一株硫丹降解菌及其在土壤修复方面的应用

摘要

本发明公开了一株硫丹降解菌及其土壤修复应用。本发明所提供的硫丹降解菌是嗜根寡养单胞菌（

说明书

技术领域

本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体涉及一株高效降解硫丹的细菌及其在土壤环境污染修复中的应用。 

背景技术

农药作为一种重要的农业生产资料，在保护农业生产、提高农业综合生产能力、促进粮食稳定增产和农民持续增收等方面发挥着极其重要的作用。中国既是农药生产大国，也是使用大国，年使用量和平均用量分别约为120万吨和2.34 kg/ha，位列世界第一。然而，农药的利用率却仅为10-20%，其余部分全部进入土壤、水体和大气，造成了严重的污染。据统计，全国受农药残留污染的农田约有1300-1600万公顷，占可耕面积的10%；近半数蔬菜农药残留超标，每年因农残超标问题蒙受出口损失近80亿美元。 

我国自20 世纪50 年代开始发展有机氯农药，主要包括六六六、艾氏剂、狄氏剂、氯丹和七氯等产品，它们曾在工农业生产中发挥重大作用。但由于这类化合物在食物链中有着极强的富集作用，是重要的环境类激素和持久性有机污染物，大部分已停止生产和使用。至今，此类农药残留仍在不断威胁国民健康，制约农业经济良性发展。 

硫丹（Endosulfan）由α和b硫丹组成，商品名为赛丹（Thionex）、硕丹（Thiodan），是一种高效广谱有机氯杀虫剂，价格相对低廉，广泛用于茶叶、棉花、果树和蔬菜等作物的虫害防治。硫丹属高毒农药，对动物尤其是鱼类有毒，会损害动物的中枢神经系统、免疫系统、生殖系统，以及脑、肝和肾等器官。硫丹残留期长，是有机氯杀虫剂中环境残留浓度最高的几类品种之一，具有生物富集作用，在土壤中的半衰期长达6-11个月。 

目前，通过人工富集培养等技术，已经分离出许多具有降解有机氯农药化合物能力的细菌和真菌。其中，细菌由于具有适应能力强、繁殖快和降解快速等特点占据主要地位。然而，已分离到的具硫丹降解能力的高效降解菌仍十分有限，绝大多数菌株无法于10日内实现对100 mg/L硫丹的完全降解，且降解产物多为毒性更大、残留期更长和环境危害更大的硫丹硫酸盐（Endosulf sulfate）。李文等人曾报道过一株具硫丹降解能力的高效苍白杆菌（C7），但该菌株对50 mg/L硫丹的降解能力在90.2%左右，无法实现完全降解（降解速率为每日5.64 mg/L）（李文，彭香，张京顺，张琛，闫艳春。硫丹降解菌的筛选及降解性能研究。山东农业科学，2009,1：67-70）。已报道降解速率最高的菌株为绿色木霉（Trichoderma viride）H082，该菌株能够于7日内高效降解100 mg/L硫丹，降解率达95%（竺利红，吴吉安，孙东昌，施跃峰。硫丹降解菌H082的分离、筛选和抑菌性能研究），但无法实现完全降解。此外，菌株H082属丝状真菌，与细菌菌株相比，存在以下明显不足：1）生长速率迟缓。细菌工业发酵一般介于2-3天，而丝状真菌发酵则不少于4日，多介于6-8日。就一般工业发酵而言，细菌发酵液菌体浓度可达1-5×10⁹ CFU/mL（CFU，菌落形成单位），而真菌固体发酵孢子数则要低一个数量级；2）发酵设备通用性差。丝状真菌发酵多采用固体发酵床或发酵罐，设备通用性差。细菌发酵用发酵罐除可生产菌体外还可用于次生代谢物生产，如抗生素、色素和维生素等，通用性能良好；3）菌剂施用效果相对迟缓。细菌菌剂喷施后，细菌直接作用于农药残留，而丝状真菌孢子则需待萌发、形成菌丝后方可作用。此外，上述二株降解菌的硫丹代谢产物、抗生素抗性和重金属耐受性等均尚未探明，存在一定的环境施用风险。综上所述，筛选高效、耐受重金属、对抗生素敏感，且降解产物非硫丹硫酸盐的硫丹降解细菌成为了研究热点。 

发明内容

本发明的目的是针对上述现有硫丹微生物对硫丹降解存在的无法于10日内实现对100 mg/L硫丹的完全降解，且降解产物多为毒性更大、残留期更长和环境危害更大的硫丹硫酸盐（Endosulf sulfate）的缺陷，提供一种高效硫丹降解菌。 

本发明的另一个目的是提供上述菌种在修复硫丹污染土壤中的应用。 

本发明的上述技术问题是通过以下技术方案得以实施的： 

一株硫丹降解菌，该菌是嗜根寡养单胞菌（Stenotrophomonas rhizophila）的菌株LD-6，于2012年3月2日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCC No.5839，该菌具有高效降解硫丹的能力。保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所，该菌的分类命名为嗜根寡养单胞菌Stenotrophomonas rhizophila。 

一种所述硫丹降解菌在受硫丹污染土壤修复中的应用。 

作为优选，将所述菌株CGMCC No.5839接种至含硫丹50-100 mg/L的基础无机盐液体培养基中，120 r/min震荡培养48h以上，所述的基础无机盐液体培养基成份为（g/L）：MgCl₂ 0.2，NH₄NO₃ 1，KH₂PO₄ 2，K₂HPO₄ 7.5，NaCl 1，硫丹 0.1，去离子水1 L。 

作为优选，所述的液体培养温度为25-30℃，基础无机盐液体培养基的pH为 5.4-6.8。 

作为优选，所述的液体培养温度为30℃。 

作为优选，将所述菌株CGMCC No.5839接种至发酵培养基中30℃恒温培养24小时以上，得到菌体发酵液，对受硫丹污染的土壤喷施菌体发酵液进行降解；发酵培养基的成份为（g/L）：玉米粉10 g/L，豆粕粉8 g/L，(NH₄)₂SO₄ 6 g/L，玉米浆6 g/L，MgSO₄·7H₂O 1 g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2 g/L，MnSO₄ 0.05 g/L，pH 7.2。 

本发明所提供的硫丹降解菌Stenotrophomonas rhizophila LD-6源自浙江桐庐农药厂排污口附近淤泥，经人工富集培养、压力筛选和分离纯化得到。该菌属嗜根寡养单胞菌，其系统发育地位分析如图1所示。其生理生化特征为：革兰氏染色阴性，接触酶阳性，氧化酶阴性，V. P.试验阴性，吲哚试验阴性，专性好养，能够在4℃生长，但无法存活于40℃，能够以木糖为碳源，菌体形态为短杆状，菌落呈浅黄色、圆形、边缘齐整、光滑湿润，菌株16S rDNA的GenBank登录号为JQ670922，于2012年3月2日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，编号为CGMCC No.5839。 

该菌的最适生长条件为：pH 7.2，温度为30℃。以五分之一LB（Luria-Bertani）或工业发酵培养基（玉米粉10 g/L，豆粕粉8 g/L，(NH₄)₂SO₄ 6 g/L，玉米浆6 g/L，MgSO₄·7H₂O 1 g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2 g/L，MnSO₄ 0.05 g/L，pH 7.2）培养24-36小时后，菌液浓度可达5-8×10⁹ CFU/mL。 

该菌对四环素和卡那霉素敏感，二者皆为常用抗生素。可以认为：当菌体被释放到自然环境中时，不会因抗（耐）药性问题而产生超级细菌或在土著菌间传播。 

该菌对白色念珠菌（Candida albicans）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）、黄萎病菌（Verticillium dahliae）、小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）和辣椒枯萎病菌（Fusarium oxysporum）呈现明显抑制作用。可以认为：菌体施用后，能够在一定程度上起到抑制或减轻植物病害发生的作用。 

该菌对13种测试金属离子（Li⁺、Ag⁺、Cu⁺、Cu²⁺、Hg²⁺、Ba²⁺、Pb²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺和Co4⁺）呈现不同程度的耐受性。鉴于我国土壤污染现状——持久性有机污染物污染和重金属污染并存，农残降解菌株具备重金属耐受性能十分重要。可以认为：一般土壤环境条件下，该菌体施用修复效果受重金属抑制影响较小。 

该菌株在摇瓶降解试验中（容积为250 mL的三角瓶，装有100 mL液体无机盐培养基，硫丹浓度为100 mg/L，摇床转速为160 r/min，温度为30℃），能在10天内将硫丹完全降解（降解速率为每天10 mg/L），代谢产物为硫丹醚和硫丹二醇，二者毒性远小于硫丹，且环境降解快速。在土壤硫丹含量为50 mg/kg情况下，施用该菌28天可使供试土样中68.6%的硫丹发生降解，显著提升硫丹降解速率、缩短降解时长，具备实际应用意义和价值。 

该菌是已报道降解菌中，唯一一株具备硫丹降解能力的嗜根寡养单胞菌。 

 综上所述，本发明和现有技术相比具有如下优点： 

与现有技术相比，本发明的Stenotrophomonas rhizophila LD-6是第一株具备硫丹降解能力的嗜根寡养单胞菌，可在好氧条件下以硫丹作为唯一碳源和硫源进行生长繁殖，同时将其快速降解。在纯培养条件下，它能将浓度为100 mg/L的硫丹在10天内降解完全。与已有硫丹降解菌株相比，该菌在具备更高硫丹降解速率（仅次于上述绿色木霉H082）的同时，对常用抗生素敏感，能耐受13种重金属，对多种植物病原微生物存在抑制作用，降解产物低毒或无毒，工业规模化发酵生产便捷、发酵液菌体浓度高（优于绿色木霉H082），且具备在实际土壤环境条件下发挥硫丹降解作用的能力，该菌株有望在硫丹污染土壤的生物环境修复中发挥重要作用。

附图说明

图1、菌株LD-6的系统发育地位分析。 

图2、菌株LD-6的降解能力测试，其中■：α硫丹；▲：b硫丹；◆：α和b硫丹之和。 

图3、菌株LD-6土壤环境中的硫丹降解情况，其中□：灭活土样中α硫丹含量（对照）；■：喷施LD-6菌体灭活土样中α硫丹含量；△：新鲜土样中α硫丹含量（对照）；▲：喷施LD-6菌体新鲜土样中α硫丹含量；◇：灭活土样中b硫丹含量（对照）；◆：喷施LD-6菌体灭活土样中b硫丹含量；○：新鲜土样中b硫丹含量（对照）；●：喷施LD-6菌体新鲜土样中b硫丹含量。 

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。 

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。 

实施例1：Stenotrophomonas rhizophila LD-6的分离与硫丹降解能力 

       现场采集浙江桐庐农药厂排污口附近的淤泥，用150 mL三角瓶盛装，并迅速带回实验室。将取回的样品置于硫丹选择性基础无机盐液体培养基中驯化培养。培养基成份为（g/L）：MgCl₂ 0.2，NH₄NO₃ 1，KH₂PO₄ 2，K₂HPO₄ 7.5，NaCl 1，硫丹 0.1，去离子水1 L，pH 6.8，115℃湿热灭菌30分钟后备用。培养条件为：28℃，120 r/min震荡培养，容器装液量为容器容积的1/3。此后，每隔6-7天将摇瓶静止片刻，弃上清液，随后补入等量的新鲜配置的选择性液体培养基并继续震荡富集培养。四周后，将上述培养物均匀涂布于固体选择性基础无机盐培养基（每升液体培养基中再加入20克的琼脂）上。将涂布好的平板倒置后放入培养箱，28℃培养72小时。用无菌牙签挑选单菌落或用接种针划线直至出现单菌落再行转接至新鲜配置的固体选择性平板上，并通过气相色谱法逐一验证各菌株的硫丹降解能力，结果得到一株硫丹降解菌LD-6。

以OD₆₀₀值为0.5的接种量将菌株LD-6接入以100 mg/L 硫丹为唯一碳源和硫源的选择性基础无机盐培养基中，30℃，160 r/min震荡培养。随后，每隔2天对培养基中硫丹的残留情况进行测试，结果如图2所示。从中可看出菌株LD-6可以硫丹为唯一碳源和硫源进行生长，同时实现对硫丹的完全降解。 

本实施例说明分离得到的Stenotrophomonas rhizophila LD-6可利用硫丹作为唯一碳源和硫源进行生长繁殖，并具有高效降解硫丹的能力。 

实施例2：Stenotrophomonas rhizophila LD-6的抗药性实验 

采用滤纸片法，选择四环素和卡那霉素进行测试，以各抗生素滤纸片（30 μg/片）在培养降解菌LD-6平板上的抑菌圈直径大小，作为敏感或者耐药的判定标准。试验结果表明，抑菌圈直径分别为24和16 mm，呈中度敏感反应（中度敏感范围为：四环素23-25 mm；卡那霉素14-22 mm）。

本实施例说明当菌体被释放到自然环境中时，不会因抗（耐）药性问题而产生超级细菌或在土著菌间传播，为其今后的实际应用提供了安全保证。 

实施例3：Stenotrophomonas rhizophila LD-6的重金属最小抑制浓度（MIC）测试 

MIC测试设计参照Filali等人的研究进行（Filali B.K.，Taoufik J.，Zeroual Y.，Dzairi F.Z.，Talbi M.，Blaghen M. Waste water bacterial isolates resistant to heavy metals and antibiotics. Current Microbiology，2000，41(3)：151-156），挑取等大、经活化处理的LD-6单菌落于培养试管中，30℃，160 rpm振荡培养48小时。依菌体长势判定MICs，每组设3个重复，分别测试该菌对13种金属离子的耐受情况。结果如表1所示，该菌株具多重耐受性，耐受性强。

实施例4：Stenotrophomonas rhizophila LD-6的植物病原菌抑制试验 

参照竺利红等人报道的方法（竺利红，吴吉安，孙东昌，施跃峰。硫丹降解菌H082的分离、筛选和抑菌性能研究）进行菌株LD-6的抑菌能力测试。结果如表2所示，该菌株对多种供试病原菌呈现抑制作用。本实施例说明菌体施用后，能够在一定程度上起到抑制或减轻植物病害发生的作用。

注：+ 抑菌率50-80%；++ 抑菌率80%以上。 

  

实施例5：Stenotrophomonas rhizophila LD-6降解土壤中硫丹的试验

将菌株LD-6在发酵培养基中30℃恒温培养24小时后，得到菌体发酵液。发酵培养基的成份为（g/L）：玉米粉10 g/L，豆粕粉8 g/L，(NH₄)₂SO₄ 6 g/L，玉米浆6 g/L，MgSO₄·7H₂O 1 g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2 g/L，MnSO₄ 0.05 g/L，pH 7.2。

在无菌水中加入一定量的硫丹（硫丹预溶于丙酮之中），在摇床上充分震荡混匀后，浸泡待试土壤（供试土壤为pH 5.4的潮土），使土壤颗粒能够均匀的吸附硫丹，硫丹含量为50 mg/kg。喷施菌体发酵液，搅拌均匀，使土样中LD-6菌体浓度约为1×10⁸ 个/g。土壤水分含量控制在60%左右，恒温25℃。同时，参照Li Wen等人研究（Li W.，Dai Y.，Xue B.B.，Li Y.Y.，Peng X.，Zhang J.S.，Yan Y.C. Biodegradation and detoxification of endosulfan in aqueous medium and soil by Achromobacter xylosoxidans strain CS5. Journal of Hazardous Materials，2009，167：209-216），设置对照。随后，每隔7天取5 g土样测算硫丹降解情况。 

结果如图3所示，28天供试土样中有68.6%的硫丹发生降解，喷施LD-6能够显著提升硫丹降解速率、缩短降解时长，具备实际应用意义和价值。