一种中药注射液致敏性的检测评价方法

摘要

本发明提供了一种中药注射液致敏性的检测评价方法，该方法是将中药注射液制剂经1至3KD超滤富集制备致敏性的大分子部位，然后将大分子部位加入到单个核细胞(PBMC)溶液中，共培养1至3天，然后采用优选的台盼蓝或荧光染料染色活细胞数目，以计算、评价中药注射液的致敏性强度。该方法具有方便、快捷和灵敏的优势，可广泛适用于各种中药注射液致敏性、刺激性的评价和检验，可为中药注射液的安全性评价，中药注射液的质量控制，为保证临床用药的安全性，提供科学的依据。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测方法，具体设计一种广泛适用于中药注射液致敏性、刺激性的检测 评价方法。

背景技术

中药注射液是中药现代化发展中开发出来的一种现代中药制剂，临床使用疗效显著，广 泛用于呼吸、心脑血管等领域，并取得了良好的市场经济效益。但是中药注射液在临床使用 时经常有不良反应发生，具有安全隐患。临床经常使用的中药注射液品种，如双黄连、清开 灵、板蓝根、鱼腥草、穿琥宁、脉络宁、葛根素、复方丹参等品种，均有不良反应报道。

不良反应类型多样，最常发生的是药物性过敏。例如，双黄连注射液中金银花含有绿原 酸、清开灵中的角类成分容易造成过敏。溶血反应也常见于中药注射液不良反应，例如鱼腥 草注射液中吐温-80超标容易引起溶血。此外，还涉及神经系统、消化系统、心血管系统、 感觉器官、泌尿系统、皮肤及其附件等多个系统的不良反应。严重限制了该类品种的用药安 全和新药开发。

对于中药注射液中致敏性物质，有效的检验和检测方法对于控制其不良反应至关重要， 但是当前尚缺乏高效灵敏的化学检测方法。因此，很有必要在现有技术的基础之上研究开发 出一种可靠有效的中药注射液致敏性、刺激性的检测评价方法。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是克服现有技术不能有效检测中药注射液中致敏 性的不足，提供一种适用范围广泛，高效、稳定，操作方便、快捷，结果准确的中药注射液 致敏性、刺激性的检测方法。

技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：

(1)使用截留分子质量为1KD至3KD超滤膜富集中药注射液中具有刺激性的大分子部 位，备用；

(2)将步骤(1)制备得到的刺激性的大分子部位加入到脏器或外周血液来源的单个核细胞 (PBMC)中，共培养1至3天；

(3)取步骤(2)培养后的单个核细胞采用台盼蓝染液染色或荧光染料染色，计数细胞的数目 或功能状态来检测和评价中药注射液的致敏性。

作为优选方案，以上所述的中药注射液致敏性的检测评价方法，步骤(1)中药注射液富 集的倍数为1至10000倍，作为更优选的技术方案，本发明中药注射液富集的倍数为20至 60倍。

作为优选方案，以上所述的中药注射液致敏性的检测评价方法，步骤(2)刺激性的大分子 部位加入到脏器或外周血液来源的单个核细胞(PBMC)中培养2至3天。本发明通过大量 实验筛选刺激性的大分子部位在单个核细胞(PBMC)中培养时间，实验结果表明，当培养 48至72小时小时，能够使单个核细胞在刺激性的致敏原下，细胞增殖达最高。

作为优选方案，以上所述的中药注射液致敏性的检测评价方法，其中所述的单个核细胞 PBMC细胞可以是人源或其它实验动物来源，可来自外周血液或脏器的免疫细胞。

作为优选方案，以上所述的超滤膜可以使用工业超滤膜，也可使用商业的超滤离心管， 中药制剂在生产和存放过程中可能产生微量的致敏物质，研究需要高浓度的致敏物质。而 超滤是一种有效排除小分子干扰的技术，而且3KD的超滤管可截留并富集到高浓度致敏物， 具有损耗小、效率高、操作便捷的优点。

中药注射液制剂致敏性的检测方法是一个关键性的问题，本发明提供的中药注射液致敏 性的检测评价方法，创造性的采用单个核细胞PBMC激活为模型，PBMC细胞含有抗原递呈 细胞，可识别并加工致敏原及类过敏原(如鞣质)与血清蛋白结合成全抗原的抗原信息，并递 呈给PBMC中的T、B淋巴细胞。最后通过细胞数量或活力测定来评价注射液致敏物的刺激 性，具有操作可靠性强，实验稳定性好等优点。

本发明提供的中药注射液致敏性的检测评价方法，由于富集的大分子部位有较深的颜 色，采用MTT法检测细胞活性有明显干扰，误差较大，实验结果不准确。本发明通过大量 实验筛选，采用台盼蓝和荧光染色测定PBMC细胞活力；作为优选方案，荧光探针可以是 Hochest、PI等多种荧光探针，优化的检测方法是用荧光显微镜或荧光酶标仪检测，具有检 测灵敏，高效的优点。

有益效果：本发明提供的中药注射液致敏性的检测评价方法和现有技术相比，具有以下 优点：

本发明提供的中药注射液致敏性的检测评价方法，通过大量实验，优选出大分子的富 集倍数，创造性的采用单个核细胞PBMC为激活模型，并优选出大分子致敏性物质在单个核 细胞PBMC中的培养时间，并采用优选的台盼蓝染液染色或荧光染料染色法来计数细胞的数 目或功能状态，具有可操作性强，方便、快捷、高效、检测结果准确，可广泛适用与各种中 药注射液，中间体等的致敏性的检测评价，克服了现有技术中致敏性的检测的诸多不足，本 发明可为中药注射液的安全性评价，中药注射液的质量控制，为保证临床用药的安全性，提 供科学的依据，具有重要的社会效应。

具体实施方式：

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用 于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修 改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

实施例1热毒宁注射液致敏性检测

一、方法

1、超滤富集中药注射液致敏性部位

分别取已知出现不良反应的热毒宁注射液(批号：100808、111011、101105、101114) 和待测样品的热毒宁注射液(批号：110709、120207、120210、120211)各100ml，分别加 入到截留分子量为3KD的超滤管，3500转离心40min，经反复超滤，剩余5ml溶液，分别得 到以上各批号的20倍浓缩富集的大分子致敏性部位，灭菌，4度保存。

2、脾单个核细胞PBMC与刺激性部位共培养

取ICR小鼠断头处死，放置在75％酒精中浸泡2分钟后取出，打开腹腔取出脾脏，置于 培养皿中，剪碎后用针芯挤压分散，用PBS(5ml)吹打分散为细胞悬液，然后过300目滤 网，然后与等量PBS溶液混匀，过筛液1500转/分钟离心10分钟，弃上清后加入2ml红细 胞裂解液混匀后，在1000转/分钟离心8分钟，弃上清后加入PBS，混匀后1000转/分钟离 心8分钟，并重复一次，弃上清液得脾单个核细胞PBMC，数细胞数并复溶于全培(10％胎 牛血清的1640)，计数备用。

调节PBMC浓度为1×10⁶cells/ml，以100μl/well接种于96孔细板，加入1富集得到的不 同批号的热毒宁注射液的致敏性大分子部位20μl，对照组加入20μl注射用水，10μl胎牛血 清和70μl的10％1640。然后将96孔细板放置37℃、5％CO2条件下培养72h。

3、致敏性检测

取与刺激性部位共培养的脾单个核细胞PBMC，进行台盼蓝染色和Hochest33342荧光染 色。

台盼蓝染色：每孔中加入0.04％台盼蓝染液20μl，混合5分钟，混匀后，吸取20μl加入 血球计数板计数活细胞数目。

荧光染色：1.5ml离心管收集培养72h后的PBMC，加入5μg/ml的Hochest33342，在37℃、 5％CO2培养30min后，1500转/分钟离心5min，PBS洗涤细胞，涂于载玻片，荧光显微镜观 察。

以中药注射液对细胞刺激性倍数来反映其致敏性的强弱。

刺激性倍数＝(中药制剂组细胞数-对照组细胞数)/对照组细胞数

二、结果

对已知具有临床不良反应出现的成品进行20倍的超滤浓缩，采用上述建立的PBMC致敏 性检测方法检测。结果表明，与正常对照组比较，已知出现不良反应的热毒宁(批号：100808、 111011、101105、101114)均有显著的刺激性(**P＜0.01)，刺激倍数分别为2.4、3.4、4.03 和2.63。证明本发明提供的检测方法的准确性和可靠性。

待测样品热毒宁(批号：110709)对鼠PBMC未见有明显刺激性。而热毒宁(批号： 120207、120210、120211)均检测出有一定弱刺激性，具体实验结果如表1所示。

表1临床出现不良反应的热毒宁和待检验热毒宁对PBMC刺激性(x±s，n＝5)

^**P＜0.01，与正常对照组比较

实施例2丹参、黄芪、生脉、葛根素、血塞通注射液致敏性检测

一、方法

1、超滤富集中药注射液致敏性部位

取丹参、黄芪、生脉、葛根素、血塞通注射液各100ml，加入到截留分子量为3KD超滤 管，3500转离心40min，经反复超滤，分别获得20和60倍浓缩富集的大分子致敏性部位， 灭菌，4度保存，备用。

2、脾单个核细胞PBMC与刺激性部位共培养

取ICR小鼠断头处死，放置在75％酒精中浸泡2分钟后取出，打开腹腔取出脾脏，置于 培养皿中，剪碎后用针芯挤压分散，用PBS(5ml)吹打分散为细胞悬液，然后过300目滤 网，然后与等量PBS溶液混匀，过筛液1500转/分钟离心10分钟，弃上清后加入2ml红细 胞裂解液混匀后，在1000转/分钟离心8分钟，弃上清后加入PBS，混匀后1000转/分钟离 心8分钟，并重复一次，弃上清液得脾单个核细胞PBMC，数细胞数并复溶于全培(10％胎 牛血清的1640)，计数备用。

调节PBMC浓度为1×10⁶cells/ml，以100μl/well接种于96孔细板，加入上述制备得到 的丹参、黄芪、生脉、葛根素、血塞通注射液的20倍和60倍的富集致敏性大分子部位各20μl， 对照组加入20μl注射用水，10μl胎牛血清和70μl的10％1640。然后将96孔细板置37℃、5％CO2 条件下培养72h。

3、致敏性检测

取上述各刺激性部位共培养的脾单个核细胞PBMC，分别进行台盼蓝染色和 Hochest33342荧光染色。

台盼蓝染色：每孔中加入0.04％台盼蓝染液20μl，混合5分钟，混匀后，吸取20μl加入 血球计数板计数活细胞数目。

荧光染色：1.5ml离心管收集培养72h后的PBMC，加入5μg/ml的Hochest33342，在37℃、 5％CO2培养30min后，1500转/分钟离心5min，PBS洗涤细胞，涂于载玻片，荧光显微镜观 察。

以中药注射液对细胞刺激性倍数来反映其致敏性的强弱。

刺激性倍数＝(中药制剂组细胞数-对照组细胞数)/对照组细胞数

二、结果

对丹参、黄芪、生脉、葛根素、血塞通注射液成品建立PBMC致敏性检测方法检测。表 2的实验结果表明，与正常对照组比较，葛根素注射液有显著的刺激性(^**P＜0.01)，刺激 倍数为3.1。黄芪注射液也检测出有一定弱刺激性(^*P＜0.05)。丹参、生脉和血塞通注射液 在20倍富集浓度未见有明显刺激性。但是将丹参、黄芪、生脉、葛根素、血塞通注射液致 敏部位的浓度富集至60倍时均可检出有致过敏和刺激性。其中刺激和致敏性的强弱顺序 为：葛根素＞黄芪＞生脉＞丹参＞血塞通。具体实验结果如表2所示：

表2丹参、黄芪、生脉、葛根素、血塞通注射液对PBMC刺激性的测试结果

通过以上实验结果表明，本发明提供的中药注射液致敏性的检测评价方法，具有可操 作性强，检测结果准确可靠，方便、快捷，可广泛适用与各种中药注射液，中间体等的致敏 性的检测评价，为中药注射液的安全性评价，中药注射液的质量控制，为保证临床用药的安 全性，提供科学的依据。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明原理和构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视 为本发明的保护范围。