一种三唑并吡啶衍生物在制备抗农业真菌药物中的应用

摘要

本发明公开了一种式(I)所示三唑并吡啶衍生物在制备抗农业真菌药物中的应用，本发明所述三唑并吡啶衍生物对苹果斑点病菌、黄瓜菌核病菌、水稻纹枯病菌、雪腐镰刀霉或尖孢镰刀菌具有抑制作用，对雪腐镰刀霉抑制率达49.8％，对尖孢镰刀菌抑制率达66.76％，对苹果斑点病菌或黄瓜菌核病菌抑制率达100％，对水稻纹枯病菌抑制率达66.7％，本发明为抗真菌药物筛选提供了新的品种；

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种三唑并吡啶衍生物在制备抗农业真菌药物中的应用。

(二)背景技术

在新开发的农药化合物中，大约有百分之九十的农药品种含有杂环的 化合物，而含氮杂环占据了大部分，这为农药的发展开辟了广阔的发展空 间。含氮杂环化合物对温血动物毒性很小，尤其对鸟类和鱼类的毒性很低， 而且具有优异的生物活性，如超高效除草活性，杀虫活性，杀菌活性等。 在众多的含氮杂环化合物中，三唑环，吡啶环等因其独特的结构特征、优 良的生物活性以及对人体低毒等特点，在新农药创制研究中具有重要意 义，已经成为当前绿色农药的研究热点之一。

吡啶是苯环的生物等排体，与苯环有着相似的结构和性质，由于吡啶 环有较好的内吸性，其生物活性比相应苯环取代的显著提高，而毒性大大 降低。因而进入九十年代后吡啶类农药有了长足的发展，已经渗透到了农 药的各个应用分支和结构类型中。1，2，4-三唑的化合物同样具有广谱生物 活性，如杀菌、除草、调节植物生长、抗癌等。自第一个三唑类高效杀菌 剂三唑酮问世以来，三唑类化合物一直是农药研究的热点课题之一，迄今 已经开发出了几十种高效、低毒的三唑类杀菌剂。

多个杂环稠合在同一分子中往往能实现其生物活性的叠加和拓宽药 效谱，此类报道在文献屡见不鲜。在农药学研究中，含有吡啶结构的三唑 稠杂环化合物并不多见，同时由于三唑稠杂环化合物的独特生理活性已经 得到了广泛关注，如杀菌、除草、抗癌等。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种三唑并吡啶衍生物新的应用，即在制备抗农业 真菌药物中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种式(I)所示三唑并吡啶衍生物在制备抗农业真菌药物中的应用，

式(I)中R为C1～C4的烷基或取代苯基，所述取代苯基上的取代 基为甲基、硝基、甲氧基、氯原子或氟原子。

进一步，所述R优选为下列之一：间甲基苯甲酸、间硝基苯甲酸、 间氟苯甲酸、间氯苯甲酸、邻甲氧基苯甲酸、对甲氧基苯甲酸、对戊基苯 甲酸、对叔丁基苯甲酸、对丙基苯甲酸、对异丙基苯甲酸、对氯苯氧乙酸、 对硝基苯甲酸、2，4-二氯苯甲酸、邻甲基苯甲酸、对甲基苯甲酸、邻氯苯 甲酸、对氟苯甲酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸或丙酸。

进一步，所述农业真菌为下列之一或一种以上的组合：雪腐镰刀酶、 尖孢镰刀菌、苹果斑点病菌、黄瓜菌核病菌或水稻纹枯病菌。

进一步，本发明所述三唑并吡啶衍生物优选为下列之一：

进一步，所述式(I)所示三唑并吡啶衍生物在制备抗农业真菌药物 中的应用为：将式(I)所示三唑并吡啶衍生物溶于有机溶剂中，制成 10～50mol/L的抗真菌抑制剂，优选20mol/L的抗真菌抑制剂；所述有机 溶剂为二甲基亚砜(DMSO)或二甲基甲酰胺(DMF)，优选DMSO。

进一步，式(I)所示三唑并吡啶衍生物按如下方法制备：将式(II) 所示的2-肼基-3-氯吡啶与式(III)所示的酸在三氯氧磷(POCl₃)中，于 140℃、60W条件下进行微波辐射关环反应15min，反应结束，反应液倒 入水中，再用乙酸乙酯进行萃取，合并有机层，干燥，浓缩，将残余物用 已知方法例如柱层析法或重结晶法来分离和纯化，得到目标产物三唑并吡 啶衍生物；柱层析或重结晶所用溶剂为石油醚、乙酸乙酯、正己烷或乙醇 中的一种或两种以上的混合溶液；所述的2-肼基-3-氯吡啶∶酸∶三氯氧磷 的投料物质的量之比为1∶1.0～1.5∶2～20；

式(III)中R为C1～C4的烷基或取代苯基，所述取代苯基中苯基上 的取代基为甲基、硝基、甲氧基、氯原子或氟原子。

上述制备方法化学反应式为：

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明所述三唑并 吡啶衍生物对苹果斑点病菌、黄瓜菌核病菌、水稻纹枯病菌、雪腐镰刀霉 或尖孢镰刀菌具有抑制作用，对雪腐镰刀霉抑制率达49.8％，对尖孢镰刀 菌抑制率达66.76％，对苹果斑点病菌或黄瓜菌核病菌抑制率达100％，对 水稻纹枯病菌抑制率达66.7％，本发明为抗真菌药物筛选提供了新的品 种。

(四)附图说明

图1雪腐镰刀霉和尖孢镰刀霉的活性测试96孔板加样图，B2到D2为 空白对照孔，E2到G2为阴性对照孔，B3到D3未阳性对照孔，从E3到 H11每三孔一组加样品。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此：

本发明所述三唑并吡啶衍生物(I-1)～(I-14)的制备参见专利申 请201110066188.6。

实施例1

1)抗真菌抑制剂的配制

将三唑并吡啶衍生物(I-1)～(I-14)分别用二甲基亚砜(DMSO) 溶解，分别配制成20mol/L的供试药剂1～14。

2)苹果斑点病菌，黄瓜菌核病菌和水稻纹枯病菌体生长速率测定法 (mycelium growth rate test)

将步骤1)配制的供试药剂1～14分别在无菌条件下用DMSO分别配 制成50μg/mL药液1～14，然后各吸取1mL药液注入培养皿内，再分别 加入9mL琼脂培养基，摇匀后制成含药平板1～14，以添加1mL灭菌 DMSO的平板做空白对照。

将苹果斑点病菌(拉丁名Alternaria mali，出处山东省科学院微生物 所)，黄瓜菌核病菌(拉丁名Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary，出处山 东省科学院微生物所)和水稻纹枯病菌(拉丁名Rhizoctonia solani，出处 山东省科学院微生物所)分别接种于琼脂培养基平板上，25℃培养72h， 获得含菌丝的平板。

用直径4mm的打孔器沿上述菌丝外缘切取菌盘，分别移至含药平板 1～14上。每处理重复三次。将培养皿放在24±1℃恒温培养箱内培养。72 小时后测量各处理菌盘扩展直径，求平均值，与空白对照比较计算相对抑 菌率，结果见表1所示。

3)雪腐镰刀霉和尖孢镰刀霉的活性测试采用美国国家临床实验室标 准委员会(NC-CLS)推荐的标准化抗真菌敏感性实验方法

雪腐镰刀霉(CGMCC 3.2830)取自中国普通微生物菌种保藏管理中 心(CGMCC)，并在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上生长；尖孢镰刀 菌(FGSC A1100)取自真菌遗传学库存中心，并且在RPMI 1640培养基 上培养。在28℃下，上述两种目标菌种(雪腐镰刀霉、尖孢镰刀菌)在 各自培养液中培养48小时，并使真菌孢子悬浮液最终达到10⁴菌丝/毫升。

A：材料及方法

受试菌种(真菌)：

雪腐镰刀霉(CGMCC 3.2830)，尖孢镰刀菌(FGSC A1100)

培养基：

检测培养基(PDB)：200g土豆，20g葡萄糖，1000mL水

设备：

96孔无菌圆底微孔板；

多功能酶标仪TECAN GENios plus；

B：实验方法：

1.靶标菌菌悬液的制备：

雪腐镰刀霉(CGMCC 3.2830)，尖孢镰刀菌(FGSC A1100)

于PDA平板培养基中28℃培养7d致产生孢子。

2.靶标菌接种浓度的计算：

使用血球计数板计算细胞数：

细胞浓度＝每小方格细胞数×4×10⁶cfu/mL

雪腐镰刀霉(CGMCC 3.2830)，尖孢镰刀菌(FGSC A1100)

接种浓度＝0.5-2.5×10⁴cfu/mL

3.检测样品的制备：

准确称取0.5mg三唑并吡啶衍生物(I-1)～(I-14)转移至96孔 浅孔板中挥发干后加入50μgDMSO，配成10mg/mL溶液。

4.阳性对照：

分别将两性霉素B、多菌灵溶于DMSO配成6.4mg/mL溶剂。

5.检测波长：

烟曲霉菌和白色念珠菌采用544nm激发光和595nm的发射光检测 抑菌活性。

6.96孔板的制备：

按表××所示方式于96孔板孔中加入样品，培养基，菌悬液及指示剂。

表1.抗真菌实验样品浓度

表2.抗植物病原菌实验样品体积

  空白对照孔   阴性对照孔   阳性对照孔   样品孔   培养基   190μL   菌悬液   190μL   190μL   190μL   样品   1μL   阳性对照   1μL   指示剂   10μL   10μL   10μL   10μL

7.活性结果的计算于判定：

如图1所示，B2到D2为空白对照孔，E2到G2为阴性对照孔，B3 到D3未阳性对照孔，从E3到H11每三孔一组加样品，活性检测结果按 下列公式计算，结果见表3所示：

样品活性＝[1-(OD_sample-OD_background)/(OD_negative-OD_background)]×100％

OD_sample为样品吸收光(发射光)值

OD_background为空白对照吸收光(发射光)值

OD_negative为阴性对照吸收光(发射光)值

表3抗真菌抑制剂对真菌的抑制率

表1中“-”表示没有测出数值。