一种牛、羊用冷冻精液稀释液配方及制作方法

摘要

本发明提供一种牛羊用冷冻精液稀释液配方，每100mL稀释液的配方为：柠檬酸1.35~1.55g，三羟甲基氨基甲烷（tris）2.4~2.6g，葡萄糖1.0~1.2g，甘油4.5~6.8ml，卵黄18.0~21ml，牛血清白蛋白（BSA）4.5~7.5ml，维生素B120.45~0.75ml，青霉素钾5~10万IU，硫酸链霉素5~10万IU，余量为蒸馏水。本发明配方成本低，配制以及使用操作步骤较为简便，能够有效提高精子的活力、顶体完整率，质膜完整率，降低精子畸形率。

说明书

技术领域

本发明涉及一种牛羊用冷冻精液稀释液配方以及制备方法。 

背景技术

稀释液是牛、羊等精液冷冻时必不可少的组成成分，在冷冻过程中对精子起到稀释、缓冲、营养和保护的作用，有效降低低温对精子的影响。尽管国内的冷冻精液制作及人工授精技术已应用多年，但冷冻精液解冻后精子活力（35%~40%）仍低于国外水平（50%~60%）。精液在经过超低温冷冻解冻后，精子的活力降低、死亡数量与畸形率增加，其原因是精子受冷打击致使精子质膜结构发生改变，严重影响质膜的完整性及其复苏后的精子的活力及受精能力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能有效提高冷冻精液解冻后精子活力，顶体完整率，降低精子畸形率的牛羊用冷冻精液稀释液配方以及制备方法。

本发明通过在精液中加入一定量的稳定剂及活性物质，可以有效地起到保护精子的作用。 本发明采用添加一定浓度的BSA（牛血清蛋白）及V_B12注射液可以对精子起到一定的保护作用，有效地提高精子活力及顶体完整率，降低精子畸形率。

本发明采用如下技术方案：

一种牛羊用冷冻精液稀释液配方，每100mL稀释液的配方为： 柠檬酸1.35~1.55g，三羟甲基氨基甲烷（tris）2.4~2.6g，葡萄糖1.0~1.2g，甘油4.5~6.8ml，卵黄18.0~21ml，牛血清白蛋白（BSA）4.5~7.5ml，维生素B₁₂ 0.45~0.75ml，青霉素钾5~10万IU，硫酸链霉素5~10万IU，余量为蒸馏水。

一种牛羊用冷冻精液稀释液配方的制作方法，包括如下步骤：

（1）基础液的配制：取柠檬酸、三羟甲基氨基甲烷（tris）、葡萄糖、加入蒸馏水中，配制成基础液A；

（2）卵黄液的制备：选取新鲜鸡蛋，将蛋壳消毒，在无菌条件下去蛋壳、蛋清；用已灭菌滤纸将卵黄膜表面的蛋清吸干，用无菌注射器抽取卵黄；

（3）将基础液A过滤后，在65℃下进行巴氏消毒灭菌30分钟，温度低于30℃后分别加入经过灭菌的甘油、卵黄,加入牛血清白蛋白（BSA）和维生素B12，搅拌均匀，将PH值调整为6.5~7.5之间，即配制成B液；

（4）使用前，在B液中分别加入青霉素钾及硫酸链霉素，即可使用。 

使用本发明配方时，可以：

1、根据原精精液量、活力及密度换算后确定所需的稀释液添加量。本发明配方可直接加入牛的原精液中，以达到稀释的目地。

2、对于稀释液添加量低于100ml时，可直接将本品分多次加入牛精液中进行稀释；若稀释液添加量超过100ml时，可分两次加入，初次加入原精液体积的3～5倍，后将剩余稀释液与初步稀释后的精液一同放入平衡柜中平衡，分装前30分钟，将剩余稀释液加入精液中，再放入平衡柜中直至分装。

本发明具有如下优点及效果：

1、与国标稀释液配方相比，成本低，配制以及使用操作步骤较为简便。

2、能够有效提高精子的活力（45%~55%）、顶体完整率（≥68%），质膜完成率（≥50%），降低精子畸形率（≤15%，其中绵羊≤18%）。

3、体外授精试验显示：精子穿卵能力增加145%。

4、本发明配方使用范围较广，在肉牛、奶牛、山羊及绵羊精液的制作中均取得良好效果，其精子活力≥45%，顶体完整率≥68%，质膜完整率（≥50%），精子畸形率≤15%（绵羊精子畸形率≤18%）。

 

具体实施例

 实施例1：

（1）基础液的配制：取柠檬酸1.353g，三羟甲基氨基甲烷（tris）2.422g，葡萄糖1.1g，加入68.5ml蒸馏水中，配制成基础液A。

（2）卵黄液的制备：选取新鲜鸡蛋，将蛋壳用75%的酒精消毒，在无菌条件下去蛋壳、蛋清；用已灭菌滤纸将卵黄膜表面的蛋清吸干，用无菌注射器抽取卵黄。

（3）将基础液A过滤后进行巴氏消毒灭菌（65℃30分钟），温度低于30℃后分别加入经过灭菌的甘油5.0ml，卵黄20ml，加入6ml 牛血清蛋白（BSA）和0.5ml维生素B12，再用磁力搅拌器搅拌均匀，将PH值调整为6.5~7.5之间，即配制成B液。

（4）使用前，在B液中分别加入青霉素钾及硫酸链霉素各5万IU，即可使用。 

（5）本配方使用效果最好。

实施例2：

（1）基础液的配制：取柠檬酸1.45g，三羟甲基氨基甲烷（tris）2.56g，葡萄糖1.0g，加入68.4ml蒸馏水中，配制成基础液A。

（2）卵黄液的制备：选取新鲜鸡蛋，将蛋壳用75%的酒精消毒，在无菌条件下去蛋壳、蛋清；用已灭菌滤纸将卵黄膜表面的蛋清吸干，用无菌注射器抽取卵黄。

（3）将基础液A过滤后进行巴氏消毒灭菌（65℃30分钟），温度低于30℃后分别加入经过灭菌的甘油6.5ml，卵黄18ml，加入6.5ml 牛血清蛋白（BSA）和0.6ml维生素B12，再用磁力搅拌器搅拌均匀，将PH值调整为6.5~7.5之间，即配制成B液。

（4）使用前，在B液中分别加入青霉素钾及硫酸链霉素各7.5万IU，即可使用。

实施例3：

（1）基础液的配制：取柠檬酸1.55g，三羟甲基氨基甲烷（tris）2.48g，葡萄糖1.2g，加入64.8ml蒸馏水中，配制成基础液A。

（2）卵黄液的制备：选取新鲜鸡蛋，将蛋壳用75%的酒精消毒，在无菌条件下去蛋壳、蛋清；用已灭菌滤纸将卵黄膜表面的蛋清吸干，用无菌注射器抽取卵黄。

（3）将基础液A过滤后进行巴氏消毒灭菌（65℃30分钟），温度低于30℃后分别加入经过灭菌的甘油6.0ml，卵黄21ml，加入7.5ml 牛血清蛋白（BSA）和0.7ml维生素B12，再用磁力搅拌器搅拌均匀，将PH值调整为6.5~7.5之间，即配制成B液。

（4）使用前，在B液中分别加入青霉素钾及硫酸链霉素各10万IU，即可使用。

需要注意的是，本发明中：

1、所用的化学药品一般为化学纯或为分析纯，使用前均进行溶解过滤。

2、使用的鸡蛋应选取当日产鲜鸡蛋，并经酒精进行表面消毒，取卵黄时一定不要混入蛋白与卵黄膜。

3、甘油使用前须经高压灭菌，灭菌压力0.1-0.15MPa，20分钟。

4、青霉素与链霉素以人用药品最优。

5、配制后的稀释液应保存至4～6℃环境中，应注意密封保鲜不受污染。