一种肾综合征出血热双价疫苗及其制备方法

摘要

本发明公开了一种肾综合征出血热疫苗及其制备方法。该疫苗是汉坦病毒（

说明书

技术领域

本发明涉及到一种新的汉坦病毒（Hantavirus），以及由该病毒制备的肾综合征出血热的双价疫苗，本发明还涉及该疫苗的制备方法。 

背景技术

肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS）是由汉坦病毒（Hantaviruses）引起的经啮齿类动物传播的自然疫源性疾病，具有地区性、爆发性、周期性、易变性的流行特点。我国HFRS疫区已从80年代600多个县市扩大到现在1300多个县市，疫区类型亦发生改变；在国外，新型疫区也在不断扩大和演变。人通过气溶胶吸入、伤口、消化道等途径感染病毒而发病。该病死亡率高，危害性大。我国是汉坦病毒感染影响最严重的国家，在过去十年中每年报道的HFRS病例达到25,000至60,000例，占世界发病人数的90％以上。疫苗预防是目前唯一有效控制HFRS的手段。1978 年韩国李镐汪首先分离到HFRS 病毒后，我国自1981～1982 年先后从黑线姬鼠和褐家鼠体内分离到HFRS 病毒，各地亦从不同动物和人体分离到许多病毒株。对HFRS疫区病毒型别进行鉴定，80年代前为汉滩型（HTN型）疫区，之后又出现汉城型（SEO型）且两型并存，2003年又报道有普马拉型（PUU型）出现。病毒的成功分离为疫苗的开发奠定了基本条件，我国已批准生产的灭活疫苗包括地鼠肾细胞疫苗（Ⅱ型，SEOV，L99株）、沙鼠肾细胞疫苗（Ⅰ型，HTNV，Z10株）、纯化鼠脑细胞疫苗（Ⅰ型，HTNV，LR1株）三种单价疫苗和双价（Ⅰ、Ⅱ型）沙鼠肾细胞疫苗相继初步研制成功。这4种疫苗的三期临床观察，在防治和控制HFRS上起到了重要的作用。然而，疫苗所用病毒来自早期分离获得，以Ⅰ型HFRS疫苗毒种Z10和 LR1为例，分别分离自 1982年浙江省HFRS疫区病人血清和1983年捕获于陕西省疫区黑线姬鼠肺组织，是否作为疫苗株病毒合适，并未证明，病毒的遗传背景亦不清楚，也并非针对近年来HFRS流行的优势疫苗株。 

汉坦病毒属于布尼亚病毒科汉坦病毒属，其基因组由大（L）、中（M）、小（S）三个单股负链的RNA组成，分别编码RNA多聚酶，两个包膜蛋白（G1 和G2）和核蛋白（N），其中以M基因所承受的来自HV感染宿主的免疫压力最大，变异最显著。在不同型的汉坦病毒中，其S片段3′NCR区 核苷酸序列除手柄状部分外，其余部分差异亦较大。汉坦病毒极易发生变异，存在不同型别及亚型之间。若变异引发病毒毒力即致病性的改变，则现有疫苗可能失去保护性效果，导致新疫区的不断出现和扩大，并出现HFRS的爆发流行。此外，以上这些疫苗株生物特性的分子学基础研究，如基因组测定、分析和与国内毒株亲缘关系的比较等，都是在疫苗临床使用后才进行。可以说明这些疫苗株的代表性不强，因此，要控制HFRS流行就必须对HFRS流行与演变的规律及本质有足够的认识，同时必须明确流行高峰期的优势流行病毒株的本质，才能制备出更具有针对性、预防效果更好的疫苗。 

本发明在获得湖北地区1985～2000年HFRS患者体内汉坦病毒的M基因特征的基础上，拟用RT-PCR、核苷酸测序等技术进一步分析长江中下游地区1985～2009年间鼠源、螨源及人源汉坦病毒的S、M片段高变区基因变异频率与变异位点，从而明确流行高峰期的优势流行病毒株的特征。在此基础上，分离得到流行高峰期的优势流行病毒株并大规模培养，最终获得这一地区具有代表性肾综合征出血热疫苗毒株。然后对病毒进行灭活、超滤和浓缩，经层析纯化，鉴定获得灭活疫苗，并进行疫苗原液、疫苗的效力和其他常规项目的检测以及疫苗免疫原性、安全性和保护性的评价，完成疫苗生产的临床前研究。本发明可为制订HFRS的防治方案，控制该病的流行和汉坦病毒疫苗的研制策略提供新的理论依据。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型汉坦病毒，以及由该病毒制备灭活疫苗，用于肾综合征出血热的防治。 

本发明的另一目的在于提供一种包括上述汉坦病毒的双价疫苗。 

本发明的再一个目的在于提供上述疫苗的制备方法。 

本发明人通过采集自长江中下游地区1985～2009年鼠源、螨源、人源的汉坦病毒标本，对其S、M基因进行核苷酸序列分析，获得汉坦病毒基因变异情况，进一步筛选得到优势病毒疫苗株HV004，该病毒已于2011年12月7日在中国典型培养物保藏中心(简称CGMCC，地址：武汉市武昌珞珈山邮编：430072)保藏，分类命名为汉坦病毒属(Hantavirus)汉滩型，保藏号为CCTCC No.v201139。 

进而本发明提供一种由上述病毒制得的肾综合征出血热疫苗。该疫苗可以是由上述病毒灭活制得，此外还可以加入佐剂，例如铝佐剂，以增强免疫效果。 

此外，上述病毒还可以与其他病毒制成双价或多价疫苗，例如，将上述病毒HV004与汉坦病毒Hubei-Ⅰ株制备成双价疫苗。 

本发明疫苗可以按照常规方法制备获得，例如，将所述病毒在宿主细胞或组织中增值，收获病毒液后，经灭活纯化处理，即得。以单价疫苗为例，将上述病毒在乳鼠脑组织连续传代，收获发病鼠脑，研磨成匀浆，经灭活纯化处理，即得。具体地，将发病鼠脑研磨成匀浆后，取上清加将发病鼠脑研磨成匀浆后，取上清加硫酸鱼精蛋白（终浓度为1mg/ml），经蔗糖密度梯度区带离心11万g离心2.5h，取在30%与45%以及45%与60%之间一条明亮的带，用逐滴加入10%W/V BPL，使其最终浓度为1/4000，加入10%V/V Al(OH)3胶体佐剂，汉坦病毒按抗原量为1：128稀释，总蛋白含量不超过40μg/剂。双价疫苗的制备和单价疫苗类似，在获得病毒液时，将两者混合，再继续处理即可。具体地，将上述两种病毒分别在乳鼠脑组织连续传代，分别将发病鼠脑研磨成匀浆后，取上清加将发病鼠脑研磨成匀浆后，取上清加硫酸鱼精蛋白（终浓度为1mg/ml），经蔗糖密度梯度区带离心11万g离心2.5h，取在30%与45%以及45%与60%之间一条明亮的带，用逐滴加入10%W/V BPL，使其最终浓度为1/4000，加入10%V/V Al(OH)₃胶体佐剂，汉坦病毒按抗原量为1：128稀释，总蛋白含量不超过40μg/剂。 

本发明具有如下优点： 

（1）本发明通过对长江中下游地区1985～2009年鼠源、螨源、人源的汉坦病毒标本的S、M基因进行核苷酸序列分析，在此基础上，得到了这一地基因特征。本发明中所确立的汉坦病毒疫苗株是在已有毒株序列的基础上得到的毒株，具有代表性。

（2）本发明通过对病毒基因的分析，确立了长江中下游地区汉坦病毒优势流行株，使疫苗株病毒的选择较传统疫苗株更有针对性。 

（3）本发明中对优势流行株进行分离培养，在乳鼠体内传代增毒、纯化，β-丙内酯灭活，最终获得了适用于HFRS预防的疫苗。 

附图说明

图1显示的是ELISA检测不同组血清特异性IgG抗体的水平； 

图2显示的是不同组的小鼠脾脏细胞刺激率；

图3、4显示的是流式检测胞内γ干扰素染色结果。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的生化试剂为市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 

实施例1 汉坦病毒（Hantavirus）HV004的获得及鉴定

1、病毒采集及测序

（1）收集长江中下游地区1985～2009年鼠肺组织、螨媒悬液、HFRS患者血标本。

（2）对这一地区鼠肺组织、螨媒悬液、HFRS患者血标本进行间接免疫荧光（Indirect immunofluorescence, IFA）、酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay, EILSA）、（Reverse transcriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR）法检测，筛选鼠源、螨源、人源的病毒抗原阳性标本。其中RT-PCR筛选过程如下：用病毒特异性RNA提取试剂盒（Promega）提取标本总RNA；核酸分析仪检测RNA含量，所有标本RNA OD260/280≥1.9，后取50ng RNA进行RT-PCR反应；使用随机引物逆转录，其反应条件为37oC反应60min，93oC 5min终止反应，迅速置冰上冷却3min；PCR使用设计的新型汉坦病毒通用引物（序列5’-3’GATTGAAGATATTGAGTCACC, P1/ 5’-3’GTTGTATCCCCATTGATTGTG, P2），其反应条件为94oC预变性3min，94oC变性1min，50oC复性1min，72oC延伸1min，循环35次，最后72oC延伸5min；1.5%琼脂糖凝胶电泳观察病毒核酸扩增结果。切下含目的片段的凝胶，采用Omega gel Extraction kit（Omega）回收DNA，纯化后的DNA 溶于ddH₂O 中。纯化后的PCR 产物的测序交由INVITROGEN 公司（上海）完成，序列测定引物为PCR 引物。 

2、确定汉坦病毒优势毒株 

已完成624份人源性，896份鼠源性样本，3829份螨媒标本的RNA的提取和阳性标本的筛选工作。获得人源性汉坦病毒阳性标本537份，鼠源性汉坦病毒阳性标本58份，从螨体内检测出病毒RNA。详细内容如下：

（1）从HFRS患者血清中共筛选出阳性标本：从624份HFRS患者血清中共筛选出阳性标本537份，获得汉坦病毒 S、M片段序列。完成了166份长江中游地区HFRS患者阳性样本的分型检测；获得了74份人源样本的序列结果。对现有的病毒基因同源性分析，结果显示，长江中下游地区HFRS爆发的病毒既有HTN型病毒，也有SEO型病毒。前者以与76-118株同源为主，后者以与Z37株相似的病毒为主。

（2）鼠样本中筛选出阳性样本：从687性样本中筛选出阳性样本45阳性率6.5%。获得了206份鼠源样本的测序结果，并进行病毒与宿主基因同源性分析，结果显示，目前长江中下游地区汉坦病毒的流行仍以SEO型和HTN型为主，并且有明显的地区聚集性。对病毒进行进化树分析发现可将我们获得的SEO型病毒分为三个进化分支，他们都与Z37株有较高的同源性高达96%～100%。HTN型汉坦病毒基因变化更加多样，它们与Q32和76-118株有较高的同源性分别为83.9~84.4%和89.0~89.2％。从鼠体内分离汉坦病毒 S、M基因序列系统进化树分析。 

3、优势病毒疫苗株分离及鉴定 

（1）无菌条件下取汉坦病毒的阳性标本黑线姬鼠鼠肺约 0.3 g，加 3 m l研磨液（含1% PS的DMEM）在冰上研磨成1：10的悬液。吸取0.02ml悬液，注射到2～3日龄的BALB/C鼠脑内；正常饲养21天或发病后无菌取鼠的心、脑、肺、肾组织，用RT-PCR检测为阳性后，用脑组织匀浆液重新接到新生乳鼠脑内，以这样的方法进行8代扩增，取心、脑、肺、肾等组织于-80℃保存。

（2）同时将b步骤中含有病毒组织按培养基原液（1：1000）匀浆后取100μL接种在Vero E6细胞，在Vero E6细胞上盲传3代后，通过IFA检测为阳性，核酸鉴定亦为HV004基因型。 

（3）对HV004病毒株序列测定和系统进化分析： 

对部分S 片611nt（558-1168nt）以及M片段1353nt（51-1404nt）进行了扩增，并进行了同源性分析。M片段与其他HTN型汉坦病毒的碱基以及推断的氨基酸同源性分别为82.8%-90.6%和92.6%-97.6%，而与其他型别的汉坦病毒的碱基同源性低于70%。通过部分S片段的分析，也可得到相似的结果。S、M两个基因的进化分枝均为一个新的独立分枝，即HTNV-#10。以上结果说明该分离的病毒与HTN型汉坦病毒的同源性更高，属HTNV型汉坦病毒。分析HV004的分子特性，以及它能在Vero E6细胞和乳鼠体内传代增毒，说明HV004可适用于制备肾综合征出血热灭活疫苗。该病毒已于2011年12月7日在中国典型培养物保藏中心（简称CGMCC，地址：武汉市武昌珞珈山 邮编：430072）保藏，分类命名为汉坦病毒（Hantavirus）HV004，保藏号为CCTCC No.v201139。

实施例2 病毒疫苗的制备

1、单价疫苗的制备

（1）将HV004经BALB/C乳鼠脑组织连续传8代，收获发病鼠脑，研磨成匀浆，加硫酸鱼精蛋白（终浓度为1mg/ml），初步去除组织DNA，外源DNA含量不大于10ng/剂量。

（2）经蔗糖密度梯度区带离心11万g离心2.5h，取在30%与45%以及45%与60%之间一条明亮的带，纯化病毒颗粒。病毒滴度为6.5 lgCCID50/ml；细菌检查和支原体检查为阴性，采用IFA法测定病毒滴度为1：1024。 

（3）用2%V/V HEPES 1mol/L pH7.5和0.14%W/V NaHCO3在4℃调纯化病毒原液pH至7.4，逐滴加入10%W/V BPL，使其最终浓度为1/4000。灭活24h，将灭活的病毒液再经37℃水解2小时，置2～8℃保存，应不超过30日（15日）。同时做病毒毒力回复实验为阴性。 

（4）测定蛋白含量≥200ug/ml，ELISA测定抗原量为1：4096。 

（5）汉坦病毒按抗原量为1：128稀释：将高压灭菌的Al(OH)3按10%比例加入浓缩、纯化后的病毒液中，并按0.02%（W/V）的比例加入柳硫汞制备得Al(OH)₃佐剂灭活疫苗。且总蛋白含量不超过40μg/剂。 

2、多价疫苗的制备 

方法同单价疫苗的制备，具体如下：

（1）Ⅱ型病毒株Hubei-Ⅰ株（SEO型）的制备时同HV004病毒株。

（2）病毒滴定：病毒滴度为6.5 lgCCID50/ml；细菌检查和支原体检查为阴性，采用IFA法测定病毒抗原为1：1024。 

（3）用2%V/V HEPES 1mol/L pH7.5和0.14%W/V NaHCO3在4℃调纯化病毒原液pH至7.4，逐滴加入10%W/V BPL，使其最终浓度为1/4000。灭活24h，将灭活的病毒液再经37℃水解2小时，置2～8℃保存，应不超过30日（15日）。同时做病毒毒力回复实验为阴性。 

（4）测定蛋白含量≥200ug/ml，ELISA测定抗原量为1：4096。 

（5）将Ⅰ型和Ⅱ型汉坦病毒单价原液分别按抗原量为1：128稀释后等量混合， 且总蛋白含量不超过40μg/剂含量10%Al(OH)3佐剂即为疫苗。 

实施例3 动物实验

以下以单价疫苗为例作详细说明：

1、疫苗安全性实验

（1）动物过敏实验研究

取样品10ml，同时以小牛血清作为对照，皮下接种三只豚鼠，豚鼠选用250-350g之间。每只接种1ml，间隔一周后进行第二次注射，每只皮下1 ml，使豚鼠致敏，致敏三周后再以相同样品静脉注射每只0.5ml，观察豚鼠无过敏性反应出现。

（2）异常毒性实验 

异常毒性试验应进行Balb/C和豚鼠两种动物试验，试验动物应达到清洁级别。小鼠选用体重18-22g，豚鼠选用250-350g之间。注射前分别称取小鼠和豚鼠的体重，每只小鼠0.5ml检品，豚鼠每只5.0ml，观察7天体重变化与正常组无较大差别。

2、疫苗免疫性实验 

    接种方法：于0，7，14，21d皮下给予①正常对照组pbs组②高剂量疫苗组（10ug/ml）③中剂量疫苗组（5ug/ml）④低剂量疫苗组（2.5ug/ml）。于第60天检测细胞免疫和体液免疫水平：

（1）ELISA检测血清特异性IgG抗体的水平。在490nm下读取的OD值高剂量组明显高于PBS组且差异显著（p<0.001），低剂量组与PBS组无明显差异（p>0.05）（见图1）。

（2）无菌取感小鼠脾脏常规法制备脾淋巴细胞悬液。以含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液调整细胞浓度为2×10⁶/ml，加至96孔细胞培养板中，100 μl/孔，每组每个样品做六个复孔，前三个复孔每孔加入含10%的胎牛血清的RPMI-1640培养液100 μl，作为对照组，后三个复孔每孔加入含5 μg/ml刀豆蛋白及10%的胎牛血清的RPMI-1640培养液100 μl孔，作为试验孔。置37℃、5%CO₂培养箱培养48 h，在终止培养前4小时加20 μl/孔的MTT，混匀后继续培养4 h后离心，弃上清。每孔加100 μl的DMSO，振荡混匀后在酶标仪490 nm的波长下检测其每孔的吸光度值（OD值）。脾细胞增值率用刺激率（SI）表示：SI=试验孔OD均值/对照孔OD均值。图二所示为高剂量组SI大于PBS组（p<0.01）。 

（3）胞内γ干扰素染色：从不同免疫组动物体内取出腹股沟淋巴结和脾脏制成单细胞悬液（效应T 细胞）。从同种背景的阴性对照小鼠分离脾脏细胞，感染汉坦病毒以用作靶细胞。用淋巴细胞刺激试验和胞内r干扰素染色评价T细胞免疫应答。表一所示为不同组CD3+CD8+阳性T细胞百分百。*代表高剂量组CD3+CD8+T细胞高于PBS组（p<0.05）。 

表1 不同组CD3+CD8+阳性T细胞%

组别CD3+CD8+（%）PBS组8.11±0.20高剂量组13.08±0.85*中剂量组11.63±1.89低剂量组11.36±1.31病毒组12.21±0.74

图2所示为各组胞内γ干扰素染色。胞内γ干扰素染色高剂量组大于PBS组（p<0.05）。

3、疫苗保护性性实验 

   方法：根据上述实验，于第28天攻毒，剂量为5LD50 76-118株腹腔注射100ul。观察28天，观察小鼠体重变化及死亡情况。攻毒后各组小鼠体重都有减轻，免疫组小鼠体重于一周后缓解。病毒组小鼠于第22天有3只（3只/12只）发生死亡，死亡率为25%。其余各组未见死亡情况，死亡保护率为100%。

    双价疫苗也作了类似的实验，结果表明其取得了类似的保护效果。 

   序列表

 

<110>  武汉大学

 

<120>  一种肾综合征出血热双价疫苗及其制备方法

 

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<170>  PatentIn version 3.5

 

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<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

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<212>  DNA

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