半日花烷型二萜类化合物、柏子仁提取物及其制备方法和应用

摘要

本发明提供多种半日花烷型二萜类化合物及其衍生物，用于制备预防或治疗神经退行性疾病的药物组合物。本发明还提供柏子仁提取物，该柏子仁提取物含有一种或多种半日花烷型二萜类化合物及其衍生物，用于制备预防或治疗神经退行性疾病的药物组合物。

说明书

技术领域

本发明涉及半日花烷型二萜类化合物，柏子仁（Semen boitae）提取物及其制备方法和应用。 

背景技术

神经退行性疾病（Neuro degenerative diseases,NDD）是一类慢性、进行性神经疾病,主要包括老年痴呆症（Alzheimer’s disease,AD）、帕金森症（Pakinson’disease,PD）、亨廷顿舞蹈症（Huntington disease,HD），肌萎缩侧索硬化症（Amyotuophic laterals clerosis,ALS）等。该类疾病具有复杂的病理生理过程，病变部位及病因各不相同，但神经细胞退行性病变是他们的共同点。神经退行性疾病患者常有记忆力下降、认知困难、痴呆、动作平衡失调、运动能力丧失等症状，病人生存质量严重下降，加上病程长、无法治愈，给病人及其家庭带来极大的经济和心理压力。随着全球人口老龄化程度的不断加剧，与衰老相关的疾病己成为科学家面临的一项重要挑战。 

临床上，对于这类疾病尚无有效控制病程进展的措施。目前，治疗神经退行性疾病的药物大多数只能减轻症状，达不到治愈的目的，并有较明显的副作用。例如，到目前为止还没有任何一种药物或治疗方式能够完全阻断PD的疾病进程；AD治疗药物他克林（tacrine）， 因其肝脏毒副作用及明显药物相互作用而淘汰，多奈哌嗪（donepezil），利斯的明（rivasrigmine）和加兰他明（galantamine）三者的副作用主要表现为恶心、呕吐、腹泻、厌食。因此研究开发能同时保护神经细胞和改变疾病进程，并且无副作用的神经退行性疾病治疗药成为当务之急。 

柏子仁（semen boitae），又名柏实、侧柏仁等，是柏科植物侧柏的成熟种仁，主产于山东、河南、河北、陕西、湖北、甘肃等地。柏子仁为常用中药材。关于柏子仁的用药多在中药复方中使用,如柏子养心丸（柏子仁、党参、肉桂、远志、五味子、酸枣仁、朱砂、黄芪、川芎、当归、半夏曲、茯苓、甘草）用于心气不足、失眠健忘。一种改善记忆、预防老年痴呆保健饮品包括柏子仁、覆盘子、云苓、远志等二十一种中药。对柏子仁其提取物在神经退行性疾病方面的用途逊有报道。 

发明内容

本发明的目的之一在于提供药物组合物可用于预防或治疗神经退行性疾病。 

本发明提供半日花烷型二萜类化合物，为如下两式结构的半日花烷 

型二萜中一种或多种成分： 

I式： 

R1：——COOH，或者——COOMe； 

R2：——H，或者——OH； 

R3： 

II式： 

A1： 

A2： 

A3： 

A4： 

A5： 

A6： 

A7： 

R1：——CH₃，或者——COOH，或者——COOMe； 

R2：——H，或者——CH₂OH； 

R3：——H，或者 

R4：——H，或者 

R5：——H，或者 

R6：——H，或者——OH。 

当中包含15-羟基松柏酸、15-甲氧基松脂酸、（1S,4aR,5S,8aR）十氢-1,4a-二甲基-6-亚甲基-5-（3-氧代丁基）-1萘酸、12,13-二羟基-半日花-8（17），14-二烯-19-酸、松脂酸、7β,13S-二羟基-半日花-8（17），14-二烯-19-酸、（1S,4aR,5S,8aR）十氢-1,4a-二甲基-6-亚甲基-5-[(1E-3-氧代丁基]-1萘羧酸、异红松内酯、柏子仁内酯酸、14,15-双去甲-半日花-8（17）-烯-16,19-二酸、1-氧-3β-羟基桃柘酮、6、7-脱氢山达海松酸、山达海松酸、12,13,14-三羟基-12,15-环氧-半日花-8（17）-烯-19-酸、红松内酯、柏子仁内酯酸甲酯、异海松酸、7α-羟基山达海松酸、15,16-二羟基-半日花-8（17），13E-二烯-19-酸、13-反柏酸、异柏酸、隐海松二烯-3β,18-二醇、14（R）,15-二羟基-半日花-8（17）,12E-二烯-19-酸、14,15-双去甲半日花-8(17),12E-二烯-19-羧酸甲酯、(1S,4aR,5S,8aR)十氢-1,4α-二甲基-6-亚甲基-5-[(2E)-3-甲基-4-氧-2-丁烯基]-1-萘酸、16-甲基-12,15-环氧-半日花-8(17),13-二烯-19-酸、南洋杉酸等；以及所述各个半日花烷型二萜类化合物的衍生物；所述半日花烷型二萜类化合物及其衍生物预防或治疗神经退行性疾病。 

本发明还提供所述半日花烷型二萜类化合物及其衍生物从柏子 仁提取物分离得到，或采用前体衍生化、半合成及全合成方法得到。 

本发明还提供柏子仁提取物，所述柏子仁提取物包含一种或多种所述半日花烷型二萜类化物及其衍生物。 

本发明还提供柏子仁提取物的制备包括： 

提供柏子仁粉； 

超临界二氧化碳萃取除去柏子仁油得药渣； 

加乙醇到药渣提取得浸膏，相对密度1.20以上； 

将浸膏溶于水； 

用乙酸乙酯萃取得柏子仁提取物。柏子仁二萜类单体化合物，通过柱层析分离得到。 

本发明还提供药物组合物用于预防或治疗神经退行性疾病，所述药物组合物包含一种或多种所述半日花烷型二萜类化物及其衍生物或柏子仁提取物. 

下面结合附图和具体实施方式进一步详细描述本发明，但本发明不局限于这些实施方式，任何在本发明基本精神上的改进或替代，仍属于本发明权利要求书中所要求保护的范围。 

附图说明

图1是26个半日花烷型二萜类化物的化学结构式；每一个半日花烷型二萜类化物的化学名称如下： 

具体实施方式

本发明在探索可用于预防或治疗神经退行性疾病的药物中取得了重大突破。不同的实验证明柏子仁提取物和半日花烷型二萜类化物能够能显著提高PD模型细胞活性、延缓AD模型线虫的瘫痪时间，并延长线虫的寿命，具有神经保护活性有延缓衰老作用。 

实施例1：柏子仁提取物的制备 

取柏子仁，捣碎，超临界二氧化碳萃取除去柏子仁油。药渣加95%乙醇提取，每次加95%乙醇10倍体积，加热回流提取，提取液回收溶剂得浸膏，相对密度1.20以上；将浸膏溶于水，用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯萃取液后回收溶剂，即得柏子仁萜类提取物。柏子仁二萜类单体化合物，通过柱层析分离得到。 

实施例2：柏子仁提取物及萜类化合物抗PD模型细胞实验 

取以上实施例1中柏子仁提取物及柏子仁二萜类化合物进行实验 

将与多巴胺能神经元有许多相似特征的PC12细胞（大鼠肾上腺 嗜铬细胞瘤细胞株），培养于DMEM培养基(含5%马血清,5%胎牛血清，100U/mL青霉素,100g/mL链霉素)中,置于37℃、饱和湿度、含5%CO₂的培养箱中培养。每2～3d换液,待细胞长至70～80%满时传代。选取对数生长期生长状况良好的细胞以1～5×10⁵个接种于96孔培养板,每孔100μl。37℃孵育24h细胞贴壁后,造模组加含MPP⁺培养基，实验组加入含MPP⁺和不同浓度的柏子仁提取物或二萜类单体化合物的培养基，空白对照组加不含药培养基，与培养箱中继续培养24h。MTT法检测细胞活力。 

结果如表1所示，柏子仁提取物及萜类化合物可显著提高MPP⁺致PC-12细胞损伤的细胞活性。 

表1柏子仁提取物及萜类化合物对MPP⁺致PC12细胞损伤的影响（n=8） 

*表示与造模组相比P<0.05;**表示与造模组比P<0.01. 

实施例3：柏子仁提取物及柏子仁二萜类化合物抗线虫AD模型实验 

取以上实施例1中柏子仁提取物及柏子仁二萜类化合物进行实验。 

将秀丽隐杆线虫Caenorhaditis elegans转基因品系CL4176（温度诱导表达Aβ蛋白），同步化处理后在15℃下培养至L1期，然后加至涂布好的混合有不同浓度提取药物的OP50菌液培养皿中，每个皿25条左右，每组三个板。15℃培养12h后转温至26℃下培养。转温36h后开始计数线虫瘫痪情况，每3h计数一次，直到全部线虫瘫痪。结果如下表所示，柏子仁提取物及柏子仁二萜类化合物均能显著延缓Aβ致CL4176线虫的瘫痪。 

表2-柏子仁提取物及二萜类化合物对AD模型线虫的瘫痪的影响 

*P表示与空白对照相比较P<0.05;**表示与造模组比P<0.01. 

实施例4：柏子仁提取物及二萜类化合物抗线虫衰老模型实验。 

取以上实施例1中柏子仁提取物及二萜类化合物进行实验。 

N2线虫同步化至L4期，将含不同浓度柏子仁提取物及二萜类化合物的OP50涂至NGM培养板上，每个实验组3个板，每板加约25条虫。每天记录一次线虫的存活数，当食物吃完或有霉菌污染时须将线虫转至新的NGM培养板中，直至线虫全部死亡。结果如表-3所示，与对照组相比，柏子仁提取物及二萜类化合物显著延长线虫的平均寿命。 

表3-柏子仁提取物及二萜类化合物抗线虫衰老实验 

*P表示与空白对照相比较P<0.05;**表示与造模组比P<0.01。