一种抗猪伪狂犬病病毒的杂交瘤细胞系及其制备方法和一种单克隆抗体及其应用

摘要

本发明涉及一种抗猪伪狂犬病病毒的杂交瘤细胞系及其制备方法和一种单克隆抗体及其应用，其中抗猪伪狂犬病病毒的杂交瘤细胞系具体由以下方法获得：（1）用PRV制得抗原免疫BALB/c小鼠；（2）用免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合；（3）经筛选获得分泌抗PRV单克隆抗体的杂交瘤细胞。本发明采用Sepharose4FF层析柱纯化得到了高纯度的PR抗原，保证后续阳性克隆的筛选和抗体的产生，确立了间接ELISA法快速测定单抗的产生与效价，通过接种BALB/c雌性小鼠腹腔获取了大量PRV单抗，该抗体是针对PR病原的单一抗体，具有特异性强、纯度高、均一性好等优点，可用于PR的诊断和治疗，同时为其他类型单抗的制备提供了一定的技术借鉴。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术-单克隆抗体领域,本发明涉及一种抗猪伪狂犬病病毒的杂交瘤 细胞系及其制备方法；此外，本发明还涉及该单克隆抗体的制备及其应用。

背景技术

猪伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由疱疹病毒科、a-疱疹病毒亚科的伪 狂犬病病毒(Pseudorabies Virus,PRV)引起的急性传染病，该病毒抵抗力较强，病毒 在pH4～9之间保持稳定。保存在50%甘油盐水中的病料,在0℃～6℃下经154天后,感 染力仅轻度下降,保存到3年仍具有感染力。。在磷酸盐缓冲液和葡萄糖盐水中10天以上 仍具有感染性。在腐败条件下,病料中的病毒经11天失去感染力。用0.5％石炭酸处理 32天后仍具有感染性，对乙醚、氯仿等脂溶剂以及福尔马林和紫外线照射敏感。可致妊娠 母猪流产、产死胎及胎儿干尸化。对初生子猪则引起运动失调、麻痹等神经症状，病死率 100%。成年猪多呈隐性感染，但可引起呼吸道症状。本病一年四季都可发生，病猪、带毒 猪及带毒鼠类是本病的主要传染源，病毒主要从病猪的鼻分泌物、唾液、乳汁和尿中排出， 有的带毒猪可持续排毒1年。

猪伪狂犬病最早在1813年发生于美国,1910年证实为病毒病。目前已查明,本病遍 布世界各地,据不完全统计,已有44个国家发生,且疫情仍在不断扩大,多数动物呈致 死性感染,极少康复,猪感染本病后出现急性或亚急性临床症状,其症状与病毒的毒力 强弱和猪只年龄大小有关。在我国,1948年从猫体中分离出伪狂犬病毒,此后有关于猪、 牛、羊、犬、猫、水貂和进口狐狸等动物感染的报道,并陆续分离出多株伪狂犬病毒。本 病多呈地方流行,也有零星散发。近几年来,随着诊断方法的不断建立和诊断技术的不断 提高,病例报道数上升,甚至断奶仔猪出现奇痒症状,表明伪狂犬病在流行过程中有毒 力增强的迹象,它所引起的经济损失仅次于口蹄疫和猪瘟,每年由该病造成的经济损失可 达几十亿美元。

猪伪狂犬病目前无特效治疗药物，对感染发病猪可注射猪伪狂犬病高免血清，它对断 奶子猪有明显疗效，但是常规高免血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋 白质成分，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦，而针对单一抗原制备而成的单克 隆抗体能提高免疫学检测和临床治疗的特异性和精确性,在兽医界,单克隆抗体试剂盒已 成为很多动物疫病等诊断和检疫的重要工具。

单克隆抗体指来自一个淋巴细胞的单克隆杂交瘤细胞株所分泌的、针对同一抗原决定 簇的抗体。基本的过程包括：给小鼠注射一种抗原，它可以被免疫系统识别，从而诱导小 鼠的淋巴细胞产生相应抗体；然后在培养基中融合小鼠的淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞，产 生杂交瘤细胞，经过筛选分离出单个杂交瘤细胞；再使单个杂交瘤细胞扩增，最后分离、 纯化抗体。1975年，Kohler和Milstein创立了杂交瘤技术制备单克隆抗体。与常规的血清 抗体的性质相比，单抗的纯度更高，特异性更好，因而在实验室诊断方面有更高的应用价 值。从20世纪80年代至今，单抗研制一直是兽医界研究的一个热门课题，研制成功的单 抗所针对的抗原来源和种类己覆盖了大多数常见传染病，尤其是在病毒方面，单抗在病毒 抗原结构的定位、中和表位分析、免疫学诊断和抗病毒治疗方面已得到或正在进行广泛的 应用。

李富强等人在《中国兽医杂志》2000年(第26卷)第10期第8-10页发表了《分泌抗猪 伪狂犬病病毒(北京株)单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立》，报道了用纯化的猪伪狂犬病病毒 免疫Balb/c小鼠，取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经间接ELISA筛选，3次有限稀释 法克隆，获得了2株能稳定分泌抗伪狂犬病病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株1H7和3B5。经 鉴定1H7和3B5均为IgG1亚类、Kappa型轻链，细胞培养液上清及腹水效价分别为1:1024、 1:1024和1:108、1:107；1H7、3B5单克隆抗体不与猪繁殖-呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、 猪细小病毒发生交叉反应，显示良好的特异性。

黄红亮等人在《中国兽医学报》2004年5月第24卷第3期第243-245页发表文章《抗 伪狂犬病病毒gG蛋白单克隆抗体的制备及鉴定》，报道了以大肠杆菌表达的猪伪狂犬病病 毒(PRV)gG蛋白为抗原，免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、克隆后，获得了IF6、2B9两株 稳定分泌抗伪狂犬病病毒gG蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。经间接ELISA鉴定，1F6、 2B9分别属于IgGz、IgG亚类，效价高。其与猪伪狂犬病病毒Ea株感染细胞的间接免疫 荧光试验结果表明，1F6、2B9确实为伪狂犬病病毒gG蛋白的单抗，所得单抗与牛传染性 鼻气管炎病毒(IBRV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸道综合征病毒(PRRSV)之间无交叉 反应。

郭丽静在其硕士毕业论文《猪伪狂犬病毒gD和gE基因的原核表达及单克隆抗体的研 制》中记述了分离、鉴定猪伪狂犬病病毒(JS株)并探索了猪体内病毒核酸的分布规律；利 用大肠杆菌表达系统表达了PRVgD和gE蛋白；并研制出针对PRV的特异性好、效价高 的单克隆抗体，为建立特异性强、敏感性高、简便、快速的PRV诊断方法提供了条件。

吕蔚在其硕士毕业论文《伪狂犬病毒闽A株单克隆抗体的制备及初步鉴定》中记述了 伪狂犬病毒闽A株单克隆抗体的制备过程。其中，用PK-15细胞培养的伪狂犬病毒闽A 株(PRV-FA)经差速离心和蔗糖密度梯度离心，纯化抗原；同时制备伪狂犬病毒细胞培养物 和鸡胚培养物，用伪狂犬鸡胚培养物作为免疫原来免疫BALB/c小鼠，而用纯度更高的伪 狂犬病毒的细胞培养物作为间接ELISA的包被抗原建立间接ELISA，用来筛选融合后的杂 交瘤细胞，尽可能的避免非特异性蛋白对筛选的干扰，降低假阳性的几率，提高阳性株筛 选的效率和准确性。取免疫BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合应用间接ELISA 筛选，经过3次有限稀释法克隆，获得了两株能稳定分泌抗伪狂犬病毒蛋白的单克隆抗体 杂交瘤细胞株，命名为4G9E9，1H9C9，随后对这两株单克隆抗体杂交瘤细胞株进行鉴定， 经鉴定这两株杂交瘤细胞株均为IgG1亚类，4G9E9和1H9C9杂交瘤细胞培养上清及小鼠 腹水单克隆抗体的ELISA效价分别为1:6400和1:12800以及1:25600和1:102400。两株单 克隆抗体与猪繁殖呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、乙脑病毒、细小病毒均不发生交叉反应， 显示了良好的特异性。连续培养15代，2株杂交瘤细胞株仍能稳定分泌抗体且效价不变。 腹水经硫酸铵沉淀法处理后，测得纯化后其蛋白含量为2.412mg/mL。这两株单克隆抗体杂 交瘤细胞株的获得为下一步建立针对PRV的快速诊断方法的建立奠定基础。

而以上常规PRV单抗制备多用原核表达的重组蛋白或培养的全病毒作为免疫原,但是 重组蛋白存在复性困难,缺乏空间构象表位的缺点,全病毒存在不易纯化的缺点。常规全 病毒工业化纯化多用凝胶过滤纯化方法,此法不能完全去除来源病毒培养过程中的血清 蛋白和细胞宿主蛋白,如需获得进一步纯化的病毒则需进行密度梯度离心等处理,尽管如 此,如在病毒样品中混有其它物理性质相似的抗原,则仍不能将其去除。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种抗猪伪狂犬病的杂交瘤细胞系，该单克隆抗体可特异性 的与PRV结合，能准确快速诊断PR。

本发明的目的之二是提供一种抗猪伪狂犬病的杂交瘤细胞系的制备方法。

本发明的目的之三是提供一种单克隆抗体及其在定性检测PR中的应用。

为了实现上述目的，本发明技术方案采用了一种抗猪伪狂犬病病毒的杂交瘤细胞系， 具体由以下方法获得：（1）用PRV制得抗原免疫BALB/c小鼠；（2）用免疫小鼠脾细胞与 SP2/0骨髓瘤细胞融合；（3）经筛选获得分泌抗PRV单克隆抗体的杂交瘤细胞。

还包括：阳性克隆的筛选；阳性克隆的稳定化培养；单克隆抗体腹水的制备和纯化及 单抗的检测。

本发明的技术方案还采用了一种抗猪伪狂犬病病毒的杂交瘤细胞系的制备方法,包括 步骤：（1）用PRV制得抗原免疫BALB/c小鼠；（2）用免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细 胞融合；（3）经筛选获得分泌抗PRV单克隆抗体的杂交瘤细胞。

步骤（1）所用PRV用BHK-13细胞增殖，采用超滤的办法进行浓缩，采用Sepharose 层析柱对抗原纯化，复合ELISA检测效价的可作为PRV单抗制备免疫原。

另外，本发明的技术方案还采用了一种抗猪伪狂犬病病毒的杂交瘤细胞系分泌的抗猪 伪狂犬病病毒单克隆抗体。

小鼠淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合用450g/L的PEG4000,融合后的细胞用HAT选择性培 养液筛选。

阳性克隆的稳定化培养采用有限稀释法，用荧光显微镜观察。

本发明还提供了一种单克隆抗体在用于PRV的鉴别方面的应用。

本发明采用PRV为免疫原，免疫8-12周龄BALB/c雌性小鼠，取免疫小鼠脾细胞和 SP2/0进行细胞融合,再经药物筛选和亚克隆筛等步骤选出能稳定分泌抗猪伪狂犬病抗体 的杂交瘤细胞株，经间接ELISA法和间接免疫荧光法鉴定,证实所分泌的单克隆抗体能特 异结合PR。其中，本实验所用免疫小鼠脾细胞和SP2/0均为实本验室保存，BALB/c雌性 小鼠购自于河南省食品药品检验所。

本发明的提供上述单克隆的制备方法包括以下步骤：

1）制备较高效价的PR为免疫原；

2）用PR免疫8-12周龄BALB/c雌性小鼠，取其脾脏细胞，通过体外与小鼠骨髓瘤细 胞融合；

3）用间接免疫荧光法筛选阳性克隆；

4）用有限稀释法亚克隆阳性杂交瘤细胞得到稳定分泌抗猪伪狂犬病单克隆抗体的杂 交瘤细胞；

5）单克隆抗体腹水的制备和纯化

本试验用CNB r活化的Saphrose4FF和RV单抗制成反相亲和层析柱进行RV抗原纯化, 由于RV单抗高度的特异性和亲和性,可纯化出高纯度的RV抗原。

本发明采用Sepharose4FF层析柱纯化得到了高纯度的PR抗原，保证后续阳性克隆的 筛选和抗体的产生，确立了间接ELISA法快速测定单抗的产生与效价，通过接种BALB/c 雌性小鼠腹腔获取了大量PRV单抗，该抗体是针对PR病原的单一抗体，具有特异性强、 纯度高、均一性好等优点，可用于PR的诊断和治疗，同时为其他类型单抗的制备提供了 一定的技术借鉴。

附图说明

图1是间接免疫荧光试验结果；A:单抗HC2与PRV感染的BHK-13细胞；B:单抗HC2A 与PRV感染的BHK-13细胞；C:正常的BHK-13细胞。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做具体的说明。

本发明所用病原菌、细胞、实验动物、生化试剂有：PRVYA株、HCV、PPV、SE、PRRSV 由郑州市畜牧局分离、鉴定并保存；NP和骨髓瘤细胞SP2/0由实验室提供；BALB/C小鼠购 自河南农业大学牧医工程学院动物房；HAT选择性培养基、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐 剂、FITC标记的山羊抗小鼠抗体、购自Sigma公司；小牛血清购自GIBCO公司；BCA蛋白 定量试剂盒购于H iTrap Protein G HP；其他生物试剂均购自于TaKaRa公司。

1.制备较高效价的PR为免疫原

伪狂犬病毒悬液接种到已长成单层的BHK-13细胞上,35℃培养5～6d后,每隔3d连 续收取培养液上清(病毒悬液)3次。将收集的病毒悬液浓缩40倍,并加入终浓度为1 /3000的甲醛灭活病毒。将灭活的病毒悬液离心30m in去沉淀,上清通过Sepharose4FF 层析柱进行纯化。具体纯化方法如下：选择BPG200/750的层析柱按常规方法活化 Sephrose4FF粉；洗涤,平衡后,加入纯化单抗室温偶联3h;洗涤,装柱。平衡缓冲液平衡 柱子后开始循环上样,样品体积50mL,上样1h后平衡缓冲液洗涤柱子,收集峰值时流出 的杂蛋白。甘氨酸缓冲液进行洗脱,峰值时流出液用含中和缓冲液的管接收。洗脱完毕, 平衡缓冲液平衡柱子,层析柱凝胶存于20%的乙醇、0.02%NaN3中,4℃保存。洗脱液透析 浓缩后,用BCA蛋白定量试剂盒测定病毒蛋白含量,经单克隆抗体的间接ELISA检测及 SDS PAGE凝胶电泳鉴定其纯度。

2.免疫BALB/c小鼠

用50ul PR自制抗原溶于100ul PBS，与100ul完全弗氏佐剂混匀，皮下注射小鼠。 之后每隔3周，用25ug PR抗原溶于100ul PBS，与100ul不完全弗氏佐剂混匀，皮下注 射。作4次增强免疫后，隔3周进行抗原冲击：25ug抗原溶于150ul PBS，腹腔注射。 3d后，取脾细胞。

3.用免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合

将免疫小鼠的脾细胞与SP2骨髓瘤细胞同37℃预温的1ml450g/L的PEG4000融合, 融合后的细胞用RPMI-1640不完全培养液(含体积分数为20%的小牛血清和体积分数为1% 的选择培养基HAT)重悬后接种于加有小鼠腹腔巨噬细胞饲养细胞的96孔板内,在HAT 选择性培养液中培养,观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上 清供抗体检测。

4.间接ELISA筛选阳性克隆

将FR按照1×10⁷TCID50的病毒量接种于BHK-21细胞,未接毒的BHK-21细胞作为 阴性对照,培养10h后,用37mg/L多聚甲醛固定10min,充分洗涤后,加入NH4Cl作用 10min,充分洗涤,吸干残液;加入单抗37℃作用1h,充分洗涤;FITC标记的山羊抗小 鼠抗体作为二抗作用1h后,充分洗涤,用荧光显微镜观察信号荧光。在荧光显微镜下可 以观察到PRV感染的BHK-13细胞的表面发出绿色荧光,而正常未被感染的BHK-13细胞无 反应，不呈现任何颜色,表明单抗腹水能结合PRV感染的细胞,而对未感染PRV的细胞无 反应。

5.阳性杂交瘤细胞克隆

通过间接ELISA法检测为阳性的融合细胞经过三次克隆，获得两株分泌抗PRV杂交瘤 细胞，分别命名为HC2和HC2A。用培养液吹打起这两个阳性培养孔的杂交瘤细胞后,取 100个左右的杂交瘤细胞加入10mL细胞培养液中,混合均匀后,滴加到铺有饲养细胞的 96孔板内,每孔100uL。选取只有一个杂交瘤细胞的培养孔,待杂交瘤细胞长满该孔底 2/3以上时,取其上清液用间接ELISA检测是否有目的单克隆抗体（由小鼠脾细胞和骨髓 瘤细胞融合的杂交瘤细胞分泌的仅能与PRV抗原特异结合的抗体）存在。

6.单克隆抗体腹水的制备

对10周龄左右的BALB/c雌性小鼠腹腔注射降脂烷,0.5mL/只,一周后腹腔接种1× 10⁶个生长良好的杂交瘤细胞,约10d后,小鼠腹腔明显增大时,采集腹水,离心过滤后用 Sepharose柱纯化,经低速超膜离心浓缩后,加500mL/L甘油分装,-70℃保存备用。

本发明是建立间接ELISA筛选阳性克隆的方法为：

取纯化病毒抗原稀释成0.5、1、2、5、10、15、20、25ug/ml，与不同稀释度阳性血清、 阴性血清(健康小鼠)方阵滴定，羊抗鼠HRP标记二抗暂以1∶10000稀释，确定出抗原包 被浓度与血清稀释倍数。然后确定出酶标二抗稀释倍数。筛选时同一孔内杂交瘤细胞培养 上清100微升加于PRV包被板，100微升加入正常细胞培养物包被板孔内(包被浓度同 PRV)。当细胞上清OD值与阴性对照比值大于2则该孔判为阳性。

7.结果评定

1>间接免疫荧光试验结果

在加入HC2、HC2A单抗的PRV感染的BHK-13细胞中均可见特异性荧光,而正常 BHK-13细胞无特异性荧光(见图1)。表明这2株单抗均能够与PR特异性结合。

2>单克隆抗体效价测定

将已建株的HC2/HC2A杂交瘤细胞扩大培养,待细胞近乎长满时停止换液,继续培养直 至大部分细胞濒临死亡,吸取培养液,1000r/min离心10min,收集上清,以健康小鼠 血清作阴性对照测ELISA效价,效价测定HC2、HC2A杂交瘤细胞培养液上清效价均为1∶ 1024;腹水效价分别为1∶108腹水效价明显高于上清。

3>单克隆抗体特异性鉴定

应用间接ELISA测定单克隆抗体与猪瘟病毒(HCV)、猪细小病毒(PPV)、猪丹毒（SE）、 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的交叉反应。各病毒包被浓度同PRV,HC2、HC2A均以 培养液上清与抗原作用,健鼠血清作为阴性对照。

表1  抗PRV单克隆抗体特异性鉴定

经鉴定2个阳性孔内杂交瘤细胞,有限稀释法克隆后,所得的HC2、HC2A具有稳定分泌 高效价抗体的能力,它们产生的抗体单一,不与HCV、PPV、SE、PRRSV产生交叉反应,具 有良好的特异性。

单克隆抗体应用

1）鉴于本发明单抗特异性强、灵敏度高的特点可以作为实验室诊断PR病的重要工具， 为该病的早期预防做好准备，同时对于已感染的病猪起到治疗作用；

2）可以对筛选出来的HC2、HC2A阳性融合细胞株分别进行标准化生产，短时期内能得到 大量的单抗；

3）通过制得的PRV单抗可以纯化对应PRV抗原，得到的高纯度抗原又可以精确检测对应 抗体效价。