一种柞蚕卵巢细胞培养基及其应用

摘要

本发明公开一种柞蚕卵巢细胞培养基的组成成分、配制方法及其在柞蚕卵巢细胞培养中的应用。将配制好的氨基酸和糖混合贮藏液(MLM-AAS)、无机盐贮藏液(MLM-Salt)、维生素贮藏液(MLM-Vit)和牛血清白蛋白、胎球蛋白等按一定比例配制，并调pH为6.2-6.4，制得MLM-45培养基，用于柞蚕卵巢细胞培养前，按20％体积比加入胎牛血清和1％体积比的青链霉素混合液。通过多种实验确定该细胞体外生长条件为培养温度26-28℃，pH6.2～6.4；渗透压315-350mOsm/kg。本发明为进行柞蚕生物学、柞蚕病原微生物及相关领域研究提供技术服务。

说明书

技术领域

本发明涉及昆虫解剖学、昆虫组织培养学等领域，具体涉及一种柞蚕卵巢细胞培养基、及其在柞蚕卵巢细胞体外培养技术中的应用。 

背景技术

昆虫细胞培养是从昆虫体内取出细胞，模拟昆虫体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使细胞生存、生长并维持结构和功能的一门技术。原代细胞因刚从组织中分离开，生物学特性未发生很大变化，仍保留原来的遗传特性，也最接近和反映体内生长特性，适宜用于药物敏感性试验、细胞分化等实验研究。20世纪初，许多昆虫学家尝试过使用体外培养的昆虫细胞作为科学研究的工具。最早进行昆虫组织体外培养的是德国Richard Goldschmiedt(1915)，他使用惜比古天蚕(Hyalophora cecropia)蛾的精子进行体外培养，用来观察精子的发育(Goldschmidt and Kaiser，1915)。在20世纪30年代，美国Trager进行了家蚕(Bombyx mori)细胞原代培养，首次研究了昆虫细胞体外生长条件，家蚕细胞在培养基中的体外生存可维持3周。50年代，加拿大Wyatt改进了家蚕卵巢细胞培养条件，成功设计了昆虫细胞培养基IPL-16。60年代，Grace等进一步改良了昆虫细胞培养基，至今已广泛用于昆虫细胞系的培养与研究。 

随着细胞生物学和分子生物学的相互渗透，分子生物学实验技术与细胞培养技术的结合，使细胞在阐明基因的结构与功能、基因在细胞生长和分化中的作用等方面发挥了重要的作用。同时，昆虫细胞培养和分子生物学的应用对于了解昆虫的生理和发育机制，昆虫与真菌、微孢子虫、细菌和病毒在细胞和分子水平的相互作用方面也起了重要作用。2002年钱永华等利用家蚕细胞研究家蚕微孢子虫的形成、生活史和侵染家蚕的过程等。2004年肖仕全利用家蚕胚胎细胞系对家蚕类浓核病毒毒理进行了研究，早在1995年邓宁等利用昆虫细胞大规模培养进行杆状病毒杀虫剂的生产。由此可见，建立昆虫细胞培养方法，对了解昆虫与微孢子虫、细菌和病毒等相互作用关系的一些理论问题提供了技术手段；同时也为生物防治工厂化生产昆虫病毒制剂开辟了新途径。 

柞蚕(Antheraea pernyi)是我国重要的经济昆虫，辽宁是我国的主产区，每年产量5万吨左右。由于柞蚕以蛹滞育越冬，可长期保存。柞蚕丝除了可以织绸外，还可广泛用于军工、化工、医药等方面；柞蚕蛹含有大量蛋白质和氨基酸，营养丰富，也是深受人们喜爱的昆虫食品；另外，由于柞蚕蛹、蛾、卵、幼虫等四个不同变态阶段中含有多种生物活性物质，近年 来又成为保健品、生物药品等的重要原料；柞蚕蛹或细胞又是近年发展起来的基因工程中得重要的生物反应器，因此，人们对柞蚕的需求越来越多，其经济价值和社会效益也在不断提高。但由于柞蚕放养在野外，经受着各种病毒、细菌、微孢子虫等病原微生物的侵袭，时有病害的发生，导致部分蚕农减产甚至绝收，影响了蚕农放养柞蚕的积极性，严重地阻碍了柞蚕生产的发展，而柞蚕细胞又是研究这些病害发病机理及病原侵染规律必要的工具与平台，因此，开展柞蚕细胞培养方法研究，建立柞蚕卵巢细胞培养方法对发展柞蚕生产及相关研究具有重要意义。 

发明内容

为了发展柞蚕生产及相关研究，本实验室已对柞蚕蛹、幼虫的卵巢细胞进行了大量的离体培养试验，与此同时，研发了比较适合该细胞体外生长的培养基配方、培养条件和培养方法。本发明涉及的柞蚕卵巢细胞培养基的配制方法是，将配制好的氨基酸和糖混合贮藏液(MLM-AAS)、无机盐贮藏液(MLM-Salt)、维生素贮藏液(MLM-Vit)和牛血清白蛋白、胎球蛋白等按一定比例混合，并调pH制得MLM-45培养基，用于柞蚕卵巢细胞培养前，加入胎牛血清和青链霉素混合液。通过多种实验确定该细胞体外生长条件为培养温度，pH值及渗透压值，本发明为进行柞蚕生物学、柞蚕病原微生物及相关领域研究提供技术服务。 

本发明的具体技术方案如下： 

本发明的一方面在于：提供一种柞蚕卵巢细胞培养基MLM-45的组成成分，每配制1000mL，其具体组成成分及用量如下： 

分别称取上述组分，加蒸馏水至1000mL，调pH6.2-6.4，过滤除菌，4℃保存； 

其中： 

(a)每配制1000mL的5倍浓缩的氨基酸和糖混合贮藏液，其具体组成成分及用量如下： 

分别称取上述组分，加蒸馏水至1000mL，过滤除菌，-20℃保存； 

(b)每配制1000mL的10倍浓缩的MLM-Salt，其具体组成成分及用量如下： 

分别称取上述组分，加蒸馏水至1000mL，过滤除菌，4℃保存； 

(c)每配制100mL的1000倍浓缩的MLM-Vit，其具体组成成分及用量如下： 

分别称取上述组分，加蒸馏水至100mL，过滤除菌，-20℃保存。 

具体的，上述的MLM-45培养基在调节pH的时候，使用10mol/LKOH。 

具体的，上述的MLM-45培养基在过滤除菌的时候，使用0.22μm或0.45μm的微孔滤膜。 

本发明的另外一方面在于：上述MLM-45培养基在培养细胞中的应用。 

对于上述MLM-45培养基在培养细胞中的应用，具体的，应用于培养柞蚕卵巢细胞的条件为： 

使用前，向MLM-45培养基中，按20％的体积比加入胎牛血清，按1％的体积比加入青链霉素混合液；所使用的青链霉素混合液中，青霉素、链霉素的浓度均为10,000单位/mL； 

细胞培养温度为26～28℃； 

细胞培养pH为6.2～6.4； 

细胞培养渗透压值为315-350mOsm/kg。 

除上述涉及的细胞培养温度、pH及渗透压值之外，活细胞离体培养的操作方法、细胞培养基的配制、使用及培养条件控制方法，细胞的换液传代，细胞形态的观察与检测等实验方法均按照本领域技术人员的常规操作执行，其具体实施方式见实施例所述。 

对于使用上述MLM-45培养基培养柞蚕卵巢细胞的实验中，最佳的培养条件为： 

细胞培养温度为27℃； 

细胞培养pH为6.3； 

细胞培养渗透压值为325mOsm/kg。 

有益效果： 

本发明首次进行柞蚕卵巢细胞的离体培养，发明了该细胞的最佳培养基配方、培养条件(温度、pH和渗透压值)、培养方法等。该方法操作方便，安全无污染，细胞生长营养成分全面，适用于柞蚕细胞培养。为利用该细胞进行柞蚕及相关领域研究提供了技术平台。 

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。 

本发明通过下述技术方案实现：柞蚕卵巢细胞离体培养方法；细胞体外培养基配方组成及配制方法；细胞体外培养条件；细胞培养监控与调整。其中，实施例所涉及的试剂来源如下： 

MM、TC-100、GRACE、TNM-FH、SF-900、IPL-41等培养基均购自Gibico公司，MGM-443、MGM-448、MLM-45等培养基配方中所有组分及牛血清白蛋白(Albumin)均购自Sigma公司，试验用胎牛血清(Fetal calf serum)购自美国Hyclone公司，胎球蛋白(Fetuin)购自日本Nacalai Tesoue Inc，青链霉素混合液(青霉素、链霉素各10,000单位/mL)购自北京索莱宝科技有限公司。 

实施例1柞蚕卵巢细胞培养基MLM-45配方组成及配制方法 

培养基配方组成及培养液的配制。培养基由氨基酸、糖、无机盐、维生素和促细胞生长添加剂组成。 

表1.配制5倍1000mL氨基酸和糖混合贮藏液(×5，MLM-AAS)，其组成成分及用量： 

  5倍MLM-AAS成分>  用量(g)>  L-Cystine(L-胱氨酸)>  0.28>  L-Tyrosine(L-酪氨酸)>  0.425>  α-Alanine(α-丙氨酸)>  1.55>  β-Alanine(β-丙氨酸)>  1.05>  L-Arginine-HCl(L-精氨酸)>  3.45>  L-Aspartic acid(L-天冬氨酸)>  3.75>  L-Asparagine(L天冬酰胺)->  3.75>  L-Glutamic acid(L-谷氨酸)>  4.5>

[0044] 

  L-Glutamine(L-谷氨酰胺)>  4.5>  L-Glycine(L-甘氨酸)>  2.3>  L-Histidine(L-组氨酸)>  4.25>  L-Isoleucine(L-异亮氨酸)>  2.6>  L-Leucine(L-亮氨酸)>  0.405>  L-Lysine-HCl(L-赖氨酸)>  3.25>  L-Methionine(L-蛋氨酸)>  2.25>  L-Phenylalanine(L-苯丙氨酸)>  3.4>  L-Proline(L-脯氨酸)>  1.95>  DL-Serine(DL-丝氨酸)>  2.65>  L-Threonine(L-苏氨酸0>  0.8>  L-Tryptophan(色氨酸)>  0.425>  L-Valine(L-缬氨酸)>  2.5>  Glucose(葡萄糖)>  12.5>  Fructose(果糖)>  2.5>  Sucrose(蔗糖)>  87.5>

上述组分加蒸馏水至1000mL，0.45μm微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存。 

表2.配制10倍1000mL无机盐贮藏液(×10，MLM-Salt)其组成成分及用量 

  10倍MLM-Salt成分>  用量(g)>  NaHCO₃  3.5>  MgSO₄.7H₂O>  13.58>  NaH₂PO₄.2H₂O>  8.78>  KCl>  33.7>  MgCl₂.6H₂0>  19.68>  CaCl₂  10.97>

上述组分加蒸馏水至1000mL，0.45μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存。 

表3.配制1000倍100mL维生素贮藏液(×1000，MLM-Vit)，其组成成分及用量 

  1000倍MLM-Vit成分>  用量(g)>  Folic acid(叶酸)>  0.16>  Biotin(生物素)>  0.08>

[0051] 

  Riboflavin(核黄素)>  0.16>  Thiamine-HCl(硫胺素)>  0.2>  Ca-Pantothenate(泛酸钙)>  0.02>  Pyridoxine-HCl(吡哆醇)>  0.02>  P-Aminobenzoic acid(对氨基苯甲酸)>  0.16>  Nicotinic acid(尼克酸)>  0.02>  Myo-Inositol(肌醇)>  0.02>  Choline chloride(氯化胆碱)>  1.6>

上述组分加蒸馏水至100mL，0.45μm微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存。 

表4.配制1000mL MLM-45培养基，其组成成分及用量 

  MLM-45成分>  用量>  5倍MLM-AAS>  200mL>  10倍MLM-Salt>  100mL>  1000倍MLM-Vit>  1mL>  牛血清白蛋白(Albumin)>  5.0g>  胎球蛋白(Fetuin)>  0.02g>

上述成分加蒸馏水至1000mL，用10mol/L KOH和lmol/LHCL调pH6.2-6.4，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存。 

实施例2柞蚕卵巢细胞离体培养方法 

青六号柞蚕品种(5龄幼虫和蛹)材料由辽宁省蚕业科学研究所提供。 

1、柞蚕卵巢细胞的获取： 

(a)柞蚕蛹卵巢细胞的获取：取健康柞蚕蛹，用75％乙醇进行体表消毒20min，于超净工作台内用无菌蒸馏水洗涤3次，无菌纱布吸干体表水分，用大头针固定在用紫外灭菌2h的解剖蜡盘中。无菌操作剪开腹部，用眼科剪刀和镊子解剖取出卵巢组织于无菌的Corlson缓冲液(1000mlCorlson液配方：NaCl 7g、KCl 0.2g、CaCL₂ 0.2g、MgCl₂.6H2O 0.1g、NaH₂PO4 0.2g、NaHCO₃ 0.05g、葡萄糖8g)的小平皿中，剔除卵巢上粘连的脂肪组织和被膜等，再将卵巢转移至盛有无菌的Corlson缓冲液小烧杯中，洗涤3次。 

采用机械法将卵巢组织剪碎成0.5～1mm³大小的组织块，加细胞培养液，用灭菌吸管温和抽吸后，直接将悬液连同组织块一起接种25mL细胞培养瓶(底面积为17.5cm²)中，将小块 均匀涂布于瓶壁，一般在培养瓶可接种20～30个卵巢为宜，然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞。 

(b)柞蚕5龄幼虫卵巢细胞的获取：取健康柞蚕5龄幼虫，体表消毒前，需要把5龄幼虫饥饿24h，其余步骤与柞蚕蛹卵巢细胞的获取方法相同。 

2、柞蚕卵巢细胞培养条件： 

该细胞体外培养用MLM-45培养液按培养液的20％的体积比添加胎牛血清，再按培养液的1％的体积比添加青链霉素混合液，用10mol/L KOH调节pH至6.2～6.4，控制渗透压值为315～350mOsm/kg，置26～28℃生化培养箱中静止培养。开始时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养24小时后再补液，培养初期移动和观察时要轻拿轻放，前几天尽量不去搬动，以利贴壁和生长，每天在倒置显微镜下观察细胞形态变化，根据生长变化监控培养温度、培养液pH、培养液渗透压变化，每隔7天更换一半培养液。一方面补充营养，一方面有去除代谢产物的作用。 

实施例3柞蚕卵巢细胞体外培养条件 

利用目前已有的商品昆虫培养基(MM、TC-100、MGM-443、GRACE、IPL-41、MGM-448、TNM-FH、SF-900)和实施例1所制得的MLM-45培养基进行细胞生长试验。 

选用上述不同昆虫培养基，在相同培养条件下培养柞蚕蛹及幼虫卵巢细胞2个月后，于相差倒置显微镜下观察发现MLM-45培养基细胞生长情况好于其他几种，通过Trypan Blue染色计数细胞存活情况(见表5)。利用MLM-45培养基进行不同温度(4℃、15℃、20℃、26℃、27℃、28℃、30℃、37℃)条件下细胞生长试验，以确定细胞最适生长温度(表6)。利用MLM-45培养基进行了不同pH(pH5.5、6.0、6.2、6.3、6.4、6.5、7.0)对细胞生长影响试验，确定最适细胞生长pH(表7)。利用MLM-45培养基进行细胞培养液不同渗透压(285mOsm/kg、295mOsm/kg、315mOsm/kg、325mOsm/kg、345mOsm/kg、365mOsm/kg、380mOsm/kg)试验，以确定该细胞生长最适渗透压(表8)。 

表5不同培养基卵巢细胞存活情况 

^*细胞分裂，数量倍增 

表5不同昆虫培养基对比试验可见MLM-45培养基培养柞蚕卵巢细胞明显优于其他几种培养基，并且在柞蚕蛹卵巢细胞培养试验中细胞出现了分裂，数量成倍增长，表明MLM-45培养基为柞蚕卵巢细胞生长最佳培养基； 

表6 MLM-45不同培养温度卵巢细胞生长情况 

  温度(℃)>  4>  15>  20>  25>  26>  27>  28>  30>  37>  培养时间(天)>  7>  7>  7>  7>  7>  7>  7>  7>  7>  幼虫细胞存活率(％)>  3.5>  36.7>  41.8>  76.3>  97.8>  98.9>  95.1>  13.0>  0>  蛹细胞存活率(％)>  2.8>  25.6>  40.3>  75.5>  99.8>  ＞100^*  96.8>  11.5>  0>

^*细胞分裂，数量倍增 

表6选取不同培养温度进行柞蚕卵巢细胞体外生长试验，表明26-28℃均适宜细胞生长，最佳培养温度为27℃； 

表7 MLM-45不同pH卵巢细胞生长情况 

  pH>  5.5>  6.0>  6.2>  6.3>  6.4>  6.5>  7.0>  培养时间(天)>  7>  7>  7>  7>  7>  7>  7>  幼虫细胞存活率(％)>  0>  50.2>  90.4>  98.6>  97.5>  58.7>  0>  蛹细胞存活率(％)>  0>  45.6>  93.8>  ＞100^*  96.4>  56.5>  0>

^*细胞分裂，数量倍增 

表7进行不同pH对柞蚕细胞生长试验，结果表明适宜柞蚕卵巢细胞生长pH为6.2-6.4，最佳细胞生长pH为6.3。 

表8 MLM-45不同渗透压细胞生长情况 

  渗透压(mOsm/kg)>  285>  295>  315>  325>  345>  365>  380>  培养时间(天)>  30>  30>  30>  30>  30>  30>  30>  幼虫细胞存活率(％)>  26.4>  45.5>  86.7>  98.8>  95.9>  54.6>  0>  蛹细胞存活率(％)>  28.5>  50.6>  85.7>  ＞100^*  96.7>  52.3>  0>

[0082] ^*细胞分裂，数量倍增 

表8为不同渗透压对细胞生长影响，试验结果表明柞蚕卵巢细胞体外生长适宜渗透压值范围为315-350mOsm/kg，最佳渗透压值325mOsm/kg。 

柞蚕卵巢细胞培养监控与调整：随着培养时间增加，原培养液营养被消耗，导致营养缺乏，大量活细胞和组织块代谢产物增多，pH变酸，不利于细胞生长，此时细胞还未长成单层，未达到饱和密度，仍需继续培养，因此，需采取换液方式来更新营养成分以满足细胞继续生长繁殖的需要。其换液方法是按1∶1更换，即弃去一半旧液，加入与原培养液相同的等量完全培养基。在倒置显微镜下观察细胞生长变化，做到实时监控细胞生长周围环境变化，包括培养温度、pH、渗透压等，出现问题及时调整。