矮牵牛离体茎尖的超低温保存方法

摘要

本发明提供了一种矮牵牛离体茎尖的超低温保存方法，其主要基于小滴玻璃化法超低温保存技术，包括材料扩繁、茎尖剥取、预培养、装载、PVS2处理、超低温冷冻保存的步骤。通过对采用本发明的小滴玻璃化法超低温保存技术获得的矮牵牛离体茎尖进行植株再生培养，表明该法是一种长期安全、稳定可靠、简单有效的保存矮牵牛种质资源的方法，再生苗恢复生长良好，植株再生率可达50%以上。

说明书

技术领域

本发明涉及植物种质资源的超低温保存方法，具体地说，涉及一 种矮牵牛离体茎尖的超低温保存方法。

背景技术

矮牵牛（Petunia×hybrida Vilm.），别名灵芝牡丹、碧冬茄、撞 羽朝颜等，为茄科（Solanaceae）矮牵牛属花卉。矮牵牛为多年生草 本双子叶植物，常作一、二年生栽培，株高15~80cm不等；叶片呈现 椭圆或卵圆状；营养生长期短，当年可开花，花期可长达数月之久； 花冠呈现喇叭状（类似牵牛花）；花瓣边缘类型有平瓣、波状瓣、锯 齿瓣等；花色有紫、红、白、粉及镶嵌、网纹、条纹等；果实为尖圆 形蒴果，种子极小，千粒重约0.1g（费砚良,刘青林,葛红等.中国作 物及其野生近缘植物,花卉卷[M].中国农业出版社,2008:505-508）。

矮牵牛原产于南美洲的阿根廷，目前在世界各国均广泛种植，如 日本、意大利、法国、西班牙、荷兰和德国等，用于道路街边绿化和 庭园美化；在美国，矮牵牛的种植面积和消费额高居草本花卉之首； 在日本，矮牵牛也被评为最受欢迎的草本花卉之一。矮牵牛广泛应用 于花坛、花境布置，窗台和庭院装点，另外大花、重瓣的品种也是切 花的材料。

矮牵牛种子常规保存寿命3-5年，发芽率60%左右，染色体倍数为 2X、4X、5X（X=7）类型。矮牵牛品种在种植时退化现象严重，很 多品种只能通过无性繁殖保存种质。我国目前矮牵牛种子多为国外进 口的杂交种，其价格十分高昂，虽可以采用扦插繁殖，但其成活率低， 但是实际生产中需要大量的种苗，很难在短时间内提供大量的繁殖 体。

目前，有关矮牵牛的种质保存方面的研究报道较少。超低温保存 技术是可长期安全保存种质资源的可选择的较佳途径之一，不但节约 空间，而且成本低。现已开发出多种超低温保存方法，然而针对不同 物种甚至对于同一物种的不同栽培品种，其适宜的超低温保存方法及 程序技术都有可能不同，迄今为止，国际上尚未建立起具有普适性的 超低温保存方法，这也是超低温保存技术实际应用中的一个主要瓶 颈。

发明内容

本发明的目的是提供一种矮牵牛试管苗离体茎尖小滴玻璃化法 超低温保存技术及植株再生培养方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种矮牵牛离体茎尖的超低温保 存方法，其主要基于小滴玻璃化法超低温保存技术，包括材料扩繁、 茎尖剥取、预培养、装载、PVS2处理、超低温（-196℃）冷冻保存的 步骤。

材料扩繁具体步骤如下：1）将矮牵牛试管苗接种在含0.5mg/L BA 和30g/L蔗糖的MS固体培养基上进行扩繁；2）将扩繁的试管苗转移 到不含激素的MS培养基中生根复壮，20d后，将生根苗转到含30g/L 蔗糖的MS培养基中培养；培养温度为25±2℃，光照14h/d，光照强 度为700lux。

茎尖剥取具体为：在无菌条件下，从继代15-20d的生长健壮的矮 牵牛无菌苗上剥取带2-3片叶原基，直径大小约2~3mm的离体茎尖为 材料。

预培养具体为：将剥取的茎尖在含0.2~0.4mol/L蔗糖的MS液体培 养基中，于25℃振荡预培养1~3d，摇床转速为60rpm/min。

装载具体为：将预培养后的离体茎尖置于装载液中室温装载 20~40min；所述装载液的组成为：MS+2mol/L甘油+0.4mol/L蔗糖。

PVS2脱水处理具体为：将装载后的茎尖置于PVS2中，0℃处理 30~50min；所述PVS2的组成为：MS+30%甘油+15%乙二醇+15%二 甲基亚砜+0.4mol/L蔗糖。

超低温冷冻保存具体为：将经PVS2脱水处理后的茎尖置于铝箔 条上，向茎尖上滴加PVS2溶液，使茎尖完全包裹于PVS2溶液小滴中， 然后将铝箔条直接浸入液氮中进行冷冻，冷冻后将铝箔条装入冻存 管中，拧紧盖子，最后投入液氮中保存。

本发明进一步提供利用上述方法获得的矮牵牛离体茎尖在组织 培养及植株再生中的应用。其包括：解冻、洗涤及恢复再生培养的步 骤。具体为：将超低温冷冻保存的离体茎尖取出，迅速投入卸载液中 解冻并洗涤，然后将茎尖接种于恢复再生培养基中，在25±2℃下暗 培养7d，最后移至光下培养。洗涤次数优选为2~3次，每10min更换一 次卸载液。

所述卸载液的组成为：MS+1.2mol/L蔗糖；所述恢复再生培养基 的组成为：MS+0.5mg/L BA+30g/L蔗糖+9.0g/L琼脂。

本发明的矮牵牛试管苗离体茎尖小滴玻璃化法超低温保存及植 株再生培养方法，是一种长期安全、稳定可靠、简单有效的保存矮牵 牛种质资源的方法，再生苗恢复生长良好，植株再生率可达50％以上。

附图说明

图1为本发明实施例1中不同品种矮牵牛超低温保存后的存活率 和再生率比较。

图2为本发明实施例1中超低温保存后矮牵牛茎尖恢复培养的结 果；其中a-e为恢复培养20d，a.存活率和再生率分别为25%和16.67%； b.存活率和再生率分别为75%和66.67%；c.由茎尖直接再生的带根小 苗；d.茎尖直接再生的不带根小苗；e.恢复培养存活但不能再生；f. 恢复培养14d，存活的茎尖，只有上部分生组织和叶原基存活；g.恢 复培养10d，存活的茎尖；h.恢复培养10d，死亡的茎尖。

图3为本发明实施例2的预培养液中蔗糖浓度对矮牵牛茎尖超低 温保存的影响。

图4为本发明实施例3中预培养时间对矮牵牛茎尖超低温保存的 影响。

图5为本发明实施例4中装载时间对矮牵牛茎尖超低温保存的影 响。

图6为本发明实施例5中PVS2处理时间对矮牵牛茎尖超低温保存 的影响。

图7为本发明实施例6中利用引物PID3H7对矮牵牛（牛2）组培苗 进行SSR扩增的结果；其中，a中各泳道为未经超低温保存的试管苗 叶片DNA扩增图谱，b中各泳道为经过超低温保存的再生苗叶片DNA 扩增图谱，*为对照处理的样品。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未 特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规 手段，所用原料均为市售商品。

实施例1矮牵牛试管苗离体茎尖小滴玻璃化法超低温保存技术及 植株再生培养方法

实验材料：矮牵牛（Petunia×hybrida Vilm.）“泛美梦幻”系列4 个品种试管苗：牛1（白色）、牛2（蓝色）、牛3（红色）、牛4（玫瑰 红色）。

实验方法具体步骤如下：

1、材料扩繁

1）将矮牵牛试管苗接种在含0.5mg/L BA和30g/L蔗糖的MS固体 培养基（含9.0g/L琼脂）上进行扩繁；

2）将扩繁的试管苗转移到不含激素的MS培养基中生根复壮，20d 后，将生根苗转到含30g/L蔗糖的MS培养基中培养；培养温度为25± 2℃，光照14h/d，光照强度为700lux。

2、茎尖剥取

在无菌条件下，从继代15-20d的生长健壮的矮牵牛无菌苗上剥取 带2-3片叶原基，直径大小约2~3mm的离体茎尖为材料。

3、预培养

将剥取的茎尖在含0.2mol/L蔗糖的MS液体培养基中，于25℃振荡 预培养2d，摇床转速为60rpm/min。

4、装载

将预培养后的离体茎尖置于装载液中室温装载30min；所述装载 液的组成为：MS+2mol/L甘油+0.4mol/L蔗糖。

5、PVS2脱水处理

将装载后的茎尖置于PVS2中，0℃处理30min；所述PVS2的组成 为：MS+30%甘油+15%乙二醇+15%二甲基亚砜+0.4mol/L蔗糖。

6、超低温冷冻保存

将经PVS2脱水处理后的茎尖置于铝箔条上，向茎尖上滴加PVS2 溶液，使茎尖完全包裹于PVS2溶液小滴中，之后将载有包裹着茎尖 的PVS2小滴的铝箔条直接浸入液氮中进行冷冻，然后将冷冻过的小 滴连同铝箔条装入冻存管中，拧紧盖子，最后投入液氮（-196℃）中 进行保存。

7、解冻、洗涤

将液氮保存的离体茎尖取出，迅速投入卸载液中解冻并洗涤2次， 每10min更换一次卸载液。其中，卸载液的组成为：MS+1.2mol/L蔗 糖。

8、恢复再生培养

将洗涤后的茎尖接种于恢复再生培养基中，在25±2℃下暗培养 7d，最后移至光下培养。其中，恢复再生培养基的组成为：MS+0.5mg/L BA+30g/L蔗糖+9.0g/L琼脂。

不同品种矮牵牛的存活率和再生率如图1所示。超低温保存后茎 尖恢复培养的结果如图2所示，其中a-e为恢复培养20d，a.存活率和再 生率分别为25%和16.67%；b.存活率和再生率分别为75%和66.67%； c.由茎尖直接再生的带根小苗；d.茎尖直接再生的不带根小苗；e.恢 复培养存活但不能再生；f.恢复培养14d，存活的茎尖，只有上部分生 组织和叶原基存活；g.恢复培养10d，存活的茎尖；h.恢复培养10d， 死亡的茎尖。

实施例2预培养液中蔗糖浓度对矮牵牛茎尖超低温保存的影响

仅改变预培养液中的蔗糖浓度，其余步骤同实施例1，研究预培 养液中蔗糖浓度对矮牵牛茎尖超低温保存的影响。结果如图3所示。

从图3可以看出，矮牵牛茎尖经小滴玻璃化法超低温保存后，其 存活率和再生率对预培养液中蔗糖浓度的变化较为敏感。随着预培养 液中蔗糖浓度的上升，茎尖存活率和再生率呈现先上升再下降的趋 势，过高或过低浓度的蔗糖均可能导致存活率和再生率下降，其中含 0.2~0.3mol/L蔗糖的预培养液的效果较好，存活率和再生率高达80% 和70%以上，与经其他浓度的蔗糖预处理后茎尖的存活率和再生率差 异显著。

实施例3预培养时间对矮牵牛茎尖超低温保存的影响

仅改变预培养的时间，其余步骤同实施例1，研究预培养时间对 矮牵牛茎尖超低温保存的影响。结果如图4所示。

从图4可以看出，矮牵牛茎尖经小滴玻璃化法超低温保存后，其 存活率和再生率对预培养时间变化较为敏感。预培养时间从0d延长至 2d时茎尖存活率和再生率缓慢提高，预培养2~3d时茎尖存活率和再生 率最高，达80%和70%以上。预培养3~5d茎尖存活率和再生率下降。

实施例4装载时间对矮牵牛茎尖超低温保存的影响

仅改变装载的时间，其余步骤同实施例1，研究装载时间对矮牵 牛茎尖超低温保存的影响。结果如图5所示。

从图5可以看出，采用小滴玻璃化法对矮牵牛茎尖进行超低温保 存，其存活率和再生率对装载时间长短敏感。装载时间由0min延长到 20min时茎尖存活率和再生率显著升高，装载20~40min时茎尖存活率 和再生率最高，存活率和再生率高达80%和70%以上，装载超过40min 茎尖存活率和再生率下降。

实施例5PVS2处理时间对矮牵牛茎尖超低温保存的影响

仅改变PVS2脱水处理的时间，其余步骤同实施例1，研究PVS2 脱水处理时间对矮牵牛茎尖超低温保存的影响。结果如图6所示。

从图6可以看出，矮牵牛茎尖小滴玻璃化法超低温保存对PVS2处 理时间长短较为敏感。PVS2处理时间由0min延长到30min时茎尖存活 率和再生率显著升高，PVS2处理30min时茎尖存活率和再生率最高， 达80%和70%以上。PVS2处理超过40min茎尖存活率和再生率下降， 即过短或过长时间的PVS2处理均可能导致存活率和再生率的下降。

实施例6超低温保存处理对再生的矮牵牛遗传稳定性的影响

将牛2的一株试管苗扩繁获得100株试管苗，并进行连续编号。当 苗龄为20d时剥取茎尖，按照实施例1的小滴玻璃化法程序（步骤1~ 步骤6）进行超低温保存（对每株试管苗进行编号，剥取茎尖也做相 应的编号，每个茎尖的超低温保存独立进行）。

剥离茎尖同时，提取100株试管苗叶片的DNA以备用。茎尖经过 小滴玻璃化法的超低温保存后再生了60个试管苗，提取其叶片DNA。 以超低温保存前剥取茎尖的相同编号的试管苗叶片DNA为对照，共 120份样品采用SSR分子标记进行遗传稳定性检测。经过PCR扩增体系 的优化以及PCR扩增条带的筛选，最后选用15对引物进行SSR扩增（退 火温度49℃~55℃），PCR产物在6%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离。超 低温保存前的60个组培苗没有出现差异性条带；超低温保存后的60 个再生苗也没有出现差异性条带，且条带模式与超低温保存前相同。 例如，利用引物PID3H7进行SSR扩增。PID3H7引物序列及退火温度 如表1所示：

表1PID3H7引物序列及退火温度

PCR反应体系（20μ1）：

加一滴矿物油。

PCR扩增程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min， 共35个循环；72℃，10min；15℃1h；4℃备用。

SSR扩增的结果如图7所示，a中各泳道为未经超低温保存的试管 苗叶片DNA扩增图谱，b中各泳道为经过超低温保存的再生苗叶片 DNA扩增图谱，*为对照处理的样品。因此，按照本发明提供的矮牵 牛试管苗茎尖小滴玻璃化法进行超低温保存，不仅获得的再生植株在 形态上没有发生变异，而且在分子水平上也未检测到任何遗传变异。

综上，本发明的矮牵牛试管苗离体茎尖小滴玻璃化法超低温保存 及植株再生培养方法，可以获得较高的存活率和再生率，植株再生率 可达50%以上，且遗传性状稳定。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。