一种单光子发射计算机断层成像显像剂及其制备方法

摘要

本发明公开了一种单光子发射计算机断层成像显像剂及其制备方法，特征是先采用固相合成法将两个肽段分别合成出来，得到对应的初产物和最终产物，合成了具有第一类特征结构（Ⅰ）或第二类特征结构（Ⅱ）的单一化合物，以及按所需剂量配比组成成像显像剂。本发明的成像显像剂是小分子，亲水性好，制备容易；又因该成像显像剂的前体小分子有特定酶特异性识别的肽段，因此可主动靶向成像区域，从而实现在活体细胞内控制性自组装放射性纳米结构，研究肿瘤细胞内特定酶的活性。与传统的微纳体系用于疾病早期诊断相比，采用本发明方法不需要在体外合成微纳材料再注入活体内用于肿瘤的诊断，克服了传统纳米材料的低摄取和靶向难的难题。

说明书

技术领域

本发明属于纳米显像剂技术领域，具体涉及单光子发射计算机断层成像的纳米显像 剂及其制备方法。

背景技术

英国《自然》杂志生物技术子刊（Nat.Biotechnol.，2004，Vol.22(8),P.969）公开了 一种用于生物成像的量子点纳米成像剂及其制备方法，虽然这种成像剂具有较好的成像 效果、而且能够抗光漂白，但由于制备该成像剂首先要合成半导体纳米量子点，然后不 仅要修饰上聚乙二醇片段来提高代谢周期，还要修饰上靶标特异性识别的抗体，所以制 备起来比较困难，而且因这类量子点本身所含有的重金属会引起毒性，也限制了这类纳 米成像剂的发展。德国化学会期刊《应用化学》（Angew.Chem.Int.Ed.，2008，Vol.47(15), P.2804）介绍了一种“开关型”近红外金纳米成像剂及其制备方法，虽然该成像剂具有很好 的生物相容性，但由于它是将光学分子修饰在金纳米表面，还要修饰上靶标特异性识别 的肽段，合成比较繁琐，稳定性也不是很好。总之，现有的这些纳米显像剂普遍存在制 备难度高，细胞摄取率低、靶向困难等缺点，而成为限制生物学成像研究的瓶颈。

发明内容

本发明的目的是提出一种单光子发射计算机断层成像显像剂及其制备方法，以获得 能实时控制性自组装的放射性纳米显像剂，克服传统纳米显像剂制备难度高，细胞摄取 率低、靶向困难等缺点，可用于研究肿瘤细胞内特定酶的活性，从而能够实施非侵入、 直观、快速地进行疾病的早期诊断。

本发明的单光子发射计算机断层成像显像剂的制备方法，其特征在于：

第一步、先采用固相合成方法分别合成两段肽链，过程如下：将1毫摩尔2-氯三苯 甲基氯树脂在4-6毫升N，N-二甲基甲酰胺里溶胀4-8分钟后，加入2毫摩尔第一个氨 基酸酪氨酸，再加入2毫摩尔N，N-二异丙基乙胺，反应2-3小时后，用100微升甲醇 反应10-20分钟，切去酪氨酸的保护基，加入活化的1.6毫摩尔第二个氨基酸半胱氨酸反 应2-3小时，切去半胱氨酸的保护基，加入活化的1.6毫摩尔第三个氨基酸精氨酸反应 2-小时，切去精氨酸的保护基，加入活化的1.6毫摩尔第四个氨基酸精氨酸反应2-3小 时，切去精氨酸的保护基，加入活化的1.6毫摩尔第五个氨基酸缬氨酸反应2-3小时，切 去缬氨酸的保护基，再加入活化的1.6毫摩尔第六个氨基酸精氨酸反应3-4小时，切去最 后一个氨基酸精氨酸的保护基，加2-3毫摩尔醋酐反应20-30分钟，最后用含体积浓度为 1%的三氟乙酸的二氯甲烷从该树脂上切下上述合成的肽段，用乙醚层出冷冻离心倾去上 层乙醚，待溶剂挥发干之后所得到的白色固体粉末即是酪氨酸-半胱氨酸-精氨酸-精氨酸- 缬氨酸-精氨酸肽段；再将1毫摩尔2-氯三苯甲基氯树脂在4-6毫升N，N-二甲基甲酰胺 里溶胀4-8分钟后，加入2毫摩尔第一个氨基酸缬氨酸，再加入2毫摩尔N，N-二异丙 基乙胺，反应2-3小时后，用100微升甲醇反应10-20分钟，切去缬氨酸的保护基，加入 活化的1.6毫摩尔第二个氨基酸精氨酸反应2-3小时，切去精氨酸的保护基，加入活化的 1.6毫摩尔第三个氨基酸半胱氨酸反应2-3小时，切去半胱氨酸的保护基，加入活化的1.6 毫摩尔第四个氨基酸精氨酸反应2-3小时，切去精氨酸的保护基，加入活化的1.6毫摩尔 第五个氨基酸酪氨酸反应2-3小时，切去酪氨酸的保护基，再加入活化的1.6毫摩尔第六 个氨基酸精氨酸反应3-4小时，切去最后一个氨基酸精氨酸的保护基，加2-3毫摩尔醋酐 反应20-30分钟，最后用体积浓度为1%的三氟乙酸的二氯甲烷溶液从该树脂上切下上述 合成的肽段，采用乙醚层出冷冻离心倾去上层乙醚，待溶剂挥发干之后所得到的白色固 体粉末即是缬氨酸-精氨酸-半胱氨酸-精氨酸-酪氨酸-精氨酸肽段；

第二步、将上述合成的酪氨酸-半胱氨酸-精氨酸-精氨酸-缬氨酸-精氨酸肽段取0.1毫 摩尔溶于2毫升四氢呋喃溶剂中，加入0.15毫摩尔N-甲基吗啡，冷却至零度时加入0.12 毫摩尔氯甲酸异丁酯，活化半小时后，加入0.12毫摩尔2-氨基-6-氰基苯并噻唑，保持温 度在0-10℃一个小时，室温搅拌反应过夜，经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外320 纳米处有强吸收的组分，即为第一类初产物；再将上述合成的缬氨酸-精氨酸-半胱氨酸- 精氨酸-酪氨酸-精氨酸肽段取0.1毫摩尔溶于2毫升四氢呋喃溶剂中，加入0.15毫摩尔 N-甲基吗啡，冷却至零度时加入0.12毫摩尔氯甲酸异丁酯，活化半小时后，加入0.12毫 摩尔2-氨基-6-氰基苯并噻唑，保持温度在0-10℃一个小时，室温搅拌反应过夜，经过高 效液相色谱分离提纯，收集在紫外320纳米处有强吸收的组分，即为第二类初产物；

第三步、先将上述制备的第一类初产物溶解在10毫升体积浓度为95%的三氟乙酸的 二氯甲烷溶液中搅拌反应3-5小时，经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外320纳米 处有强吸收组分即为终产物第一种化合物X₁或第三种化合物X₃；再将第二类初产物溶 解在10毫升体积浓度为95%的三氟乙酸的二氯甲烷溶液中搅拌反应3-5小时，经过高效 液相色谱分离提纯，收集在紫外320纳米处有强吸收组分即为终产物第五种化合物Y₁或 第七种化合物Y₃；

第四步、采用氯胺T法标记放射性碘，过程如下：首先将50微升浓度为5mg/mL 的第一种化合物X₁加进反应瓶中，注射1mCi ¹²⁵I-NaI，加15微升2mg/mL的氯胺T反 应一分钟，再加入20微升2mg/mL的偏亚硫酸钠终止反应，用配备γ-检测器的高效液相 色谱分离得到对应的第二种化合物X₂；再将50微升浓度为5mg/mL的第一种化合物X₁加进反应瓶中，注射1mCi ¹³¹I-NaI，加15微升2mg/mL的氯胺T反应一分钟，再加入 20微升2mg/mL的偏亚硫酸钠终止反应，用配备γ-检测器的高效液相色谱分离得到对应 的第四种化合物X₄；然后再将50微升浓度为5mg/mL的第五种化合物Y₁加进反应瓶中， 注射1mCi ¹²⁵I-NaI，加15微升2mg/mL的氯胺T反应一分钟，再加入20微升2mg/mL 的偏亚硫酸钠终止反应，其中所加试剂都是溶于pH=7.4的磷酸缓冲溶液中；用配备γ- 检测器的高效液相色谱分离得到对应的第六种化合物Y₂；最后将50微升浓度为5mg/mL 的第五种化合物Y₁加进反应瓶中，注射1mCi ¹³¹I-NaI，加15微升2mg/mL的氯胺T反 应一分钟，再加入20微升2mg/mL的偏亚硫酸钠终止反应，用配备γ-检测器的高效液相 色谱分离得到对应的第八种化合物Y₄;其中第四步里涉及到的第一种化合物X₁、第五种 化合物Y₁、氯胺T、偏亚硫酸钠都是按照上面各自对应的质量体积浓度溶于0.05mol/L, pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液里加入到反应体系中；

其中固相所用的氨基酸都是以9-芴甲氧羰基作为α-氨基保护基， 半胱氨酸的巯基由叔丁硫基保护，精氨酸侧链氨基由保护；当合成肽链 所选的酪氨酸为时，第三步得到的就是第三种化合物X₃第七种化 合物Y₃，当合成肽链所选的酪氨酸为时，第三步得到的就是第 一种化合物X₁和第五种化合物Y₁；其中活化氨基酸的试剂是与氨基酸同物质的量浓度 的1羟基苯并三唑和苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐；在每接上一个氨基酸和 切去保护基时，都要用凯撒测试（kaiser test）试剂检测亚氨基存在与否：若阳性显蓝色， 即表明已剪切完；若阴性显黄色，则表明氨基酸已接上。

由此，本发明的上述单光子发射计算机断层成像显像剂的制备方法中合成了具有第 一类特征结构（Ⅰ）或第二类特征结构（Ⅱ）的以下八种具体的单一化合物：

上面结构式中的基团R₁选自H或Ac，R₂选自H或¹²⁵I或¹³¹I，R₃选自H或Ac，R₄选 自H或¹²⁵I或¹³¹I。

其中具有第一类特征结构（Ⅰ）的单一化合物为：

第一种化合物X₁：其结构式中的基团R₁和R₂都为H；

第二种化合物X₂：其结构式中的基团R₁为H和R₂为¹²⁵I；

第三种化合物X₃：其结构式中的基团R₁为Ac和R₂为I；

第四种化合物X₄：其结构式中的基团R₁为H和R₂为¹³¹I；

具有第二类特征结构（Ⅱ）的单一化合物为：

第五种化合物Y₁：其结构式中的基团R₃和R₄都为H；

第六种化合物Y₂：其结构式中的基团R₃为H和R₄为¹²⁵I；

第七种化合物Y₃：其结构式中的基团R₃为Ac和R₄为I；

第八种化合物Y₄：其结构式中的基团R₃为H和R₄为¹³¹I。

所述具有第一类特征结构（Ⅰ）的化合物是可以被酶特异性识别剪切发生自组装缩 合反应的化合物，所述具有第二类特征结构（Ⅱ）的化合物是不可以被酶识别从而也不 能发生自组装反应的对照化合物；第二种化合物X₂、第四种化合物X₄、第六种化合物 Y₂和第八种化合物Y₄含有放射性碘；第三种化合物X₃和第七种化合物Y₃含有冷的自然 碘，其在实验中与对应的放射性化合物共同培养是为了提高成像剂的化学浓度；第二种 化合物X₂和第六种化合物Y₂是用来做细胞摄取实验，第四种化合物X₄和第八种化合物 Y₄是用来做单光子发射计算机断层成像动物实验。

本发明的单光子发射计算机断层成像显像剂，其特征在于包括按适当剂量配比的由 第三种化合物X₃和第四种化合物X₄组成的显像组混合物，以及与之配套的由第七种化 合物Y₃和第八种化合物Y₄组成的对照组混合物；所述按适当剂量配比是针对不同实验 目的以及临床实验中用到该成像剂时能保证产生效果的最佳量，具体为：第三种化合物 X₃和第七种化合物Y₃的浓度须分别在100μmol/L至200μmol/L之间，第四种化合物X₄ 和第八种化合物Y₄的放射性剂量应分别在2.5mCi/L至4mCi/L之间。

采用本发明方法制备得到的产物，其中除了用于显像剂之外，还包括可用于单光子 发射计算机断层成像显像剂前体研究混合物以及与之配套的对照组混合物，其特征在于 包括按适当剂量配比的第三种化合物X₃和第二种化合物X₂组成的混合物，以及第七种 化合物Y₃和第六种化合物Y₂组成的对照组混合物；所述按适当剂量配比是针对不同实 验条件时能保证产生效果的最佳量，具体为：第三种化合物X₃和第七种化合物Y₃浓度 须分别达到100μmol/L至200μmol/L之间，第二种化合物X₂和第六种化合物Y₂的放射 性剂量应分别在1mCi/L至5mCi/L之间。

与传统的小分子成像剂相比，本发明的纳米成像显像剂显著的优点是通过小分子在 靶点处智能的自组装成纳米材料，在成像区域积累起来，而达到很好的聚集扩大效果， 从而克服了小分子灵敏度不高，血浆半衰期短，使用需要高浓度的缺点，大大提高了成 像灵敏度；与传统的纳米成像剂不同的是，由于本发明的成像显像剂的前体是小分子， 亲水性很好，制备容易，然后能定点到达显像区域自组装成纳米颗粒，因此本发明的成 像显像剂在具备纳米材料的优点的同时又克服了一般纳米材料制备难、低摄取和靶向难 的难题。由于本发明的纳米成像显像剂的前体小分子有特定酶特异性识别的肽段，因此 可以主动靶向成像区域，区别于一般的纳米颗粒靠肿瘤组织的增强渗透和保持效应达到 被动靶向成像区域的目的。因此，利用本发明的单光子发射计算机断层成像显像剂及其 制备方法可以控制性自组装放射性纳米结构，以用于特定酶活性的成像研究。总之，采 用本发明方法不需要在体外合成微纳材料再注入活体内用于肿瘤的诊断，克服了传统微 纳米材料的低摄取和靶向难的难题。这是利用本发明方法活体实时制备纳米药物的智能。 还可以针对某些恶性肿瘤高表达的蛋白水解酶设计前体化合物，从而在肿瘤部位实时自 组装纳米结构，纳米材料可以作为一个载体来装载大量的化学成像剂以有效地提高生物 组织局部的成像剂浓度，这是利用本发明方法的靶向智能。目前这方面的研究工作尚未 见文献报道。综上，本发明具有明显的新颖性和创造性。

附图说明

图1为实施例1中合成的第一种化合物X₁的核磁氢谱图；

图2为实施例1中合成的第三种化合物X₃的核磁氢谱图；

图3为实施例1中合成的第五种化合物Y₁的核磁氢谱图；

图4为实施例合成1中的第七种化合物Y₃的核磁氢谱图。

图5为实施例2中第三种化合物X₃体外缩合形成纳米粒子的透射电子显微镜表征；

图6为实施例2中第三种化合物X₃体外缩合形成纳米粒子的动态光散射分析；

图7为实施例2中第三种化合物X₃体外酶切前后的在500-700nm的紫外吸收图。

图8为实施例3中第二种化合物X₂和第六种化合物Y₂细胞摄取的比较；

图9为实施例3中第二种化合物X₂分别在不同浓度第三种化合物X₃（0，25，50， 100μmol/L）共同孵育30min，将上述混合物从细胞内洗出的时间为160min时及之后在 细胞内残留量的比较；

图10为实施例3中第二种化合物X₂和第六种化合物Y₂分别在有和无100μmol/L 第三种化合物X₃时和第七种化合物Y₃与细胞共同孵育30min后，从细胞内洗出的时间 曲线图；

图11为实施例3中第二种化合物X₂和第六种化合物Y₂分别在有、无100μmol/L第 三种化合物X₃时和第七种化合物Y₃共同孵育30min，将上述混合物从细胞内洗出的时 间为160min时及之后在细胞内残留量的比较。

具体实施方式

下面的实施例1中提供了探针的合成，实施例2为体外验证实验，实施例3为细胞 摄取实验。所述具有第一类特征结构（Ⅰ）的化合物是可以被酶特异性识别剪切发生自 组装缩合反应的化合物，所述具有第二类特征结构（Ⅱ）的化合物是不可以被酶识别从 而也不能发生自组装反应的对照化合物。第二种化合物X₂、第四种化合物X₄、第六种化 合物Y₂和第八种化合物Y₄含有放射性碘，第三种化合物X₃和第七种化合物Y₃含有冷 的自然碘，在实验中与对应的放射性化合物共同培养是为了提高成像剂的化学浓度。第 二种化合物X₂和第六种化合物Y₂是用来做细胞摄取实验，第四种化合物X₄和第八种化 合物Y₄是用来做单光子发射计算机断层成像动物实验。

实施例1：

先采用固相合成法将酪氨酸-半胱氨酸-精氨酸-精氨酸-缬氨酸-精氨酸和缬氨酸-精氨 酸-半胱氨酸-精氨酸-酪氨酸-精氨酸两个肽段分别合成出来。

本实施例中第二种化合物X₂(Acetyl-Arg-Val-Arg-Arg-Cys(StBu)-Tyr(I-125)-CBT)的合 成路线如下：

先采用固相合成法将酪氨酸-半胱氨酸-精氨酸-精氨酸-缬氨酸-精氨酸肽段合成出来， 具体步骤如下：将0.33毫摩尔2-氯三苯甲基氯树脂在2毫升N，N-二甲基甲酰胺里溶胀 五分钟后，在反应器中加入0.66毫摩尔第一个氨基酸加入0.66 毫摩尔N，N-二异丙基乙胺,反应两个小时后，用30微升甲醇反应二十分钟，切去第一 个氨基酸保护基，kaiser测试显蓝色，加入活化的0.55毫摩尔第二个氨基酸半胱氨酸反 应两个小时，kaiser测试显黄色，切去保护基，kaiser测试显蓝色，加入活化的0.55毫 摩尔第三个氨基酸精氨酸反应三个小时，kaiser测试显黄色，切去保护基，kaiser测试 显蓝色，加入活化的0.55毫摩尔第四个氨基酸精氨酸反应三个小时，kaiser测试显黄色， 切去保护基，kaiser测试显蓝色，加入活化的0.55毫摩尔第五个氨基酸缬氨酸反应两个 小时，kaiser测试显黄色，切去保护基，kaiser测试显蓝色，加入活化的0.55毫摩尔第 六个氨基酸精氨酸反应四小时，kaiser测试显黄色，切去保护基，kaiser测试显蓝色， 加1毫摩尔醋酐反应二十分钟，最后用含体积浓度为1%三氟乙酸的二氯甲烷从树脂上切 下肽段，采用乙醚层出冷冻离心倾去上层乙醚，待溶剂挥发干后得到白色固体粉末即是 所要合成的肽段；将上述合成的肽段取用0.1毫摩尔溶于2毫升四氢呋喃溶剂中，加入 0.15毫摩尔N-甲基吗啡，冷却至零度时加入0.12毫摩尔氯甲酸异丁酯，半小时后加入 0.12毫摩尔2-氨基-6-氰基苯并噻唑，保持温度在0℃至10℃一个小时，室温搅拌反应过 夜，经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外320纳米处有强吸收组分即得初产物B； 然后将上一步中得到的初产物B溶解在10毫升体积浓度为95%的三氟乙酸的二氯甲烷 中室温搅拌反应3小时，经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外320纳米处有强吸收 组分即为第一种化合物X₁。上述反应步骤后，还要用氯胺T法标放射性碘，过程如下： 首先将50微升，5mg/mL第一种化合物X₁加进反应瓶中，注射1mCi ¹²⁵I-NaI，加15微 升，2mg/mL氯胺T反应一分钟，加入20微升，2mg/mL偏亚硫酸钠终止反应，其中上 述所加试剂都是溶于pH=7.4的磷酸缓冲溶液中，用配备γ-检测器的高效液相色谱分离得 到第二种化合物X₂。

采用德国布鲁克公司（bruker）布鲁克核磁软件解析本实施例中合成的四种化合物得 到如图1至图4所示的四种核磁氢谱图：

图1是本实施例中合成的第一种化合物X₁的核磁氢谱图；图2为第三种化合物X₃的核磁氢谱图；图3为第五种化合物Y₁的核磁氢谱图；图4为第七种化合物Y₃的核磁 氢谱图。第一种化合物X₁分子式为C₄₉H₇₄N₁₈O₈S₃，[(M+H)⁺]:1139.51，所得质谱为m/z 1139.3。由附图1可见，第一种化合物X₁的核磁氢谱(d-甲醇,300MHz):8.63(s，1H),8.13 (d，J=9.0Hz，1H)，7.70(d，J=9.0Hz，1H),7.10(d,J=9.0Hz，2H)这些为芳香环上的 氢，6.69(d,J=9.0Hz，2H),4.68(t，J=7.6Hz,1H),4.58(q，J=5Hz，1H),4.34(m，3 H),4.16(d，J=7.3Hz，1H),3.14-3.25(m，8H),3.10(d,J=5.4Hz,1H),2.96-3.06(m，2 H),2.04(s,3H)为Ac的氢,1.58-1.95(br,14H),1.32(s,20H),0.98(d,J=6.7Hz，6H)为缬 氨酸的两个甲基氢。

第七种化合物Y₃(Acetyl-Arg-Tyr(Ac)(I)-Arg-Cys(StBu)-Arg-Val-CBT)的合成路线如下：

再采用固相合成法将缬氨酸-精氨酸-半胱氨酸-精氨酸-酪氨酸-精氨酸肽段合成出来， 具体步骤如下：将0.33毫摩尔2-氯三苯甲基氯树脂在2毫升N，N-二甲基甲酰胺里溶胀 五分钟后，在反应器中加入0.66毫摩尔第一个氨基酸缬氨酸，加入0.66毫摩尔N，N- 二异丙基乙胺,反应两个小时后，用30微升甲醇反应二十分钟，切去第一个氨基酸保护 基，kaiser测试显蓝色，加入活化的0.55毫摩尔第二个氨基酸精氨酸反应三个小时，kaiser 测试显黄色，切去保护基，kaiser测试显蓝色，加入活化的0.55毫摩尔第三个氨基酸半 胱氨酸反应三个小时，kaiser测试显黄色，切去保护基，kaiser测试显蓝色，加入活化的 0.55毫摩尔第四个氨基酸精氨酸反应三个小时，kaiser测试显黄色，切去保护基，kaiser 测试显蓝色，加入活化的0.55毫摩尔第五个氨基酸酪氨酸反应三个小时，kaiser测试显 黄色，切去保护基，kaiser测试显蓝色，加入活化的0.55毫摩尔第六个氨基酸精氨酸反 应四个小时，kaiser测试显黄色，切去保护基，kaiser测试显蓝色，加1毫摩尔醋酐反应 二十分钟，最后用含体积浓度为1%三氟乙酸的二氯甲烷从树脂上切下肽段，采用乙醚层 出冷冻离心倾去上层乙醚，待溶剂挥发干后得到白色固体粉末即是缬氨酸-精氨酸-半胱氨 酸-精氨酸-酪氨酸-精氨酸肽段；将上述合成的肽段取用0.1毫摩尔溶于2毫升四氢呋喃溶 剂中，加入0.15毫摩尔N-甲基吗啡，冷却至零度时加入0.12毫摩尔氯甲酸异丁酯，半 小时后加入0.12毫摩尔2-氨基-6-氰基苯并噻唑，保持温度在0℃至10℃一个小时，室温 搅拌反应过夜，经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外320纳米处有强吸收组分即得 初产物K；然后将上一步中得到的初产物K溶解在10毫升体积浓度为95%的三氟乙酸 的二氯甲烷中搅拌反应3小时，经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外320纳米处有 强吸收组分即为第七种化合物Y₃。

第七种化合物Y₃分子式为C₅₁H₇₆IN₁₈O₉S₃,[(M+H)+]:1307.42，所得质谱为m/z 1307.2。由附图4可见，第七种化合物Y₃的核磁氢谱(d-甲醇,300MHz):8.65(d,J=2Hz, 1H),8.13(d,J=9Hz,1H),7.75(dd,J₁=9Hz,J₂=2Hz,2H),7.28(dd，J₁=8.5Hz,J₂=2.2 Hz,1H)，7.02(d,J=8.2Hz,1H)这些为芳香环上的氢，4.54-4.68(br，3H),4.40-4.48(m， 1H),4.37(d，J=7.1Hz，1H),4.23-4.32(m，1H),4.11-4.19(m，1H),3.53-3.60(br，1H), 2.98-3.26(br，15H),2.33(s，3H)为酪氨酸苯环上Ac的氢,2.03(s，3H)为精氨酸封端 处Ac的氢,1.48-1.77(br，13H),1.24-1.43(m，33H),1.05(d，J=6.8Hz，7H)为缬氨酸 的两个甲基氢。

由此，本实施例的上述制备过程中合成了具有第一类特征结构（Ⅰ）或第二类特征 结构（Ⅱ）的以下八种具体的单一化合物：

上面结构式中的基团R₁选自H或Ac，R₂选自H或¹²⁵I或¹³¹I，R₃选自H或Ac，R₄选 自H或¹²⁵I或¹³¹I。

其中具有第一类特征结构（Ⅰ）的单一化合物为：

第一种化合物X₁：其结构式中的基团R₁和R₂都为H；

第二种化合物X₂：其结构式中的基团R₁为H和R₂为¹²⁵I；

第三种化合物X₃：其结构式中的基团R₁为Ac和R₂为I；

第四种化合物X₄：其结构式中的基团R₁为H和R₂为¹³¹I；

具有第二类特征结构（Ⅱ）的单一化合物为：

第五种化合物Y₁：其结构式中的基团R₃和R₄都为H；

第六种化合物Y₂：其结构式中的基团R₃为H和R₄为¹²⁵I；

第七种化合物Y₃：其结构式中的基团R₃为Ac和R₄为I；

第八种化合物Y₄：其结构式中的基团R₃为H和R₄为¹³¹I。

所述具有第一类特征结构（Ⅰ）的化合物是可以被酶特异性识别剪切发生自组装缩 合反应的化合物，所述具有第二类特征结构（Ⅱ）的化合物是不可以被酶识别从而也不 能发生自组装反应的对照化合物；第二种化合物X₂、第四种化合物X₄、第六种化合物 Y₂和第八种化合物Y₄含有放射性碘；第三种化合物X₃和第七种化合物Y₃含有冷的自然 碘，其在实验中与对应的放射性化合物共同培养是为了提高成像剂的化学浓度；第二种 化合物X₂和第六种化合物Y₂是用来做细胞摄取实验，第四种化合物X₄和第八种化合物 Y₄是用来做单光子发射计算机断层成像动物实验。

本发明的单光子发射计算机断层成像显像剂，包括按适当剂量配比的由第三种化合 物X₃和第四种化合物X₄组成的显像组混合物，以及与之配套的由第七种化合物Y₃和第 八种化合物Y₄组成的对照组混合物；所述按适当剂量配比是针对不同实验目的以及临床 实验中用到该成像剂时能保证产生效果的最佳量，具体为：第三种化合物X₃和第七种化 合物Y₃的浓度须分别在100μmol/L至200μmol/L之间，第四种化合物X₄和第八种化合 物Y₄的放射性剂量应分别在2.5mCi/L至4mCi/L之间。

采用上述方法制备得到的产物，其中除了用于显像剂之外，还包括可用于单光子发 射计算机断层成像显像剂前体研究混合物以及与之配套的对照组混合物，包括按适当剂 量配比的第三种化合物X₃和第二种化合物X₂组成的混合物，以及第七种化合物Y₃和第 六种化合物Y₂组成的对照组混合物；所述按适当剂量配比是针对不同实验条件时能保证 产生效果的最佳量，具体为：第三种化合物X₃和第七种化合物Y₃浓度须分别达到100 μmol/L至200μmol/L之间，第二种化合物X₂和第六种化合物Y₂的放射性剂量应分别在 1mCi/L至5mCi/L之间。

实施例2：体外验证实验

本实施例体外实验中采用的是第三种化合物X₃浓度为100μmol/L,在浓度为100 mmol/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、1mmol/L三氯乙基磷酸酯、1mmol/L氯化钙和5μL 的弗林酶的总体积为50μL的溶液里，30℃孵育16小时缩合成二聚体，并自组装成纳米 粒子。

图5给出了本实施例中第三种化合物X₃体外缩合形成纳米粒子的透射电子显微镜表 征；图6为本实施例中第三种化合物X₃体外缩合形成纳米粒子的动态光散射分析；图7 为实施例2中第三种化合物X₃体外酶切前后在500-700nm的紫外吸收图。

其中图5是对本发明方法制备形成的纳米粒子的透射电子显微镜（TEM）表征，采 用本发明方法制备得到的产物其纳米粒子的平均尺寸是415nm。图6是动态光散射 （DLS）分析，显示其平均尺寸为363-429nm。图7是加酶前后紫外吸收在500-700nm 范围内的变化，由图7中可以看出，上方酶切之前的曲线b显示其在500-700nm没有吸 收，下方酶切之后的曲线a显示其在500-700nm有吸收，这表明了缩合反应的发生以及 纳米粒子的形成。

实施例3：细胞摄取实验

首先培养恶性乳腺癌细胞株MDA-MB-468，具体操作如下：恶性乳腺癌细胞株 MDA-MB-468使用含体积浓度10%的牛血清蛋白的DMEM培养基培养，细胞在含体积 浓度为5%CO₂的空气环境的37°C恒温箱里培养，隔一天换一次培养基。

再做细胞摄取实验，具体操作如下：将恶性乳腺癌细胞株MDA-MB-468种在六孔板 里，每个孔大约100万个细胞，体积为1mL,在上面所述的含体积浓度为5% CO₂的空气 环境的37°C恒温培养箱里培养六小时之后，将其中三个孔更换含有1μCi的第二种化合 物X₂的新鲜培养基，并将另三个孔更换含有1μCi的第六种化合物Y₂的新鲜培养基，然 后每隔5,10,20,30和60min，收集部分培养基，用γ计数器测量收集的培养基及细胞 的放射性强度，计算摄取率。

最后做细胞洗出实验，具体操作如下：将恶性乳腺癌细胞株MDA-MB-468种在六孔 板里，每个孔大约100万个细胞，在在上面所述的含体积浓度为5% CO₂的空气环境的 37°C恒温培养箱里培养六小时之后，将第一块板的前三个孔内更换为1mL的含有1μCi 的第二种化合物X₂的新鲜培养基，将其另三个孔内更换为1mL的含有1μCi的第六种化 合物Y₂的新鲜培养基；将第二块板的前三个孔内更换为1mL的含有1μCi的第二种化合 物X₂和25μmol/L的第三种化合物X₃的新鲜培养基，将第二块板的另外三个孔内更换为 1mL的含有1μCi的第二种化合物X₂和50μmol/L的第三种化合物X₃的新鲜培养基；将 第三块板的前三个孔内更换为1mL的含有1μCi的第二种化合物X₂和100μmol/L的第 三种化合物X₃的新鲜培养基，将第三块板的另外三个孔内更换为1mL的含有1μCi的第 六种化合物Y₂和100μmol/L的第七种化合物Y₃的新鲜培养基。培养半小时后，在时间 为5、10、20、40、80和160min时，更换新培养基并收集原培养基，并在160min时 要同时收集细胞，最后用γ计数器测量收集培养基及细胞的放射性强度。

图8为实施例3中第二种化合物X₂和第六种化合物Y₂细胞摄取的比较；图9为实 施例3中第二种化合物X₂分别在不同浓度第三种化合物X₃（0，25，50，100μmol/L） 共同孵育30min，将上述混合物从细胞内洗出的时间为160min时及之后在细胞内残留 量的比较；图10为实施例3中第二种化合物X₂和第六种化合物Y₂分别在有和无100 μmol/L第三种化合物X₃时和第七种化合物Y₃与细胞共同孵育30min后，从细胞内洗 出的时间曲线图；图11为实施例3中第二种化合物X₂和第六种化合物Y₂分别在有、无 100μmol/L第三种化合物X₃时和第七种化合物Y₃共同孵育30min，将上述混合物从细 胞内洗出的时间为160min时及之后在细胞内残留量的比较。

如图8中所示，最上方方块点曲线是第二种化合物X₂的细胞摄取曲线c，中间圆点 曲线是第六种化合物Y₂细胞摄取曲线d，最下面三角曲线是两种化合物摄取差值曲线e。 通过对第二种化合物X₂和第六种化合物Y₂细胞摄取的比较，表明第二种化合物X₂具有 比第六种化合物Y₂高的细胞摄取，并且在孵育30min左右时细胞摄取达到饱和。然后 进一步条件摸索。图9为实施例3中第二种化合物X₂分别在不同浓度第三种化合物X₃（0，25，50，100μmol/L）共同孵育30min后，将上述混合物从细胞内洗出的时间为 160min时及之后在细胞内残留量的比较。将1μCi第二种化合物X₂和不同浓度的第三 种化合物X₃与细胞共同孵育30min后，比较该混合物从细胞内洗出的时间为160min时 及之后细胞内的放射性残留量，左窄斜线柱f、左宽斜线柱g分别是第三种化合物X₃为 0μmol/L和25μmol/L时的细胞放射性残留量，表明细胞放射性残留没有明显变化；右窄 斜线柱h是第三种化合物X₃浓度为50μmol/L时的细胞放射性残留量，表明放射性残留 明显提高；右宽斜线柱i是第三种化合物X₃浓度为100μmol/L时的细胞放射性残留量， 由图9可见其放射性残留是第二种化合物X₂单独孵育时（左窄斜线柱f）的将近四倍， 因此，所得结果证明第三种化合物X₃浓度需要达到100μmol/L时才能发生缩合反应并有 效地提高了放射性第二种化合物X₂在细胞内的摄取。

图10为实施例3中第二种化合物X₂和第六种化合物Y₂分别在有和无100μmol/L 第三种化合物X₃时和第七种化合物Y₃与细胞共同孵育30min后，从细胞内洗出的时间 曲线图。如图10中所示，将1μCi第二种化合物X₂和1μCi第六种化合物Y₂分别与不 同浓度的第三种化合物X₃（0μmol/L对应曲线m,100μmol/L对应曲线k）和第七种化合 物Y₃（0μmol/L时的曲线l,100μmol/L时的曲线j）与细胞共同孵育30min后，在160min 内的洗出曲线，其中图中最低的三条曲线l、j、m分别是1μCi第六种化合物Y₂、1μCi 第六种化合物Y₂和100μmol/L的第七种化合物Y₃的混合物、1μCi第二种化合物X₂与 细胞共同孵育30min后，在160min内的洗出曲线；最高的曲线k是1μCi第二种化合 物X₂和100μmol/L的第三种化合物X₃与细胞共同孵育30min后，在160min内的洗出 曲线。比较细胞内洗出之后细胞内的放射性残留量，可以明显看出1μCi第二种化合物 X₂与100μmol/L第三种化合物X₃具有较高的残留。

图11为实施例3中第二种化合物X₂和第六种化合物Y₂分别在有、无100μmol/L第 三种化合物X₃时和第七种化合物Y₃共同孵育30min，将上述混合物从细胞内洗出的时 间为160min时及之后在细胞内残留量的比较。如图11中所示，左黑柱n、左斜线柱o 分别表示1μCi第二种化合物X₂、1μCi第二种化合物X₂与100μmol/L第三种化合物X₃共同孵育洗出160min后细胞内残留量；右黑柱p、右斜线柱q分别表示1μCi第六种化 合物Y₂、1μCi第六种化合物Y₂与100μmol/L第七种化合物Y₃共同孵育洗出160min 后细胞内残留量。从图11中可见，左斜线柱o的高度是其他三个柱高的将近五倍，表明 1μCi第二种化合物X₂与100μmol/L第三种化合物X₃（左斜线柱o）共同孵育洗出160min 后细胞内残留量是1μCi第二种化合物X₂单独孵育的将近五倍，1μCi第六种化合物Y₂和第七种化合物Y₃在0微摩尔（右黑柱p）与100μmol/L（右斜线柱q）共同孵育比较 所得结果并没有得到提高，并且低于1μCi第二种化合物X₂单独孵育（左黑柱n）的细 胞内的残留量。因此证明第三种化合物X₃浓度需要达到100μmol/L就可以发生缩合反应 并且有效地提高了放射性化合物第二种化合物X₂在细胞内的摄取。

在进行细胞摄取实验之后，就是做动物实验。首先将恶性乳腺癌细胞MDA-MB-468 （高表达弗林酶）于重约20g的裸鼠上建立肿瘤模型。待肿瘤生长至300-700mm³大小， 尾静脉给以2μmol第三种化合物X₃和50μCi第四种化合物X₄。化合物到达肿瘤部位后， 被肿瘤细胞摄取并在细胞内“智能”地自组装成纳米结构，并做SPECT显像。同时将2 μmol第七种化合物Y₃和50μCi第八种化合物Y₄混合物进行对比实验。根据细胞实验结 果可知该成像剂具有很好的效果。

通过上述实施例及其结果可知：本发明的纳米成像显像剂通过小分子在靶点处智能 的自组装成纳米材料，在成像区域积累起来，从而可达到很好的聚集扩大效果，大大提 高了成像灵敏度；由于本发明的成像显像剂的前体是小分子，亲水性很好，制备容易， 然后能定点到达显像区域自组装成纳米颗粒，因此本发明的成像显像剂在具备纳米材料 的优点的同时又克服了一般纳米材料制备难、低摄取和靶向难的难题。由于本发明的纳 米成像显像剂的前体小分子有特定酶特异性识别的肽段，因此可以主动靶向成像区域。 综上，利用本发明的单光子发射计算机断层成像显像剂及其制备方法可以控制性自组装 放射性纳米结构，以用于特定酶活性的成像研究。