一种稳定双链DNA的方法及双链DNA稳定剂

摘要

本发明公开了一种稳定双链DNA的方法，其包括如下步骤：将双链DNA保存于含有氧化石墨烯和金属离子的体系中；所述的金属离子为一价和/或二价金属离子。本发明还公开了与该方法相应的双链DNA稳定剂。本发明首次发现一价和/或二价金属离子可促使氧化石墨烯与双链DNA结合，从而有效的减弱或消除非限制性内切酶、外切酶以及限制性内切酶等多种生物酶对双链DNA的酶切作用。与其他稳定双链DNA的方法比较，本发明的双链DNA稳定方法及稳定剂不需要如硅纳米颗粒或者硅纳米管等特殊的修饰，且水溶性和分散性更好，成本廉价，原料制备工艺成熟，可在需增强双链DNA稳定性的各种生物实验体系得到广泛应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种稳定双链DNA的方法及双链DNA稳定剂。

背景技术

双链DNA作为遗传信息的主要载体，是生命活动中最重要的分子之一。 其独特的物理、化学性质，也使其成为诸多领域的重要研究对象。例如：基 于DNA分子特异碱基识别性的生物传感器技术；以DNA为原料的纳米机 器或纳米图形组装技术；以及以DNA分子为靶向分子进行药物运输和基因 治疗的技术等。然而，DNA分子在生物体外时，极易受环境因子影响，如 各种物理、化学、机械等因子微弱的变化，就会使其发生损伤或断裂，从而 失去其原有的功能。

目前，增强体外双链DNA稳定性的方法，主要包括：

1、物理学方法

如低温储存、冷冻干燥、通入惰性气体并避光等，该过程可抑制外界环 境因子导致的生物化学损伤。该方法已经被广泛应用于DNA的运输和保藏 过程。但由于需要专业的设备，并不适用于日常使用的DNA产品。

2、化学添加剂方法

如可添加一定pH条件的Tris-EDTA(TE)缓冲液，以保护DNA的碱 基完整性，放置其开环或断裂，从而增加DNA的稳定性。该方法是目前应 用非常广泛的溶液体系稳定DNA的方法。添加TE缓冲液后，由于组分中 含有大量EDTA，可以络合多种生物酶反应的金属离子，因而增加了双链 DNA的稳定性。但该方法中，通常对原始DNA的浓度要求较高，因而将 DNA用于多种生化反应过程时，必须对DNA原液中的TE含量进行稀释。

3、商品化稳定剂

BioMatrica^TM公司开发出了名叫的DNA保护系统，其公 司合成了一种聚合物，可使干燥的DNA处于低湿休眠的状态，然后使DNA 获得长时间的保存而不被损伤。应用该方法可保证DNA产品运输稳定性， 但与传统物理学方法类似，使用时需将DNA干粉再溶解。

4、纳米材料保护DNA的方法

近年来，纳米材料对DNA稳定性的影响开始引起人们的兴趣。例如： 应用碳纳米管保护寡核苷酸进入细胞的药物传送体(Carbon nanotubes protect  DNA strands during cellular delivery，ACS Nano.2008，2(10)，2023-2028.)； 使质粒DNA吸附在带有经过氨基修饰的硅纳米颗粒表面或者硅纳米管内部 (Bioconjugated nanoparticles for DNA protection from cleavage，J.Am.Chem. Soc.2003，125，7168-7169；Preparation of fluorescent silica nanotubes and their  application in gene delivery.Adv.Mater.2005，17，404-407.)，从而保护基因 工程的质粒DNA在细胞内不被降解；通过纳米金颗粒与寡核苷酸结合 (Nano-flares：probes for transfection and mRNA detection in living cells.J.Am. Chem.Soc.2007，129，15477-15479.)，从而增强核苷酸稳定性用于生物检 测等。

但是，作为一种优秀的碳二维晶体材料，氧化石墨烯对DNA稳定性影 响研究刚刚开始。现有文献(Constraint of DNA on functionalized graphene  improves its biostability and specificity.Small 2010，6(11)，1205-1209.)报道， 氧化石墨烯可增强短单链DNA的稳定性，单链DNA与氧化石墨烯通过π-π 相互作用结合后，可防止其被DNase I酶切，但当其互补单链DNA存在时， 形成的双链可以被DNase I酶切。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的稳定双链DNA的方法或 者需要专用设备，或者操作不够简便的缺陷，而提供一种稳定双链DNA的 方法及双链DNA稳定剂。

本发明人基于大量实验的摸索，意外发现，对DNA酶的活性有促进作 用的一价和/或二价金属离子反而可使氧化石墨烯与双链DNA结合，从而达 到显著的增强优异的防止DNA酶酶切双链DNA的作用。基于此，本发明 通过下述技术方案解决上述技术问题：

本发明涉及一种稳定双链DNA的方法，其包括如下步骤：将双链DNA 保存于含有氧化石墨烯和金属离子的体系中；所述的金属离子为一价和/或二 价金属离子，较佳的为镁离子、钙离子、钠离子和钾离子中的一种或多种。

其中，所述的氧化石墨烯的量以可有效的减弱或消除DNA酶酶切双链 DNA的用量为准。经本发明筛选，所述的氧化石墨烯在体系中的浓度较佳 的为0.005～0.3mg/ml。

其中，所述的金属离子的量为可使氧化石墨烯有效的减弱或消除DNA 酶酶切双链DNA的用量为准。经本发明筛选，所述的金属离子在体系中的 浓度较佳的为0.05～250mM。所述的金属离子可以盐的形式加入体系中。所 述的盐为本领域可接受的对DNA无损害的水溶性盐类，如氯化盐、硫酸盐、 硝酸盐或碳酸盐等。

本发明还涉及一种双链DNA稳定剂，其包括氧化石墨烯和金属离子； 所述的金属离子为一价和/或二价金属离子，较佳的为镁离子、钙离子、钠离 子和钾离子中的一种或多种。

其中，所述的金属离子的存在形式可为盐，所述的盐同前述。

所述的双链DNA稳定剂可还包括水，为溶液形式(能直接使用的溶液 形式，或需经稀释才使用的浓缩液形式)，也可为固体干粉形式(如冻干粉)。

所述的双链DNA稳定剂中，氧化石墨烯和金属离子的量以可有效的减 弱或消除DNA酶酶切双链DNA的量为准，较佳的以使用时经稀释或不稀 释能达到前述在体系中的较佳浓度为宜。

所述的双链DNA稳定剂可为所有成分混合的单一试剂形式，也可为包 含独立包装组分的成套试剂盒形式。

本发明的双链DNA稳定方法和稳定剂对双链DNA的保护作用不受 DNA酶的酶切方式的限制。因此，本发明的双链DNA稳定方法和稳定剂可 适用于减弱或消除各种限制性或非限制性DNA酶对DNA的酶切活性，例 如对不具特异识别位点的非限制性外切酶(如Bal31)和内切酶(如DNase I)， 以及具有特异识别位点的限制性内切酶(如EcoRII)。

本发明中，所述的氧化石墨烯可为现有的各种氧化石墨烯，可通过市 售获得，或按现有方法制备。现有制备氧化石墨烯的方法均参照文献 (Preparation of graphite oxide.J.Am.Chem.Soc.1958，80，1339)中所述通过 氯酸钾、硝酸、高锰酸钾或硫酸等氧化剂氧化石墨制备氧化石墨烯的方法。 例如，具体可参照下述文献方法制备(1)Graphene and Graphene Oxide： Synthesis，Properties，and Applications.Adv.Mater.2010，online.；(2) Reduction of graphene oxide via L-ascorbic acid.Chem.Commun.，2010，46， 1112-1114；(3)High Yield Preparation of Macroscopic Graphene Oxide  Membranes.J.Am.Chem.Soc.2009，131，898。

在符合本领域常识的基础上，上述各条件，可任意组合，即可得到本发 明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。

本发明的积极进步效果在于：本发明首次发现一价和/或二价金属离子可 促使氧化石墨烯与双链DNA结合，从而有效的减弱或消除非限制性内切酶、 外切酶以及限制性内切酶等多种生物酶对双链DNA的酶切作用。与其他稳 定双链DNA的方法比较，本发明的双链DNA稳定方法和稳定剂不需要如 硅纳米颗粒或者硅纳米管等特殊的修饰，且水溶性和分散性更好，成本廉价， 原料制备工艺成熟，可在需增强双链DNA稳定性的各种生物实验体系得到 广泛应用。

附图说明

图1为效果实施例1中不同浓度和种类的金属离子存在下，氧化石墨烯 与双链DNA混合样品的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为效果实施例2在金属离子存在下氧化石墨烯抑制非限制性内切酶 DNase I对双链DNA酶切的琼脂糖凝胶电泳图。

图3为效果实施例3在金属离子存在下氧化石墨烯抑制非限制性外切酶 Bal 31对双链DNA酶切的琼脂糖凝胶电泳图。

图4为效果实施例4在金属离子存在下氧化石墨烯抑制限制性内切酶 EcoR II对双链DNA酶切的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在 所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常 规方法和条件，或按照商品说明书选择。

下述实施例中，氧化石墨烯由上海交通大学郭守武教授课题组按照文献 (Preparation of graphite oxide.J.Am.Chem.Soc.1958，80，1339.)所述的制 备方法合成。

效果实施例中，双链DNA的来源为：以pBR322DNA环状质粒为模板， 进行PCR扩增，获得长度为886bp的DNA目标片段(上游引物：TGA CGA CCA TCA GGG ACA；下游引物：TAAAGC GGG CCA TGT TAA)；DNaseI 从Sigma公司购买；Bal 31和EcoR II从TaKaRa公司购买。

实施例1

双链DNA稳定剂：单一溶液形式(能直接使用)。将需要保护的双链 DNA加入该双链DNA稳定剂，溶液体系中含0.005mg/ml氧化石墨烯，以 及10mM硝酸镁。

实施例2

双链DNA稳定剂：单一溶液形式(能直接使用)。将需要保护的双链 DNA加入该双链DNA稳定剂，溶液体系中含0.3mg/ml氧化石墨烯，以及 0.05mM硫酸钠。

实施例3

双链DNA稳定剂：固体干粉试剂盒形式，包括分别独立包装的150mg 氧化石墨烯和5mol碳酸钠。使用时，用水配制为氧化石墨烯悬浊液，以及 氯化镁溶液，将需要保护的双链DNA加入该双链DNA稳定剂，溶液体系 中含15mg/ml氧化石墨烯，50mM碳酸钠。

实施例4

双链DNA稳定剂：单一溶液形式(浓缩液，使用时用水稀释)。用水稀 释该双链DNA稳定剂，加入需要保护的双链DNA，溶液体系中含0.15mg/ml 氧化石墨烯、20mM氯化镁、20mM氯化钙、20mM氯化钠和20mM氯化钾。

效果实施例1  一价和二价金属离子促使氧化石墨烯与双链DNA的结合

一、不同浓度镁离子促使氧化石墨烯与双链DNA的结合

1、实验方法

将双链DNA分别加入无镁离子或含不同浓度镁离子(终浓度分别为5、 2.5、1、0.5、0.25、0.1、0.05mM)，以及氧化石墨烯(终浓度0.15mg/ml) 的溶液中，经琼脂糖凝胶电泳对各体系进行目标位置DNA量的比较。

2、实验结果

实验结果如图1的a所示，与双链DNA的阳性对照(泳道1)相比， 在没有镁离子参与下双链DNA与氧化石墨烯混合后没有变化(泳道2)，混 合不同终浓度镁离子后(泳道3～7镁离子终浓度分别为5、2.5、1、0.5、0.25、 0.1、0.05mM)，氧化石墨烯和双链DNA结合形成较大的双链DNA-氧化石 墨烯复合体，表现为较为明显的拖尾现象或点样孔滞留。

二、不同金属离子促使氧化石墨烯与双链DNA的结合

1、实验方法

将双链DNA分别加入含氯化镁(终浓度2.5mM)、氯化钙(终浓度 2mM)、氯化钠(终浓度100mM)和氯化钾(终浓度20mM)、氧化石墨烯 (终浓度0.15mg/ml)的溶液中，经琼脂糖凝胶电泳对各体系进行目标位置 DNA量的比较。

2、实验结果

实验结果如图1的b所示，与双链DNA的阳性对照(泳道1)相比， 在没有金属离子参与下双链DNA与氧化石墨烯混合后没有变化(泳道2)， 分别加入终浓度为2.5mM氯化镁(泳道3)、2mM氯化钙(泳道4)、100mM 氯化钠(泳道5)、20mM氯化钾(泳道6)后，氧化石墨烯和双链DNA结 合形成较大的双链DNA-氧化石墨烯复合体，表现为较为明显的拖尾现象和 点样孔滞留。由上述结果说明，不同的其他一价和/或二价金属离子均可促使 氧化石墨烯与双链DNA的结合。

效果实施例2对非限制性内切酶DNase I的酶切活性的抑制

一、氧化石墨烯抑制DNase I对双链DNA的酶切

DNase I是一种非限制性核酸酶，可从DNA的任意位点进行酶切作用， 直至将全部DNA片段酶切为单个核苷酸为止。本发明使用非限制性内切酶 DNase I对添加或未添加氧化石墨烯的DNA体系进行酶切，以考察氧化石 墨对抑制DNase I对双链DNA的酶切作用。

1、实验方法

两种DNA体系：一个是常规保存(水中，4℃)的双链DNA，另一个 在常规保存溶液基础上添加终浓度为0.15mg/ml的氧化石墨烯。

按试剂盒说明书，向上述两种DNA体系中分别加入10×酶切反应缓冲 液(体系中含终浓度2mM氯化镁)，以及1U DNase I，37℃温浴条件下进行 酶切反应。对常规保存的双链DNA体系，反应1min，添加有氧化石墨烯的 体系延长至10min和30min。经琼脂糖凝胶电泳对目标位置DNA量进行比 较。

2、实验结果

实验结果如图2的a所示，与双链DNA的阳性对照(泳道1)相比， 未加氧化石墨烯的双链DNA，经过37℃温浴1min后，目标位置双链DNA 完全消失，(泳道2)；而加入氧化石墨烯后，将温浴时间分别延长至10min (泳道3)和30min(泳道4)，目标位置双链DNA仍然存在，但荧光强度 减弱。从图中可以看出，在氯化镁存在下，氧化石墨烯可抑制DNase I对双 链DNA的酶切，且保护时间可达30min以上。

二、不同浓度的氧化石墨烯抑制DNase I对双链DNA的酶切

1、实验方法

分别采用添加终浓度为0、0.025、0.05、0.1、0.15、0.2和0.25mg/ml 氧化石墨烯的DNA体系。按试剂盒说明书，向上述各DNA体系中分别加 入10×酶切反应缓冲液(体系中含终浓度2mM氯化镁)，以及1U DNaseI， 经37℃温浴10min。经琼脂糖凝胶电泳对目标位置DNA量进行比较。

2、实验结果

实验结果如图2的b所示，双链DNA的阳性对照为泳道1，泳道2-8 中，氧化石墨烯终浓度依次为0、0.025、0.05、0.1、0.15、0.2和0.25mg/ml。 该结果表明，在氯化镁存在下，0.025～0.25mg/ml的氧化石墨烯均可在较好 保护双链DNA，减弱DNase I的酶切作用。随着氧化石墨烯浓度逐渐增加， 在阳性对照的位置，双链DNA的荧光强度也逐渐增加，尤其是在氧化石墨 烯终浓度为0.1～0.15mg/ml时，保护作用最显著。

效果实施例3对非限制性外切酶Bal 31酶切活性的抑制

一、氧化石墨烯抑制Bal 31对双链DNA的酶切

Bal 31核酸酶为一种外切酶，可从双链DNA的两端同时进行酶切反应， 直至将全部DNA片段切为单个核苷酸为止。本发明使用非限制性外切酶Bal 31，对添加或未添加氧化石墨烯的DNA体系进行酶切，以考察氧化石墨对 抑制Bal 31对双链DNA的酶切作用。

1、实验方法

两种DNA体系：一个是常规保存(水中，4℃)的双链DNA，另一个 在常规保存溶液基础上添加终浓度为0.10mg/ml的氧化石墨烯。

按试剂盒说明书，向上述两种DNA体系中分别加入5×酶切反应缓冲 液(体系中含终浓度为240mM氯化钠、4.8mM氯化钙、4.8mM氯化镁)， 以及2U Bal31，37℃温浴条件下进行酶切反应。对常规保存的双链DNA体 系，反应2min。添加有氧化石墨烯的体系延长至30min和60min。经琼脂 糖凝胶电泳对目标位置DNA量进行比较。

2、实验结果

实验结果如图3的a所示，与双链DNA的阳性对照(泳道1)相比， 未加氧化石墨烯的双链DNA，经37℃温浴2min后，目标位置双链DNA完 全消失(泳道2)；而加入氧化石墨烯后，将温浴时间分别延长至30min(泳 道3)和60min(泳道4)，目标位置双链DNA仍然存在，但荧光强度减弱。 从图中可以看出，在氯化钠、氯化钙和氯化镁的存在下，氧化石墨烯可抑制 Bal 31对双链DNA的酶切，且保护时间可达60min以上。

二、不同浓度的氧化石墨烯抑制Bal 31对双链DNA的酶切

1、实验方法

分别采用添加0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25和0.3mg/ml氧化石墨烯 的DNA体系，按试剂盒说明书，向上述各DNA体系中分别加入5×酶切反 应缓冲液(体系中含终浓度240mM氯化钠、4.8mM氯化钙、4.8mM氯化镁)， 以及2U Bal 31，经37℃温浴2min。经琼脂糖凝胶电泳对目标位置DNA量 进行比较。

2、实验结果

实验结果如图3的b所示，双链DNA的阳性对照为泳道1，泳道2-8 中，氧化石墨烯浓度依次为0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3mg/ml。结 果表明，在该体系下，0.05～0.3mg/ml氧化石墨烯均可保护双链DNA，随着 氧化石墨烯浓度逐渐增加，在阳性对照的位置，双链DNA的荧光强度也逐 渐增加，0.1～0.25mg/ml的氧化石墨烯(泳道4-7)保护双链DNA的效果最 好。

效果实施例4对限制性内切酶EcoR II酶切活性的抑制

一、氧化石墨烯抑制EcoR II对双链DNA的酶切

EcoR II核酸酶是一种限制性内切酶，只对具有特异识别位点的双链 DNA位置进行酶切反应，针对本实施例中的双链DNA(886bp)，该内切酶 作用位点在该序列的第371bp处，可将该双链DNA酶切成371bp和515bp 两种长度的DNA。本发明使用限制性内切酶EcoR II，对添加或未添加氧化 石墨烯的两种DNA体系进行酶切，以考察氧化石墨对抑制EcoR II对双链 DNA的酶切作用。

1、实验方法

两种DNA体系：一个是常规保存(水中，4℃)的双链DNA，另一个 在常规保存溶液基础上添加终浓度为0.05mg/ml的氧化石墨烯。

按试剂盒说明书，向上述两种DNA体系中分别加入10×酶切反应缓冲 液(体系中含终浓度2.5mM氯化镁、25mM氯化钾)，以及2U EcoR II，37℃ 温浴条件下进行酶切反应。对常规保存的双链DNA体系，反应8min。添加 有氧化石墨烯的体系延长至30min和60min。经琼脂糖凝胶电泳对目标位置 DNA量进行比较。

2、实验结果

实验结果如图4的a所示，与双链DNA的阳性对照(泳道1)相比， 未加氧化石墨烯的双链DNA，经37℃温浴8min后，目标位置双链DNA完 全消失，在其下方产生了两条DNA产物条带(泳道2)；而加入氧化石墨烯 后，将温浴时间分别延长至30min(泳道3)和60min(泳道4)，虽然仍有 少量双链DNA被限制性内切酶酶切，但大部分双链DNA被保留下来。从 图中可以看出，在氯化镁和氯化钾的作用下，EcoR II存在下，氧化石墨烯可 抑制EcoR II对双链DNA的酶切，且保护时间可达60min以上。

二、不同浓度的氧化石墨烯抑制EcoR II对双链DNA的酶切

1、实验方法

分别采用添加0、0.005、0.125、0.025、0.05和0.06mg/ml氧化石墨烯 的DNA体系，按试剂盒说明书，向上述两种DNA体系中分别加入10×酶 切反应缓冲液(体系中含终浓度2.5mM氯化镁、25mM氯化钾)，以及2U EcoR II，经37℃温浴8min。经琼脂糖凝胶电泳对目标位置DNA量进行比较。

2、实验结果

实验结果如图4的b所示，双链DNA的阳性对照为泳道1，泳道2-7 中，氧化石墨烯浓度依次为0、0.005、0.125、0.025、0.05和0.06mg/ml。 结果表明，随着氧化石墨烯浓度逐渐增加，目标位置的双链DNA的荧光强 度略有下降，但被EcoR II降解的产物也减少。该结果表明在这个体系， 0.005～0.06mg/ml的氧化石墨烯均能起到保护双链DNA的作用，但从特异性 和产量综合考虑，0.05～0.06mg/ml的氧化石墨烯用量更佳。