nmol/g FW给出了淀粉和己糖(μmol/g FW)所有的 代谢产物水平。对于蔗糖，(A)总尿苷酸、(B)磷酸己糖、(C)己糖、(D) UDP-葡萄糖；对于淀粉，(E)磷酸己糖、以及(F)总腺嘌呤核苷酸。数据 是每个系的三个独立的植物的平均值。

图18显示了在悬浮细胞中的代谢产物与关键酶的线性相关。除了 蔗糖之外(μmol/g FW)，所有的代谢产物水平是以nmol/g FW给出的并且所 有酶活性是以nmol.min^-1mg^-1蛋白质来表示的；(A)蔗糖和蔗糖磷酸合成酶、 (B)尿苷激酶、(C)蔗糖和UMP合成酶以及(D)总尿苷酸和尿苷激酶。 数据是野生型和转基因系的三个重复的平均值。

图19显示了在成熟节间中的代谢产物与关键酶的线性相关。除了 蔗糖之外(μmol/g FW)，所有的代谢产物水平是以nmol/g FW给出的并且所 有酶活性是以nmol.min^-1mg^-1蛋白质来表示的；(A)蔗糖和蔗糖磷酸合成酶、 (B)蔗糖和UMP合成酶、(C)尿苷激酶以及(D)总尿苷酸和尿苷激酶。 数据是野生型和转基因系的三个重复的平均值。

图20显示了针对产生显著比对的序列的BLAST搜索输出，使用了甘蔗 UMPS DNA序列TC68130；

图21显示了甘蔗UMPS DNA序列TC68130(甘蔗)与甜高粱UMPS DNA 序列(XM_002456891.1)(甜高粱)的一个配对序列比对；以及

SEQ ID NO 1显示了UMPS ORF的反义序列，以及

SEQ ID NO 2显示了UMPS ORF的正义序列。

参照附图的详细说明

一种转基因植物的制备通常包括将被称为原生质体的一种植物细胞进 行转化。用于双子叶植物的转化技术在本领域也是熟知的，并且包括基于农 杆菌的技术以及不需要农杆菌的技术。

转化技术包括经由粒子轰击、原生质体摄入，如用PEG和通过电穿孔、 以及显微注射的转化。载体的选择很大程度上取决于对于被转化的种类的优 先选择。然后可以使用标准技术从这种转化的原生质体再生出完整的转基因 植物。

农杆菌介导的转化是一种用于转化双子叶植物的技术，因为它具有高转 化效率并且广泛用于许多不同的种类，这些种类包括烟草、番茄、向日葵、 棉花、油料种子油菜(oilseed rape)、马铃薯、大豆、苜蓿以及白杨。农杆 菌转化典型地涉及将一个携带外源DNA的二元载体转移进入适当的农杆菌 菌株。所选择的菌株取决于由宿主农杆菌菌株携带的vir基因的互补物或取 决于共驻质粒或染色体。使用经该重组二元载体转化的大肠杆菌，通过三亲 本杂交来进行该重组二元载体到农杆菌中的转移。还可以通过DNA转化将 该重组二元载体转移到农杆菌中。使转化组织在一个选择培养基中再生，这 种培养基携带一种抗生素或除草剂抗性标记。

使用PEG或电穿孔技术的直接基因转移到原生质体中以及粒子轰击到 愈伤组织中是对于单子叶植物的优选转化技术。转化可以用单个载体或用多 个载体来进行。水稻的转化也可以利用原生质体或粒子轰击通过直接基因转 移技术来进行。单子叶植物细胞(如玉米)的转化可以通过使单子叶植物细 胞与多个针状体接触来实现，在这些针状体上这些细胞可以被刺穿，引起细 胞壁破裂，由此允许转化DNA进入这些细胞中。

用于制备编码影响基因沉默的核苷酸序列的核酸的方法在本领域中是 已知的。例如，将编码该核酸的cDNA插入到一个处于盒的形式的植物转化 载体(含有用于植物细胞的转化和cDNA的表达的所有必需元件)中，从而 在植物细胞中产生该核酸。例如，该盒(在适当的阅读框中并且因此可操作 连接)可以包含一个在植物中起作用的启动子、一个5′非翻译前导序列、插 入片段DNA、以及一个在植物中起作用的3′非翻译区，从而引起多聚腺苷 酸化核苷酸(polyadenylated nucleotide)加入到RNA序列的3′末端用于翻译 需要。

用于在植物细胞中表达核酸的启动子及其核苷酸序列例如可以源自植 物或植物DNA病毒，并且在本领域中为此目的使用了不同的启动子。所选 择的启动子可以具有组成型活性，如CaMV 35S启动子、肌动蛋白启动子、 以及泛素启动子。可替代地，它们可以是可诱导的并且因此驱动抗性基因在 创伤或病原体感染的部位的表达。其他有用的启动子表达在特定细胞类型中 (如叶表皮细胞、叶肉细胞、根皮层细胞)或表达在特定组织或器官中(例 如根、叶或花)，如优选在髓细胞(pith cell)中表达的玉米trpA基因以及 以叶特异性方式指导表达的来自编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)的玉 米基因的启动子。所选择的启动子可以在光诱导的或其他时序性调控的启动 子下驱动基因的表达。另一个替代方案是所选择的启动子是用化学方法调节 的。该启动子还可以对于单子叶植物或对于双子叶植物中的核酸的表达是特 异的。

许多种用于表达盒中的转录切割和多磷酸化位点是可获得的。这些用于 正确加工(形成)mRNA的3′末端。在植物中起作用的适当的转录切割和多 磷酸化位点包括CaMV 35S切割和多磷酸化位点、tml切割和多磷酸化位点、 胭脂碱合成酶切割和多磷酸化位点、以及豌豆rbcS E9切割和多磷酸化位点。 这些可以在单子叶植物和双子叶植物中使用。

已知许多源于病毒的非翻译的前导序列增强表达，特别在双子叶细胞 中。来自烟草花叶病毒(TMV，″Ω-序列″)、玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)、 以及苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列可以用来增强表达。

可以通过标准重组DNA法将一个包括核酸的表达盒插入到一个植物转 化载体中，该核酸含有一个或多个上述不同元件。可替代地，该表达盒的一 些或所有元件可以存在于该载体中，并且在必要时可以将任何剩余元件加入 到该载体中。可商购多种转化载体用于植物转化，并且可以将本发明的核酸 与任何这类载体结合使用。多数载体包括编码选择标记蛋白的一个或多个基 因。所使用的载体将取决于优选的转化技术、用于转化的目标种类、以及所 希望的选择标记。对于某些目标种类，特异性抗生素或除草剂选择标记可以 是优选的，如赋予对于卡那霉素的抗性的nptll基因、赋予对于除草剂草丁 膦的抗性的bar基因、赋予对于抗生素潮霉素的抗性的hph基因、以及赋予 对于甲氨蝶呤的抗性的dhfr基因。

根据本发明，可以使用标准化技术制备转基因植物，这些转基因技术导 致了基因表达的上调或下调或其表达的完全消失。以此方式，可以产生具有 降低的UMPS活性的植物细胞、植物、植物部分等。在表达上的改变可以由 干扰基因表达的序列的引入而引起。此类序列在本领域中是已知的并且包括 反义构建体、正义构建体、RNA沉默构建体、或RNA干扰分子；或者它可 以通过使用例如转座子、耕种、同源重组、或无义突变由敏感基因自身的基 因组破坏而引起。反义核酸的使用在本领域中是熟知的，并且可以是RNA、 DNA、一种PNA或任何其他适当的分子。可以使用催化性RNA分子或核酶 来抑制敏感基因的表达。可以设计与目标RNA特异配对的并且在特定位置 切割磷酸二酯骨架的核酶，由此在功能上使目标RNA失活。核酶序列可以 与反义RNA组合使用。包括一个或多个失活的敏感基因的转基因植物还可 以通过使用RNA沉默或干扰(RNAi)来产生，这还可以称为转录后基因沉 默(PTGS)或共抑制。

在本发明的背景下，“基因沉默”(也称为RNA沉默、RNAi或RNA- 介导的干扰)包括对于任何这样的机制的引用，即在细胞中的单链或双链 RNA的存在通过这样的机制导致了目标基因表达的抑制，该目标基因包括 与RNA的序列相同或接近相同的序列，并且包括“基因沉默”但不局限于： RNA干扰、抑制从目标基因转录的目标mRNA的翻译而没有改变mRNA的 稳定性、以及转录沉默(如导致目标RNA的转录抑制的组蛋白乙酰化以及 异染色质形成)。

在植物中降低UMP合成酶基因表达的任何方法可以用于本发明的实践 中。如在一种基因产物的背景下在此使用的术语“表达”是指该基因产物的生 物合成，包括该基因产物的转录和/或翻译和/或组装。用于使在一种植物中 的基因的表达沉默(即减小或消除)的方法在本领域是已知的，并且任何此 类方法可以用在本发明的方法中。可以如以上所提及来使用与针对目标序列 的信使RNA(mRNA)的至少一部分完全或部分互补的反义构建体。反义核 苷酸被设计用来结合到相应的mRNA上。

可以对用于本发明的UMP基因沉默分子的序列作出改变，只要这些序 列结合到相应mRNA上并且干扰相应mRNA的表达即可。在此方面，具有 与目标UMP序列至少大约70％、至少大约80％、至少大约85％、至少大约 90％、至少大约95％、至少大约99％、或更高的序列相似性的序列可以用在 本发明中。用于本发明的UMP基因沉默分子的部分序列还可以用来破坏目 标UMP基因的表达。可以优选使用具有至少大约10个核苷酸、至少大约 20个核苷酸、至少大约30个核苷酸、至少大约40个核苷酸、至少大约50 个核苷酸、至少大约100个核苷酸、至少大约200个核苷酸、至少大约300 个、至少大约400个、至少大约450个、至少大约500个、至少大约550个、 或更多个核苷酸的序列。还可以使用共抑制来抑制目标UMP基因的表达。 在此方面，一个异源UMP合成酶序列可以在正义方向表达从而抑制内源 UMP合成酶基因的表达。

使用本领域中已知的各种公共可得的数据库如GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html)可以发现类似于在此所述 的UMP基因的序列。

在转基因植物中，在调节外源基因的表达中可剪接的内含子序列的使用 在本领域中是已知的。在本发明中可以使用至少70nt的可剪接的内含子序 列。至少大约70个核苷酸、至少大约100个核苷酸、至少大约200个核苷酸、 至少大约300个、至少大约400个、至少大约450个、至少大约500个、至少大 约550个、或更多个核苷酸的序列的使用在本领域中是已知的。长度高达大 约0.75kb或甚至高达1.1kb的可剪接的内含子序列在本领域中是已知的。

在本发明的一个实施方案中，通过基于RNAi的UMPS下调，增加了转 基因甘蔗组织的蔗糖、淀粉和葡萄糖含量。简言之，将一种含有一个基因沉 默盒的载体插入到一种植物细胞中，该基因沉默盒包括具有SEQ ID NO 1和 SEQ ID NO 2的核苷酸序列以及在它们之间的一个可剪接的74bp内含子序 列的核酸，该基因沉默盒可操作地连接到一个转录元件(以单子叶启动子 UBI启动子的形式)上。该核酸在植物细胞中的转录降低了UMP合成酶的 活性。然后从这种经转录的植物细胞再生出一种转基因甘蔗植物；并且产生 了具有增加的碳水化合物含量的甘蔗组织。

实例

1.介绍

虽然尿苷酸已经被不同研究组报道为糖类用于淀粉合成中重要的辅因 子，Geigenberger等人(2005)的最近的工作证实了嘧啶合成的从头合成途 径的反义抑制导致了低能耗补救途径的补偿刺激。在马铃薯块茎中的这个途 径的下游抑制作用包括尿苷酸库的升高、淀粉含量的升高、蔗糖含量的降低 以及作物产量的提高。

嘧啶核苷酸的从头生物合成(也称为乳清酸盐途径)被定义为从氨甲酰 磷酸(CP)、天冬氨酸、以及5-磷酸核糖-1-焦磷酸盐(PRPP)形成UMP。嘧 啶核苷酸生物合成由六个酶促步骤组成。氨甲酰磷酸合成酶(CPSase)从碳 酸盐、ATP、以及氨基基团的组合产生了CP。CP不仅用于嘧啶从头合成，还 用作用于精氨酸生物合成的一种前体。下一步对于嘧啶生物合成是特异的， 其中天冬氨酸转氨甲酰酶(ATCase)催化了CP与天冬氨酸的缩合从而形成 氨甲酰天冬氨酸(CA)。氨甲酰天冬氨酸环化以形成嘧啶环是由二氢乳清酸 酶(DHOase)催化的。随后，二氢乳清酸(DHO)被二氢乳清酸脱氢酶 (DHODH)氧化以产生乳清酸盐(OA)。用乳清酸磷酸核糖转移酶(OPRTase) 将乳清酸盐与PRPP缩合成乳清酸核苷5-单磷酸盐(OMP)，然后用乳清酸核 苷酸脱羧酶(ODCase)使其脱羧以形成尿苷5-单磷酸盐(UMP)。

由于核苷酸的从头合成是耗能的，细胞发展了一种策略以通过补救反应 再使用形成的核苷以及核碱基。通过特异性核苷激酶，核苷尿苷/胞苷以及胸 苷被补救成它们对应的核苷酸，并且通过尿嘧啶磷酸核糖基转移酶用PRPP 将尿嘧啶直接补救成UMP。补救途径也可以在向细胞提供核碱基中起到重要 作用，这些细胞不能针对其需要合成足够的量。

在植物中，UMP合成酶是一种催化从头嘧啶生物合成的最后两步的双 功能蛋白质。如在高等真核生物中，植物UMP合成酶具有乳清酸磷酸核糖转 移酶(OPRTase，EC 2.4.2.10)和乳清酸核苷酸脱羧酶(ODCase，EC 4.1.1.23) 两者的活性。先前已经显示出通过嘧啶从头生物合成途径的反义抑制而抑制 UMP合成酶导致了蔗糖含量的降低(Geigenberger等人，2005)。相比之下， 在此我们报道了作为嘧啶从头生物合成途径的反义抑制的结果的植物糖含 量的意外增加。

2.材料和方法

除非另外指明，所有化学品都是从西格玛奥德里奇(南非)获得的。除 非另外指明，所有偶联酶都是从罗氏(南非)获得的。

2.1制备转基因甘蔗植物

2.1.1克隆UPMS沉默载体pihUMPS

在此计划中使用的ihpRNA载体基于高通量RNAi基因沉默技术。 pihUMPS载体(图1)是从一种801bp PCR产物来构建的，该PCR产物是从克 隆到-T Easy(Promega)中的全长甘蔗UMPS cDNA扩增的。将UMP 合成酶cDNA从甘蔗(N19品种)卷叶RNA中分离出。使用Primer3软件 (http://frodo.wi.mit.edu)根据TIGR(TC68130，www.tigr.org)获得的蔗糖 DNA序列来设计特异的正向引物(GCAAGTTTGCTGACATTGGA)和反向 引物(CCACAGAAGCACTGGTGAAA)。分离的序列显示166个氨基酸的开 放阅读框(ORF)。由于多克隆位点可得性连同T7引物和反转T3；在亚克隆 到SK和KS(使用PstI和ApaI位点)(被修饰以含有 一个45bp内含子序列)中之前，使用pGEMT-Easy载体来克隆分离的基因。 随后分离来自修饰的SK和KS的插入片段及其相 邻的内含子区段(在用KpnI和XbaI消化质粒之后)。表达载体pU3Z(含有一 个单子叶植物启动子)同样是用KpnI进行消化并且脱磷酸。使用两个插入片 段连接，构建pihUMPS构建体，该构建体包括UMP合成酶的正义链和反义链。 通过长度为74个核苷酸的一个完全组装的内含子来分离UMPS基因片段。因 此该pihUMPS载体在正义方向和反义方向含有一个UMPS片段，该片段在一 个可剪接的内含子序列两侧并且可操作地连接到UBI启动子上。

2.1.2植物材料

使甘蔗植物(转基因和野生型甘蔗属品种N19)在温室条件下生长(大 约16小时光周期，大约25℃)。收获每个选择的转基因系的三个成熟的茎。 为了限制代谢产物损失，在收获后将植物组织(节间8-10合并的)直接切到 液体N2中并且在一个A11基本(IKA)分析碾磨机中研磨成细粉。在 -80℃下，将所有的组织保存在一个50mL螺旋盖管(Corning)中。

2.1.3植物转化

使用标准方案，使用pihUMPS载体来共转化甘蔗愈伤组织。根据标准方 案，基于在共转化的构建体中的npt-II选择标记，使用Genetycin来选择转基 因愈伤组织，并且再生成植物。使再生的植物变得耐寒并且在温室条件下生 长用于进一步分析。

2.1.4推定的转化体的PCR筛选

为了选择阳性转化克隆，通过PCR扩增针对pihUMPS载体的存在来筛 选转化子。通过根据McGarvey和Kaper(1991)改进的方法，从如所述的 推定的转基因系的成熟节间(8-10)的30-50mg组织中提取DNA。将400μL 提取缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8.0，1％溴化十六烷基三甲铵(CTAB) (默克)，0.7M NaCl，10mM EDTA，0.5％聚乙烯吡咯烷酮，0.1％的β- 巯基乙醇(BME，恰好在使用前添加))加入到该组织中并且涡旋1分钟。 然后将管在60℃下孵育60分钟。加入400μL氯仿并且将样品涡旋并旋转 沉降(13000rpm，5分钟)。将水层转移到含有1体积冷100％异丙醇的新 的Eppendorff管中并且在冰上孵育15分钟。使析出的核酸旋转沉降(13000 rpm，10分钟)并且在70％EtOH中洗涤，干燥，并且再悬浮于含有20 μg/mL核糖核酸酶A的20μL TE-缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 7.5，1mM EDTA)中。该PCR反应物包括25ng模板DNA、正向内含子(GAT CCC ACC TGC ATCGAT；10μM)、Nos-t(AAG ACC GGC AAC AGG ATT C；10 μM)、10μM dNTP(每个1μM)、含有0.37mM MgCl₂的10xPCR缓冲液、 以及0.25μL Tag聚合成酶(1U)，总体积为25μl。循环参数包括将PCR反 应物在94℃下孵育3分钟、然后是一个3步循环：94℃下持续30秒、60℃ 下持续45秒并且72℃下持续2分钟，总共重复30次。包括一个最后的在 72℃下持续5分钟的延长步骤。

对于每个转化，将对于遗传霉素耐受的七个独立的再生植物转移到土 壤中并且在标准条件下使其变得耐寒。

2.2基因表达的表征

2.2.1使用RT-PCR的内源UMP合成酶和NDPase的半定量基因表达分析

使用从温室生长的成熟植物中收集的悬浮细胞(组织培养物)以及节间 (8-10)组织用于RNA提取。根据Bugos等人(1995)的改进的方法，从所 有组织中提取总RNA。将组织切成小片，直接进入液体N2中并且在一个A11基本(IKA)分析碾磨机中研磨成细粉。将细粉转移到处于液体N2中的 一个50ml无菌管(Corning)中并且保存在-80℃下。将2克冷冻的组织加入 到在一个50mL管中的10mL匀浆缓冲液(0.1M Tris，pH 8.0，1mM EDTA， 0.1M NaCl，1％SDS(w/v)，0.1％BME)和10mL苯酚∶氯仿(1∶1)中并 且涡旋。添加乙酸钠(pH 5.2)至0.1M的终浓度并且将乳液在冰上孵育15 分钟，随后在4℃下进行离心(12000g，15分钟)。将水相转移到含有3体积 100％EtOH和0.1体积3M乙酸钠(pH 5.2)的一个新的管中，进行混合，并 且在-20℃下析出2小时。将析出的核酸在4℃下旋转沉降(12000g，15分钟) 并且在75％的EtOH中洗涤。根据生产厂商的说明书，将样品再悬浮在水中并 且用脱氧核糖核酸酶I(不含核糖核酸酶，Fermentas)处理，随后在2.5体积 100％的EtOH、0.1体积乙酸钠中沉淀。

使用半定量RT-PCR来确定UMP合成酶转录的下调是否导致了针对补救 酶(如NDPase)编码的转录物的上调。根据生产厂商的说明书，使用 RevertAid^TM第一链cDNA合成试剂盒(Fermentas，美国)，将从转基因甘蔗的 成熟节间组织得到展示出降低的UMP合成酶活性的5μg总RNA逆转录。用于 扩增UMPS RNA转录物的引物是：正向(GCTTGAAGCTGAAGGGTTTG) 以及反向(ACACAAACGATGATGGAGCA)；用于二磷酸核苷磷酸酶 (NDPase)的是：正向(AAGGCCTTGAAGCTTGTGAA)以及反向 (TGCAAAGACGCGAAAGTAAA)；并且对于管家肌动蛋白基因的是：正向 (ACTGGGACGACATGGAGAAG)以及反向 (TTCTCCACAGAGGAGCTGGT)。每一PCR反应物含有0.5μg cDNA作为 模板。进行管家基因α-激动蛋白的RT-PCR扩增从而归一化模板cDNA的量。

选择5个转基因甘蔗系用于进一步分析，该分析是基于UMP合成酶活性 水平以及再生植物可用性。将这些转基因甘蔗系标记2.2、3.1、3.2、3.3、以 及4.2，并且以下这样称呼。在进一步分析中，将转基因甘蔗系与非转化的或 野生型甘蔗(WT)进行比较。

2.3酶活性的表征

2.3.1蛋白质测定

根据生产厂商的说明书，根据Bradford(1976)使用一种可商购的蛋白 质分析溶液(Bio-Rad)来测定蛋白质浓度。使用牛白蛋白(部分V)(罗氏) 作为蛋白质标准品。

2.3.2UMP合成酶(UMPS)、尿苷激酶(UK)、以及尿嘧啶磷酸核糖 转移酶(UPRTase)活性测定。

从愈伤组织/悬浮培养物和成熟节间组织(8-10)获得粗蛋白质提取物。 蛋白质提取缓冲液的组成为：50mM HEPES-NaOH，pH 7.6，2mM EDTA， 10％甘油，28mM β-巯基乙醇，2％的PVPP以及(刚好在使用之前 添加)。将提取物在冰上孵育10分钟并且旋转沉降15分钟(10000xg，4℃)。 将上清液转移到预先平衡在提取缓冲液中的葡聚糖凝胶G-50(西格玛奥德里 奇)旋转柱上，并且旋转2分钟(10000rpm，4℃)。在含有50mM HEPES-NaOH (pH 7.6)、10mM MgCl₂、2mM MgCl₂、28μM β-巯基乙醇、0.6mM PRPP、 45μM标记的[2-¹⁴C]乳清酸的测定混合物中，通过加入脱盐蛋白质来启动 UMP合成酶反应。将该反应混合物在室温下孵育15-25分钟并且通过煮沸2分 钟来终止；根据Ashihara等人2000的方法改进的。将两(2)μl加载到一个TLC 上并且在缓冲液丁醇∶乙酸∶水(25∶24∶1)中跑1小时。

对于尿苷激酶(UK)，在含有50mM HEPES-NaOH(pH 7.6)、10mM MgCl₂、2mM MgCl₂、28μM β-巯基乙醇、3.75mM ATP、45μM标记的[2-¹⁴C] 乳清酸的测定混合物中，通过加入脱盐蛋白质来启动反应。将该反应混合物 在室温下孵育15-25分钟并且通过煮沸2分钟来终止；根据Ashihara等人2000 的方法改进的。将两(2)μl加载到一个TLC上并且在含有丁醇∶乙酸∶水 (25∶24∶1)的缓冲液中跑1小时。

对于尿嘧啶磷酸核糖转移酶(UPRTase)，在含有50mM HEPES-NaOH (pH 7.6)、10mM MgCl₂、2mM MgCl₂、28μM β-巯基乙醇、0.6mM PRPP、 45μM标记的[2-¹⁴C]乳清酸的测定混合物中，通过加入脱盐蛋白质来启动反 应。将该反应混合物在室温下孵育15-25分钟并且通过煮沸2分钟来终止；根 据Ashihara等人2000的方法改进的。将两(2)μl加载到一个TLC上并且在缓 冲液丁醇∶乙酸∶水(25∶24∶1)中跑1小时。

2.3.3蔗糖、己糖以及淀粉提取和定量

将五十毫克(50±10mg)冷冻组织加入到500μL 80％乙醇中。将悬浮 液在65℃下孵育过夜并且旋转沉降5分钟(3500xg，RT)。直接使用上清液用 于糖类测定。将残余物在80％乙醇中再提取多次并且将上清液丢弃以除去剩 余的己糖。将沉淀再悬浮于500μl MilliQ H₂O中并且在100℃下孵育4小时。 将上清液直接用于淀粉本底分析或者保存在-20℃下。将沉淀再悬浮于含有 10单位AMG的100μL缓冲液(50mM NaCL)中并且在55℃下孵育2小时。

根据Bergmeyer和Bernt(1974)的方法，进行酶定量。对于己糖分析， 将5μL提取物加入到一个96孔微量滴定板(Nunc)中的45μL MilliQ H₂O和 200μL缓冲液A(150mM Tris(pH 8.1)，5mM MgCl₂，1mM ATP(罗氏)， 1mM NADP(罗氏))中。在A₃₄₀处的初始读数之后，加入0.5U的己糖激酶/ 葡萄糖6-磷酸脱氢酶(HK/G6-PDH)并且在室温下孵育30分钟。取一个第二 读数来计算游离葡萄糖的含量。加入0.7U的磷酸葡萄糖异构酶(PGI)并且 在室温下孵育30分钟。取一个第三读数来计算提取物中存在的游离果糖含 量。为了量化样品中存在的蔗糖，用40μL缓冲液B(100mM柠檬酸盐(pH 5.0)，5mM MgCl₂)和10U β-果糖苷酶(罗氏)将5μL提取物在室温下孵育 15分钟。在加入200μL缓冲液A和0.5U HK/G6-PDH之后，将样品孵育并且 如之前进行读数。使用一个PowerWaveX酶标仪，获得所有的分光光度读数。

2.3.4对于蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性的测定

测定愈伤组织和节间(8-10)组织中的SPS活性。在最大(V_max)和限 制(V_lim)反应条件下，根据Baxter等人(2003)所述测定SPS活性。该蛋白 质提取缓冲液的组成为50mM HEPES-KOH(pH 7.5)、10mM MgCl₂、1mM EDTA、10mM DTT以及(罗氏)蛋白酶抑制剂混合物片剂，根据 生产厂商的说明书，将它刚好在使用之前加入。将提取物旋转沉降2分钟 (16000g，4℃)。将上清液转移到预先平衡在提取缓冲液中的葡聚糖凝胶 G-25(西格玛奥德里奇)旋转柱上并且旋转沉降2分钟(2000rpm，4℃)。 用100μL测定缓冲液(50mM HEPES-KOH(pH 7.5)，20mM KCl以及4mM MgCl₂)，将100μL粗蛋白质样品在35℃下孵育30分钟，该缓冲液含有(a) V_max测定；12mM UDP-Glc；10mM Fruc 6-P以及40mM Glc-6-P，或(b)V_lim测定；4mM UDP-Glc，2mM Fru-6-P，8mM Glc-6-P以及5mM KH₂PO₄。将 反应物加热到95℃下持续5分钟以终止该反应并且在16000g下旋转沉降5分 钟。将100μL上清液加入到100μL的5M KOH中并且在95℃下孵育10分钟以 破坏未反应的磷酸己糖。在加入200μL蒽酮测糖试剂(0.14％蒽酮，在14.6M H₂SO₄中)到50μL样品中之后，在一个PowerWaveX分光光度计中在620nm 处测量吸光度。用0-200nmol蔗糖，根据一个标准曲线计算蔗糖的绝对量值。

2.3.5在蔗糖分解方向测定蔗糖合成酶(SuSy)

为了测定愈伤组织和节间(8-10)组织中的蔗糖分解速率，根据等人(2004)所述测定了SuSy的催化活性。该蛋白质提取缓冲液的组成为100 mM Tris-HCl(pH 7.0)、10mM MgCl₂、1mM EDTA、10mM DTT以及 (罗氏)蛋白酶抑制剂混合物片剂，根据生产厂商的说明书，将 它刚好在使用之前加入。将提取物旋转沉降2分钟(16000g，4℃)。将上清 液转移到预先平衡在提取缓冲液中的葡聚糖凝胶G-25(西格玛奥德里奇)旋 转柱上并且旋转沉降2分钟(2000rpm，4℃)。用测定缓冲液来孵育粗蛋白 质样品(20μL)，该测定缓冲液的组成为：100mM Tris-HCl(pH 7.0)、2mM MgCl₂、400mM蔗糖、2mM NAD+、1mM焦磷酸钠、4U/mL葡糖磷酸变 位酶(罗氏)、4U/mL葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(罗氏)。通过加入尿苷二磷酸 (UDP)至2mM来开始反应。在340nm处监测NADH产生。

2.3.6在蔗糖合成方向测定蔗糖合成酶(SuSy)

为了测定愈伤组织和节间(8-10)组织中的蔗糖合成速率，根据等人(2004)所述测定了SuSy的合成活性。该蛋白质提取缓冲液的组成为： 100mM Tris-HCl(pH 7.0)、10mM MgCl₂、1mM EDTA、10mM DTT以及 (罗氏)蛋白酶抑制剂混合物片剂。将提取物旋转沉降2分钟 (16000g，4℃)。将上清液转移到预先平衡在提取缓冲液中的葡聚糖凝胶 G-25(西格玛奥德里奇)旋转柱上并且旋转沉降2分钟(2000rpm，4℃)。 用测定缓冲液孵育粗蛋白质样品(20μL)，该测定缓冲液的组成为：100mM Tris-HCl(pH 7.5)、15mM MgCl₂、20mM UDP-葡萄糖、0.2mM NADH、1 mM磷酸烯醇丙酮酸(PEP)以及0.45U/mL丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶(PK/LDH， 罗氏)。通过加入果糖至10mM来开始反应。在340nm处监测NAD⁺产生。

2.3.7对于ADP-葡萄糖焦磷酸化酶活性的测定

根据来自Ou-Lee和Setter(1985)的改进的方法来测定ADP-葡萄糖焦磷 酸化酶活性。测定混合物的组成为50mM HEPES缓冲液(pH 7)，含有5mm MgCl2、5mMADP-葡萄糖、2mM焦磷酸钠(PPi)、1mM NADP+、4U/mL 葡糖磷酸变位酶、4U/mL 6-磷酸葡糖酸脱氢酶以及4U/mL葡糖-6-磷酸脱氢 酶。本底读数是在不含PPi的测定混合物中加入20μL蛋白质提取物之后在340 nm处持续5分钟而完成的，并且通过加入PPi来开始该反应并且在340nm处读 取20分钟。

2.3.8对于UDP-葡萄糖焦磷酸化酶活性的测定

根据来自Ou-Lee和Setter(1985)的改进的方法来测定UDP-葡萄糖焦磷 酸化酶活性。测定混合物的组成为100mM Tris缓冲液(pH 7)，含有2mm MgCl₂、10mM UDP-葡萄糖、1mM焦磷酸钠(PPi)、1mMNAD+、4U/mL 葡糖磷酸变位酶、以及4U/mL葡糖-6-磷酸脱氢酶。本底读数是在不含PPi的 测定混合物中加入20μL蛋白提取物之后在340nm处持续5分钟而完成的，并 且通过加入PPi来开始该反应并且在340nm处读取20分钟。

2.3.9蔗糖、己糖以及淀粉提取和酶定量

将五十毫克(50±10mg)冷冻组织加入到500μL 80％乙醇中。将悬浮 液在65℃下孵育过夜并且旋转沉降5分钟(3500xg，RT)。将上清液直接用于 糖类测定。将残余物在80％乙醇中再提取多次并且将上清液丢弃以除去剩余 的己糖。将沉淀再悬浮于500μl MilliQ H₂O中并且在100℃下孵育4小时。将 上清液直接用于淀粉本底分析或者保存在-20℃下。将沉淀再悬浮于含有10 单位AMG的100μL缓冲液(50mM NaCL)中并且在55℃下孵育2小时。根 据Bergmeyer和Bernt(1974)所述方法，进行酶定量。

对于己糖分析，将5μL提取物加入到一个96孔微量滴定板(Nunc)中 的45μL MilliQ H2O和200μL缓冲液A(150mM Tris pH 8.1，5mM MgCl2，1 mM ATP(罗氏)，1mM NADP(罗氏))中。在340nm处的初始读数之后， 加入0.5单位的己糖激酶/葡萄糖6-磷酸脱氢酶(HK/G6-PDH)并且在室温下 孵育30分钟。取一个第二读数来计算游离葡萄糖的含量。加入0.7单位磷酸葡 糖异构酶(PGI)并且在室温下孵育30分钟。取一个第三读数来计算提取物 中存在的游离果糖的含量。为了量化样品中存在的蔗糖，用40μL缓冲液B (100mM柠檬酸(pH 5.0)，5mM MgCl2)和10单位β-果糖苷酶(罗氏)将 5μL提取物在室温下孵育15分钟。在加入200μL缓冲液A和0.5单位 HK/G6-PDH之后，将样品孵育并且如之前进行读数。使用一个PowerWaveX 酶标仪，进行所有的分光光度计读数。

2.3.10磷酸己糖和核苷酸测定

根据Stitt等人(1989)所述进行代谢产物提取。将1克之前保存的组织加 入到1.5mL冰冷的10％HClO4中，进行涡旋并且在搅拌下在4℃下孵育20分 钟。将不溶的材料旋转2分钟(13000rpm，于4℃)。在除去上清液后，将沉 淀洗涤并且用500μL 2％HClO4孵育15分钟，旋转沉降2分钟(13000rpm， 于4℃)，并且与第一上清液混合。通过加入5M KOH、1M三乙醇胺将样品 中和(pH 7.0-7.5)并且在4℃下孵育15分钟。将不溶性KClO4旋转沉降2分钟 (13000rpm)并且将中和的上清液以0.25μm过滤并且用于磷酸己糖量化。 将过滤的中和的上清液在液氮中瞬间冷冻并且在一个Speed Vac Plus SC11A 中冷冻干燥。

为了磷酸己糖测定，将20μL样品加入到一个96孔板中的230μL反应缓 冲液中，该缓冲液含有100mM Tris(pH 8.0)，5mM MgCl2以及0.25mM NADP。在340nm处读取本底。将0.7单位G6-PDH、0.7单位PGI和5mM Tris-HCl(pH 8.0)中的0.2单位葡糖磷酸变位酶(PGM)顺序加入，在室温 下孵育15分钟并且在340nm处读数以分别测定葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸 以及葡萄糖-1-磷酸。使用高压液相色谱法，从再悬浮的冷冻干燥的样品测定 核苷酸和核苷酸糖。

2.3.11.数据的统计分析

使用Student’s t检验来检验组平均值之间的显著差异。计算皮尔森积矩 相关系数的平方(测定系数)来指示特征之间的相关。使用STATISTICA(数 据分析软件系统版本8，www.statsoft.com)用于所有的统计分析。

2.3.10甘蔗UMPS的生物信息分析

使用在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi可得的在线工具，使用甘蔗 UMPS(TC68130)的DNA序列针对高度相似的DNA序列进行BLAST搜索。 将显示高相似性的区域序列各自与甘蔗UMPS DNA进行比对，使用了标准的 基于网页的比对工具，如由欧洲分子生物信息学研究所提供的并且在 http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/align/index.html在线可得的比对工具。

3.结果

3.1推定的转基因甘蔗系的证实

通过使用KpnI和XbaI的限制性核酸内切酶消化以及通过琼脂糖凝胶电 泳的限制性产物的分辨来证实pihUMPS的身份(如在图1的质粒图谱中所 示)KpnI消化产生了预期的4858bp和1816bp片段，而KpnI和XbaI双消 化产生了预期的4838bp以及908bp片段(图2)。

为了选择阳性转化克隆，通过PCR针对沉默载体的存在而筛选转化子 (图3)。从成熟节间(8-10)提取DNA。对于每个转化，将抗遗传霉素的 七(7)个独立的再生植物转移到土壤中并且在标准条件使其变得耐寒。选 择5个系用于进一步分析，该分析是基于UMPS活性水平以及再生植物可用 性。

3.2基因表达的表征

3.2.1使用RT-PCR的内源UMP合成酶(UMPS)和二磷酸核苷磷酸酶 (NDPase)的半定量基因表达分析

与未转化的野生型品系相比，UMPS沉默的下游作用被预期包括UMPS 的低转录水平以及补救途径的上调。因此使用半定量RT-PCR来确定UMPS转 录的下调是否导致了编码补救酶(如NDPase)的转录物的上调。观察到在转 基因甘蔗的成熟节间组织中的UMPS表达低于未转化的野生型品系中所观察 到的(图4A)，而观察到NDPase表达是更高的(图4B)。管家基因α-肌动蛋 白的表达与转基因甘蔗系中的以及未转化的野生型品系中的类似，证实了类 似量的模板cDNA被包含在RT-PCR反应中。

3.3酶活性的表征

3.3.1UMPS合成酶、UK以及UPRTase的酶活性

相比于从野生型甘蔗中获得的悬浮细胞和节间组织中的UMPS活性，证 实了从所有五个转基因甘蔗系中获得的悬浮细胞和节间组织两者是显著更 小的(图5)，证明了UMPS表达的成功的基于RNAi的靶向。相比之下发现， 相比于在从野生型甘蔗系中获得的悬浮细胞和节间组织中，在从所有五个转 基因甘蔗系中获得的悬浮细胞和节间组织中的补救途径酶UK的酶活性是显 著更低的(图6)，证明了嘧啶补救途径的上调。相比于从野生型甘蔗获得的 悬浮细胞和节间组织，从所有五个转基因甘蔗系中获得的悬浮细胞和节间组 织的UPRTase活性通常较低，其中来自转基因甘蔗系3.1、3.2、3.3和4.2的悬 浮细胞显示出显著更低的UPRTase活性(图7)。

3.3.2蔗糖合成酶(SuSy)的酶活性

分析从从转基因甘蔗系中获得的悬浮细胞和节间组织8-10的粗制的脱 盐的蛋白质提取物以测定SuSy活性。观察到在从转基因甘蔗系3.1、3.2和3.3 获得的悬浮细胞中在分解方向分析的SuSy活性总体上是增加的并且在转基 因甘蔗系2.2和4.2中总体上是降低的(图8)。观察到在从转基因甘蔗系3.1和 3.3获得的悬浮细胞中在合成方向分析的SuSy活性是总体上增加的并且在转 基因甘蔗系2.2、3.2和4.2中是总体上降低的(图8)。

然而，观察到在从所有转基因甘蔗获得的节间组织中在分解和合成方向 分析的SuSy活性是显著降低的(图9)。

在最大(V_max)和限制(V_lim)条件下评定转基因甘蔗系的悬浮细胞和 节间组织的SuSy活性并且与未转化的野生型品系进行比较。来自转基因甘蔗 系3.1和3.2的悬浮细胞的SuSy V_max显著高于未转化的野生型品系(表1)此 外，所有的转基因细胞系的V_max和V_lim两者显著高于对于未转化的野生型品 系所观察到的(表1)。

表1：在最大(V_max)和限制(V_lim)条件下从转基因甘蔗细胞系获 得的悬浮细胞和节间的蔗糖合成酶(SuSy)活性。以平均值的标准偏差的 μmol/min/mg蛋白来表示活性，n＝3。

3.3.3AGPase和UGPase的酶活性

证明了相比于从野生型甘蔗获得的悬浮细胞，从转基因甘蔗系2.2和3.1 获得的悬浮细胞的AGPase活性是显著更低的，而证明了从转基因甘蔗系3.1、 3.2和4.2获得的节间组织的AGPase活性是显著更低的(图10)。

证明了相比于从野生型甘蔗获得的悬浮细胞，从转基因甘蔗系2.2、3.2 和3.3获得的悬浮细胞的UGPase活性是显著更高的，而证明了从转基因甘蔗 系3.1、3.2、3.3和4.2获得的节间组织的UGPase活性是显著更低的(图11)。

3.3.4转基因甘蔗系中的蔗糖、己糖和淀粉积累

评定了UMPS表达的基于RNAi的靶向对于转基因甘蔗中的蔗糖、葡萄 糖、果糖和淀粉的积累、代谢产物的影响。观察到相比于在未转化的野生型 品系中，在所有转基因甘蔗系的悬浮细胞和节间组织两者中的蔗糖含量是显 著更高的(图12)，而在来自所有转基因甘蔗系的悬浮细胞中的淀粉含量是 显著增加的(图13)。观察到相比于未转化的野生型品系，在从转基因甘蔗 系3.2和4.2获得的节间组织中的淀粉含量是显著更高的(图13)。

还评定了转基因甘蔗系的葡萄糖和果糖含量，并且观察到在来自克隆 2.2和3.1的悬浮细胞以及克隆3.2的节间组织中的葡萄糖含量是显著增加的 (图14)。然而在转基因甘蔗系和未转化的野生型品系之间，观察到果糖含 量没有显著不同(图15)。

3.3.5利用线性相关的代谢产物分析

将蔗糖和淀粉含量对关键代谢产物作图以确定在悬浮细胞和节间组织 中的可能关系。观察到在悬浮细胞中的UDP-葡萄糖、磷酸己糖以及总尿苷 酸(UDP和UDP-葡萄糖)与所有转基因系中的蔗糖含量的增加呈正相关(R2 ＝0.68)，在蔗糖与磷酸己糖和总尿苷酸两者之间呈最强的正相关(分别是图 16B和D)。然而在蔗糖和己糖之间没有观察到显著相关，淀粉含量的变化与 磷酸己糖和总腺嘌呤核苷酸的增加呈正相关(图16E和F)。

观察到在所有转基因系中的节间中在蔗糖与总嘧啶核苷酸和磷酸己糖 之间的显著正相关(分别是图17A和B)。另一方面，证明了在所有植物中的 蔗糖与己糖和UDP-葡萄糖两者、以及淀粉与磷酸己糖和总腺嘌呤核苷酸两 者的非常弱的相关(图17)。

3.3.6利用线性相关的代谢产物和关键酶分析

将蔗糖和总嘧啶核苷酸含量对关键酶的活性作图以确定在悬浮细胞和 成熟节间组织两者中的可能关系。在悬浮细胞中，观察到在蔗糖含量与蔗糖 磷酸合成酶和尿苷激酶活性两者之间的显著正相关(分别是图18A和B)。然 而，在所有转基因系中，蔗糖含量的增加与UMP合成酶活性的变化呈负相关 (图18C；P＝0.665)。

在节间中观察到类似模式；蔗糖磷酸合成酶活性的上调与蔗糖的积累呈 正相关，而UMP合成酶活性的降低与蔗糖含量的变化呈负相关(图19A和B， 分别是P＝0.656和P＝0.784)。相比之下，尿苷激酶活性的增加不显示出与蔗 糖含量的增加显著相关；然而，尿嘧啶激酶的变化与总的尿苷酸的增加正相 关(分别是图19C和D)。

3.3.7甘蔗UMPS的生物信息学分析

对于展示出与甘蔗UMPS(TC68130)的DNA序列高度相似性的DNA序 列的BLAST搜索揭示了来自其他贮藏糖的植物(如甜高粱)的编码UMPS酶 的DNA(图16)。将甜高粱(XM_002456891.1)的DNA序列与甘蔗的进行比 对并且显示出高度相似性(85.5％)(图17)。

4.讨论

在以下所示的工作中，使用内含子剪接的发夹RNA载体技术来构建一种 RNAi载体，用于甘蔗胚性愈伤组织转化。产生了用ihpRNA载体(pihUMPS) 转化的五个品系。为了评定抑制的UMP合成酶的作用，测定了在围绕主要碳 水化合物、淀粉和蔗糖的途径的酶活性和代谢产物水平。PCR和RT-PCR分析 证实了构建体到甘蔗转基因系中的整合，并且表明转化系对应地具有降低的 UMP合成酶转录水平。蛋白质测定显示了高达62％的UMP合成酶活性抑制， 与未转化的野生型对照相比，这与在所有转基因系中所发现的转录物水平良好 相关。

这些数据证实的是，在转基因甘蔗植物中的UMP合成酶活性的抑制导致 了嘧啶补救酶(UK)之一的显著上调以及蔗糖、UDP-葡萄糖、淀粉、以及磷 酸己糖库浓度、连同SPS(负责蔗糖合成的主要酶)的增加。所述的工作展示 了获得一种具有更高的蔗糖和淀粉含量的甘蔗作物的方法。

然而，本领域的普通技术人员将理解的是，除了植物的碳水化合物含量 的改变之外，在本发明中所述的方法可以展示出另外的特征；将进一步理解 的是，在不偏离本发明的范围下可以针对本方法引入一些改变。

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