一株粪肠球菌及其广谱抑菌作用

摘要

本发明公开了一株粪肠球菌及其广谱抑菌作用的应用。本发明提供了一株粪肠球菌（Enterococcus faecalis）E15-CUI，其保藏号为CGMCC NO.6130。本发明还提供了所述的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）E15-CUI CGMCC NO.6130或其发酵产物在制备抑菌产品中的应用。本发明的实验证明，本发明从动物胃肠道快速筛选出粪肠球菌E15-CUI，将该菌株进行发酵培养，发酵产物可以抑制大肠埃希氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、肺炎克雷伯、变形杆菌、多杀性巴氏杆菌、马腺疫链球菌、猪链球菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌等多种菌。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一株粪肠球菌及其广谱抑菌作用。

背景技术

我国是一个畜牧业大国，也是畜产品消费大国。抗生素在预防或治疗动物感染寄 生虫和细菌性疾病中被广泛大量使用，人们已经认识到滥用抗生素的危害，作为动物 生长促进剂正在被限制或禁用，抗生素使用造成的药物残留问题已成为畜牧业发展的 严重障碍。动物源食品抗生素超标而导致的出口损失以及公共卫生安全问题引起了广 泛的关注。人们迫切需要寻找可能的替代品，更希望找到与人类抗生素关联很少的物 质进行疾病的预防和治疗，以消除抗生素的耐药性对人类健康的威胁。细菌素无疑是 一类天然的具有巨大潜力的抗菌物质，因此细菌素成为了近年来研究的热点。

细菌素（Bacteriocins）是某些细菌在代谢过程中，通过核糖体合成机制产生的 一类具有抗菌活性的多肽、蛋白质或蛋白质复合物，具有高效、无毒、耐高温、无残 留、无抗药性等优点。而传统的青霉素等抗生素是由细胞多酶复合体催化形成的代谢 产物，不存在结构基因；而细菌素由基因编码，可以通过基因工程的手段加以改造。 乳酸链球菌肽Nisin是世界上公认安全的防腐剂，已有52个国家和地区使用Nisin 作为食品保鲜剂，从而促进了其它种类细菌素的研究及其在食品防腐剂之外领域的开 发和应用。

近年来，细菌素因其具有无毒、高效、耐高温、无残留、无抗药性等优点，已被 广泛用作食品添加剂和微生态制剂。随着饲料工业的快速发展和规模化的养殖模式上 的推广，人们对动物源食品的安全水平更加关注。如果将产细菌素的菌株制备成益生 素活菌制剂或开发出细菌素饲料添加剂，以减少抗生素添加剂在饲料中的滥用，那么 细菌素在畜牧业中的应用潜能将非常巨大。

发明内容

本发明提供了一株粪肠球菌（Enterococcus faecalis）E15-CUI。

本发明提供的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）E15-CUI，其保藏号为CGMCC NO.6130。

上述的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）E15-CUI CGMCC NO.6130或其发酵产物 在制备抑菌和/或杀菌产品中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述抑菌为抑制大肠埃希氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、 肺炎克雷伯氏菌、多杀性巴氏杆菌、单核细胞增生李氏杆菌、马腺疫链球菌兽疫亚种、 金黄色葡萄球菌、炭疽芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、屎肠球菌和粪肠球菌中的至少一种；

也可以抑制耐药性鸡伤寒沙门氏菌、耐药性肠炎沙门氏菌、普通变形杆菌或猪链 球菌。

所述杀菌为杀灭大肠埃希氏菌；所述杀灭大肠埃希氏菌具体为杀灭大肠埃希氏菌 CVCC C83707。

上述应用中，所述发酵产物按照包括如下步骤的方法制备：将上述的粪肠球菌 （Enterococcus faecalis）E15-CUI CGMCC NO.6130进行液体发酵，收集产物，即为发 酵产物。

上述应用中，所述液体发酵的温度为37℃，所述液体发酵的时间为24h，所述液 体发酵的转速为200r/min，所述液体发酵的培养基为MRS液体培养基。

上述应用中，所述发酵产物制备方法中还包括如下步骤：将所述产物在4℃、 9100×g离心10min，收集上清液，得到发酵产物。

本发明的另一个目的是提供一种抑菌产品。

本发明提供的抑菌产品，其活性成分为上述的粪肠球菌（Enterococcus faecalis） E15-CUI CGMCC NO.6130或上述应用中的发酵产物；上述抑菌具体为抑制大肠埃希氏 菌、鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、多杀性巴氏杆菌、单核细 胞增生李氏杆菌、马腺疫链球菌兽疫亚种、金黄色葡萄球菌、炭疽芽孢杆菌、蜡样芽 胞杆菌、屎肠球菌和粪肠球菌中的至少一种。

本发明的第三个目的是提供一种杀菌产品。

本发明提供的杀菌产品，其活性成分为上述的粪肠球菌（Enterococcus faecalis） E15-CUI CGMCC NO.6130或上述应用中的发酵产物；所述杀菌为杀灭大肠埃希氏菌； 所述杀灭大肠埃希氏菌具体为杀灭大肠埃希氏菌CVCC C83707。

本发明的第四个目的是提供一种制备抑菌产品或杀菌产品的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：将上述的粪肠球菌（Enterococcus faecalis） E15-CUI CGMCC NO.6130进行液体发酵，收集产物，即得到抑菌产品或杀菌产品。

上述方法中，所述液体发酵的温度为37℃，所述液体发酵的时间为24h，所述液 体发酵的转速为200r/min，所述液体发酵的培养基为MRS液体培养基。

上述方法还包括如下步骤：在所述收集产物后还包括如下步骤：将所述产物在 4℃、9100×g离心10min，收集上清液，得到抑菌产品；

上述抑菌为抑制大肠埃希氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯 氏菌、多杀性巴氏杆菌、单核细胞增生李氏杆菌、马腺疫链球菌兽疫亚种、金黄色葡 萄球菌、炭疽芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、屎肠球菌和粪肠球菌中的至少一种；

所述杀菌为杀灭大肠埃希氏菌；所述杀灭大肠埃希氏菌具体为杀灭大肠埃希氏菌 CVCC C83707。

菌株E15-CUI于2012年5月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生 物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCC No.6130，分类命名为粪肠球菌Enterococcus  faecalis。

本发明的实验证明，本发明从动物胃肠道快速筛选出粪肠球菌E15-CUI，将该菌 株进行发酵培养，发酵产物可以抑制大肠埃希氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏 菌、肠炎沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、普通变形杆菌、多杀性巴氏杆菌、马腺疫链球 菌、猪链球菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌等多种菌，且抑菌效果大于同类的粪 肠球菌，经过初步判断抑菌是由于细菌发酵产生了一种具有蛋白性质的细菌素物质引 起。因此本发明的菌株及其发酵产物在畜牧业中的应用潜能将非常巨大。

附图说明

图1为E15-CUI的形态观察

图2为E15-CUI培养特性

图3为透射电镜观察E15-CUI发酵液对大肠杆菌CVCC C83707形态的影响

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、E15-CUI的分离及鉴定

1、E15-CUI的分离

（1）动物胃肠道的处理

无菌取健康猪的整个消化道包括胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠， 分别取各部位黏膜组织1g，置于灭菌的平皿中、剪碎，用5mL的无菌生理盐水制成 悬液，取100μL悬液接种乳酸菌增菌培养基中，置在37℃温箱中烛缸法培养48h， 得到增菌培养后的菌液。

（2）分离纯化

取增菌培养后的菌液在肠球菌选择培养基（购自杭州天和试剂有限公司）上进行 划线分离培养，37℃培养24h。挑取典型菌落、镜检，无杂菌进行移植、纯化培养， 保存于4℃冰箱中备用。

（3）抑菌实验

MRS液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，葡萄糖10g，蔗糖5g，枸橼酸铵 2g，醋酸钠15g，KH₂PO₄6g，MnSO₄·4H₂0MgSO₄·7H₂0 0.58g，0.25g,FeSO₄·7H₂0， 0.03g,吐温-801g，蒸馏水1000ml，pH7.0。

PYG培养基：大豆蛋白胨0.5g，酵母浸粉0.5g，KH₂PO₄0.1g，MgSO₄·7H₂00.02g， MnSO₄·4H₂0 0.002g，葡萄糖0.1g，蒸馏水100ml，pH6.5。

发酵：将上述（2）得到的已分离纯化的细菌接种至MRS液体培养基中，37℃、 200r/min振荡发酵培养24h，得到发酵产物；将发酵产物在4℃、9100×g离心10min， 取上清液备用；

指示菌（见下表1）的培养：分别将指示菌培养到对数生长期，用灭菌生理盐水 稀释到10⁷CFU/mL，取100ul涂布PYG培养基平板；采用琼脂打孔双层平板扩散法， 加样（上述上清液）后置4℃冰箱中扩散1h，37℃培养24h观察抑菌活性，结果见 表1：

表1  为抑菌试验结果

筛选出具有抑菌活性的菌株，命名为E15-CUI。

2、E15-CUI的鉴定

1）细菌形态、培养特性鉴定

将上述1筛选得到的E15-CUI进行革兰氏染色，为阳性，镜检，结果为圆形或卵 圆形，单个、成对或短链状排列，无荚膜、无芽孢、无鞭毛的球菌，见图1。

将上述1筛选得到的E15-CUI在肠球菌选择培养基（购自杭州天和试剂有限公司） 上传代培养，观察菌落，形成紫红色，表面光滑凸起，周边整齐，直径0.5-1.0mm的 菌落，见图2。

将上述1筛选得到的E15-CUI在普通营养琼脂培养基（购自杭州天和试剂有限公 司）上培养，观察菌落，形成圆形灰白色，针尖状或露滴状的小菌落，湿润、半透明， 边缘整齐的菌落，在血平板上生长无溶血性。

2）生理生化鉴定

将上述1筛选得到的E15-CUI分别进行如下表2中的特性检测试验，结果见表2：

表2  为E15-CUI的生理生化特征

3）分子水平鉴定

将上述1筛选得到的E15-CUI提取基因组DNA,PCR扩增,引物为 P1:5’-TCATCTGTCCCACCTTGCGC-3’，P2:5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAGG-3’，得 到16SrDNA基因，经过测序，该16SrDNA基因的核苷酸序列为序列表中的序列1。

分析上述形态、生理生化结果，并结合16SrDNA基因在GenBank的分类位置，可 以得到E15-CUI为粪肠球菌。

将菌株E15-CUI于2012年5月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微 生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCC No.6130，分类命名为粪肠球菌 Enterococcus faecalis。

实施例2、粪肠球菌E15-CUI CGMCC No.6130在抑菌中的应用

1、粪肠球菌E15-CUI CGMCC No.6130的抑菌研究

将粪肠球菌E15-CUI CGMCC No.6130按照实施例1中1的（3）的方法进行发酵、 离心，并收集上清液进行抑菌实验，指示菌来源见表1。以粪肠球菌E5和屎肠球菌E9 为对照。

粪肠球菌E5公众可从北京农学院获得，记载该菌株已发表的文章为：产 enterocin E5细菌素粪肠球菌发酵条件的优化，崔德凤、周波、杨桂梅、李焕荣、 阮文科、汪明、张永红，2011，45(3):13～17，中国兽药杂志。

屎肠球菌E9公众可从北京农学院获得，记载该菌株已发表的文章为：屎肠球菌 素E9的产生和特性研究，周波、刘凤华、崔德凤、聂晓华、王雪亭、白燕，中国 兽药杂志，2011,45(2):16-19。

结果见表3，可以看出菌株E15-CUI的发酵上清液显示了广谱的抗菌活性，对23 株指示菌具有抑制作用（包括21株动物源病原微生物和2株益生菌）。能够广泛抑制 肠杆菌科的革兰氏阴性病原菌，对7株猪源肠毒素型大肠杆菌和1株鸡源致病性大肠 杆菌抑制作用最强，抑菌圈直径达到17.7-24mm，对鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌、变形 杆菌和肺炎克雷伯也有较强的抑制作用，特别对产生广谱抗药性的鸡伤寒沙门氏菌和 肠炎沙门氏菌分离株具有明显的抑菌活性；能够抑制多杀性巴氏杆菌（分离自病死猪 和鸡）；抑制革兰氏阳性金黄色葡萄球菌、马腺疫链球菌、猪链球菌、对2株炭疽芽孢 杆菌弱毒株和蜡样芽孢杆菌产生显著的抑菌活性；能够抑制同属屎肠球菌、粪肠球菌； 仅对1株单核细胞增生李氏杆菌没有抑制作用，E15-CUI的发酵上清液抑菌效果明显 要比粪肠球菌E5和屎肠球菌E9的好。

表3  为E15-CUI与屎肠球菌E9和粪肠球菌E5发酵液抑菌活性的比较

2、粪肠球菌E15-CUI CGMCC No.6130抑菌作用机理（抑菌物质分析）

（1）过氧化氢抑菌作用的排除

将粪肠球菌E15-CUI CGMCC No.6130按照实施例1中的1的（3）的方法发酵、 离心、收集上清液，取lmg／mL过氧化氢酶水溶液，加入离心收集得到的上清液，得 到处理产物。将处理产物按照实施例1中的1的（3）的方法进行抑菌实验，指示菌为 大肠杆菌CVCC C83707。以不经过过氧化氢酶处理的上清液作为对照。

结果如下：经过过氧化氢酶处理和不经过过氧化氢酶处理的上清液对指示菌均有 抑制作用，且抑菌圈的直径分别为18.5mm和18.4mm。说明粪肠球菌E15-CUI CGMCC No. 6130上清液对指示菌的抑制作用不是过氧化氢代谢产物的作用。

（2）酸类物质抑菌作用的排出

将粪肠球菌E15-CUI CGMCC No.6130按照实施例1中的1的（3）的方法发酵、 离心、收集上清液，用6mol/L NaOH调节细菌发酵上清液至pH7.0作用30min。

将处理产物按照实施例1中的1的（3）的方法进行抑菌实验，指示菌为金黄色 葡萄球菌CVCC2086和大肠杆菌CVCC C83707，以未调pH发酵上清液及pH为4.5的 乳酸、盐酸为对照。

结果见表4，由表4可以看出，E15-CUI CGMCC No.6130的发酵上清液在排出酸 干扰后仍对2株指示菌有较强的抗菌活性。

表4  为酸排除后的抑菌作用

（3）蛋白酶降解实验验证产细菌素乳酸菌

将粪肠球菌E15-CUI CGMCC No.6130按照实施例1中的1的（3）的方法发酵、 离心、收集上清液；分别加入蛋白酶K、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶（Sigma） 终浓度为5mg/mL，于37℃水浴中温育2h后取100ul，将经过不同酶处理后的上清液 按照实施例1中的1的（3）的方法进行抑菌实验（指示菌为大肠杆菌CVCC C83707）， 以不经过任何酶处理的上清液作为对照。

结果：不经过任何酶处理的上清液的抑菌圈大小为20mm；

经蛋白酶K、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶处理后的细菌上清液的抑菌圈大小分别为 6.5mm、6.8mm、8.0mm；

经脂肪酶和淀粉酶处理后的细菌上清液的抑菌圈大小分别为20mm和19.9mm；

可以看出，经蛋白酶K、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶处理后的细菌上清液的抑菌活性 明显降低，脂肪酶和淀粉酶处理无变化，可以初步判断细菌发酵产生了一种具有蛋白 性质的细菌素物质。

（4）透射电镜观察对大肠杆菌CVCC C83707的杀菌作用

将粪肠球菌E15-CUI CGMCC No.6130按照实施例1中的1的（3）的方法发酵、 离心、收集上清液5ml；

将37℃培养3h的大肠杆菌CVCC C83707，9100×g离心10min，收集菌体； 将粪肠球菌E15-CUI CGMCC No.6130的5ml上清液加到上述大肠杆菌CVCC C83707 菌体中作用0.5-1h，离心、制片，同时设PBS缓冲液（NaCl0.8g,KH₂PO₄0.024g,KCl 0.02g,Na₂HPO₄·12H₂O 0.363g,去离子水100mL，（0.1mol/L pH7.2-7.3）为对照， 电镜观察结果。

结果见图3，其中，A：E15-CUI发酵液对大肠杆菌作用1h（8000X）;B：E15-CUI 发酵液对大肠杆菌作用0.5小时（20000X）;C:PBS对照组作用1h（8000X）;D:PBS对 照组作用0.5h（20000X）

可以看出，处理0.5h和1h后的PBS孵育大肠杆菌CVCC C83707形态均一、结构 饱满、边缘整齐；E15-CUI发酵液处理的大肠杆菌菌体随着作用时间的延长，大肠杆 菌CVCC C83707形态逐渐破坏，且存在时间依赖性。当处理30min时，大肠杆菌CVCC C83707结构基本完整但开始模糊、形态参差不齐、边缘有所皱缩；当处理1h后，电 镜下已看不到结构完整的大肠杆菌CVCC C83707，所有细菌均破裂，消散。

以上结果进一步证明了E15-CUI发酵液对大肠杆菌CVCC C83707的确有杀灭作用， 其对靶细菌的影响主要是使细菌皱缩，细胞结构破坏以及胞质外泄而死亡。