海湾扇贝抗热相关金属硫蛋白基因标记及其辅助育种方法

摘要

本发明属于水产生物技术领域，具体的说是一种海湾扇贝抗热相关金属硫蛋白基因标记及其辅助育种方法。海湾扇贝抗热相关金属硫蛋白基因标记为序列表SEQ ID No.1碱基序列所示，起始密码子上游第337个碱基A为抗热基因位点。本发明首次筛选了海湾扇贝金属硫蛋白基因的多态性位点并发掘了抗热相关的金属硫蛋白基因标记，建立了抗热基因标记辅助育种方法。本发明具有针对性强、选育效率高、操作简便快捷等特点，适用于贝类抗热相关标记的筛选和抗热优良品种的选育。

说明书

技术领域

本发明属于水产生物技术领域，具体的说是一种海湾扇贝抗热相关金属硫蛋白基因标记及其辅助育种方法。 

背景技术

我国的扇贝养殖业在经过最初阶段的蓬勃发展以后，逐渐暴露出了许多亟待解决的问题。长期的近亲繁育、累代养殖导致了近交衰退，使得海湾扇贝生长缓慢、抗逆性降低。近年来环境恶化尤其是夏季高温使扇贝机体代谢紊乱，经常发生大规模死亡事件，造成巨大经济损失。因此，加快育种核心前沿技术的研究和抗逆优良品种的选育已成为保障扇贝养殖业持续发展的关键。但由于目前国内外对贝类抗热机理及抗热功能基因的研究较少，缺乏抗热相关的分子标记，导致贝类抗热品种培育的研究进展缓慢，很大程度上制约了扇贝养殖业稳定、健康和可持续发展。 

金属硫蛋白是一类低分子量、富含巯基和能螯合金属离子的蛋白质，在机体内行使多种功能，例如参与生物体内必需金属元素的调节和非必需金属元素的解毒作用，活性氧的清除以及机体生长、发育、生殖、衰老、肿瘤发生、免疫、应激反应等生理生化反应。有研究表明，生物体受到热胁迫时若干基因表达上调，其中金属硫蛋白作为氧化还原系统的组分反应尤为剧烈。研究表明金属硫蛋白能够广泛清除包括超氧阴离子、过氧化氢、羟基(-HO)在内的ROS类物质，是一种内源性抗氧化剂，同时它能进一步调控其他抗氧化酶的表达，从而协助机体对抗氧化胁迫。目前关于贝类金属硫蛋白的研究多集中在它对重金属调控及活性氧清除等方面，但其多态性与贝类抗热力强弱之间的关系研究仍未见报道，因此寻找扇贝金属硫蛋白基因的多态性，并研究多态位点在耐热相关不同种群中的分布特征，将为研究和利用金属硫蛋白基因作为潜在的抗热性标记辅助选择的候选基因奠定基础。 

发明内容

本发明的目的在于一种海湾扇贝抗热相关金属硫蛋白基因标记及其辅助育种方法。 

为实现上述目的，本发明采用技术方案为： 

一种海湾扇贝抗热相关金属硫蛋白基因标记，湾扇贝抗热相关金属硫蛋白基因标记为序列表SEQ ID No.1碱基序列所示，起始密码子上游第337个碱基A为抗热基因位点。 

海湾扇贝抗热相关金属硫蛋白基因标记的获得，按如下步骤获得： 

1)海湾扇贝金属硫蛋白基因启动子区部分序列的克隆；以海湾扇贝闭壳肌的总DNA为模板，根据已知的金属硫蛋白基因序列在启动子区设计引物AiMT1pF和AiMT1pR扩增得到DNA序列，待用；AiMT1pF 5′-atgtaagggcacttatgcttgatctttagt-3′和AiMT1pR 5′-agcagtcaggaccagcacagcca-3′； 

2)抗热相关金属硫蛋白基因标记的筛选；对来自抗热群体和热敏感群体的各6个个体的12个克隆进行测序，其多态性位点为-488C/T，-450A/C，-447G/C，-440A ins-del，-431T/C，-430G/A，-428A/T，-375T/C，-363T/G，-337A/C，-311T/A，-310A/T，-298G/T，-265A/G，-253A/G，-251T/C和-118C/T；再提取50个热敏感个体和50个抗热个体的基因组DNA后，针对-375T/C位点多态，首先PCR扩增金属硫蛋白启动子区序列，然后选用Mse I对PCR产物进行酶切，聚丙烯酰胺凝胶电泳后，得-375T/T，-375T/C和-375C/C 3种基因型，以-337A/C位点多态，利用Bi-PASA PCR进行分析，琼脂糖凝胶电泳后，得-337A/A，-337A/C和-337C/C 3种基因型，经Chi-square Test分析，-337A/A个体在抗热群体中出现的频率显著高于敏感群体，即-337A/A为抗热相关的金属硫蛋白基因标记。 

海湾扇贝抗热相关金属硫蛋白基因标记辅助育种方法，以在抗热群体中高频出现的金属硫蛋白基因型作为抗热相关金属硫蛋白基因标记，将携带这种抗热相关基因标记的海湾扇贝进行繁殖，培育后代，克隆得到后代中的金属硫蛋白基因启动子区序列，研究其多态性；同时进行热胁迫处理实验，研究抗热相关金属硫蛋白基因标记的遗传规律及其与海湾扇贝耐热能力的关系，从中筛选出既带有抗热相关金属硫蛋白基因标记，耐热能力又显著提高的贝苗进行多代繁殖和培育后即可建立抗热新品种。 

本发明与已有技术相比，本发明借助分子生物学技术，以海湾扇贝为材料首次发掘了我国养殖贝类抗热相关金属硫蛋白基因标记，初步建立了海湾扇贝抗热相关金属硫蛋白基因标记辅助育种技术，该技术具有操作简便快捷、选育效率高、周期短等特点，为贝类抗热品种的培育开辟了新的分子育种技术途径，对养殖贝类抗热品种的选育具有重要理论意义和应用价值。 

附图说明

图1为本发明实施例提供的海湾扇贝金属硫蛋白基因启动子区部分序列图。 

图2为本发明实施例提供的海湾扇贝金属硫蛋白基因启动子区多态性位点序列图。 

图3为本发明实施例提供的海湾扇贝金属硫蛋白基因启动子区不同基因型的分型图谱(其中(A)Mse I酶切图谱：M1为DL2000 Marker，1为-375T/T基因型酶切图谱，2为-375T/C基因型酶切图谱，3为-375C/C基因型酶切图谱，M2为20bp Marker。(B)Bi-PASA PCR图谱：M1为DL2000 Marker，1为-337A/C基因型PCR图谱，2为-337C/C基因型PCR图谱，3为-337A/A基因型PCR图谱。)。 

图4为本发明实施例提供的海湾扇贝抗热群体及敏感群体中金属硫蛋白不同基因型的分布频率以及相应的卡方检验图。 

具体实施方式

下面以海湾扇贝抗热相关海湾扇贝金属硫蛋白基因标记及其辅助育种技术的建立为例，对本发明的技术内容进行详细说明。 

海湾扇贝抗热相关金属硫蛋白基因标记，包括：1.海湾扇贝金属硫蛋白基因启动子区部分序列的克隆；2.抗热相关金属硫蛋白基因标记的筛选；3.携带抗热相关基因标记个体的快速筛查； 

1.海湾扇贝金属硫蛋白基因启动子区的克隆 

参照分子克隆所述方法从海湾扇贝闭壳肌中提取总DNA；根据已知的金属硫蛋白基因序列在其启动子区设计引物，克隆得到一段617个碱基的DNA序列，连入T载体后进行测序，获得其核苷酸序列。 

2.抗热相关金属硫蛋白基因标记的筛选 

对来自抗热群体和热敏感群体的各6个个体的12个克隆进行测序，发现了17处多态性位点；随机选取50个热敏感个体和50个抗热扇贝个体，提取基因组DNA，针对-375T/C位点多态，首先PCR扩增金属硫蛋白启动子区序列，然后选用Mse I对PCR产物进行酶切，聚丙烯酰胺凝胶电泳后，发现3种基因型，-375T/T，-375T/C和-375C/C。针对-337A/C位点多态，利用Bi-PASA PCR进行分析，琼脂糖凝胶电泳后，发现3种基因型，-337A/A，-337A/C和-337C/C。-375位点的3种基因型个体在抗热群体和热敏感群体中出现的频率无显著差别，而-337A/A个体在抗热群体中出现的频率显著高于热敏感群体，而-337C/C个体在热敏感群体中出现的频率显著高于抗热群体。因此，将-337C/C作为热敏感相关的金属硫蛋白基因标记，而将-337A/A作为抗热相关的金属硫蛋白基因标记。 

3.携带抗热相关基因标记个体的快速筛查 

取海湾扇贝个体全血1μl作为模版，利用用Bi-PASA PCR进行分析，琼脂糖凝胶电泳分型后，选择-337A/A个体作为抗热个体。 

实施例1 

海湾扇贝抗热相关金属硫蛋白基因标记的获得，按如下步骤获得： 

1.海湾扇贝金属硫蛋白基因启动子区的克隆 

参照分子克隆所述方法，从海湾扇贝闭壳肌中提取总DNA；根据已知的金属硫蛋白基因序列在启动子区设计引物AiMT1pF(5′-atgtaagggcacttatgcttgatctttagt-3′)和AiMT1pR(5′-agcagtcaggaccagcacagcca-3′)，按照以下程序进行PCR扩增：94℃变性5min；之后进行35个循环的恒定扩增(94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min)；最后在72℃保温10min。克隆得到一段617个碱 基的DNA序列，连入T载体后进行测序，获得其核苷酸序列(参见图1)。克隆的MT启动子序列全长有617bp，根据NNPP数据库预测，该片段具有四个可能的转录起始位点(TSS1-TSS4)，若干个核心启动子元件TATA box和CAAT box。Patch软件和TESS数据库分析预测，该序列含有不少潜在的转录因子结合位点，包括金属应答元件(MREs)，糖皮质激素应答元件(GREs)，抗氧化应答元件(AREs)，热激元件(HSE)和SP1。 

2.海湾扇贝抗热相关金属硫蛋白基因标记的筛选 

对来自抗热群体和热敏感群体的各6个个体的12个克隆进行测序，发现了17处多态性位点(-488C/T，-450A/C，-447G/C，-440A ins-del，-431T/C，-430G/A，-428A/T，-375T/C，-363T/G，-337A/C，-311T/A，-310A/T，-298G/T，-265A/G，-253A/G，-251T/C和-118C/T)(参见图2)。提取50个热敏感个体和50个抗热个体的基因组DNA后，针对-375T/C位点多态，首先PCR扩增金属硫蛋白启动子区序列，程序如下：94℃变性5min；接着35个循环的恒定扩增(94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min)；最后在72℃保温10min。然后选用Mse I对PCR产物进行酶切。对于-375T等位基因，Mse I酶切后会产生大小分别为30，54，55，61，65，118，122和407bp的8个片段，而对于-375C等位基因则会产生大小分别为30，54，55，65，118，122和468bp的7个片段。取酶切产物10μL，加溴酚蓝上样缓冲液2μL，以180V电压在12％聚丙烯酰胺凝胶中电泳120min。用0.5μg/mL溴化乙锭染色后在紫外灯下观察是否有468和407bp的两条带进行分型，共发现3种基因型，-375T/T，-375T/C和-375C/C。针对-337A/C位点多态，以AiMT1pP(5′-ttcaggttggaaagttcatgtaagggcact-3′)，AiMT1pQ(5′-caacacaccttcggaagacatcacagc-3′)，AiMT1pA(5′-ggggggggggcatattttgaacagttc-3′)和AiMT1pB(5′-ggggggggggctcagctagacatgat-3′)为引物，利用Bi-PASA PCR进行分析。PCR反应采用热启动及降落程序来增强扩增的特异性，反应条件如下：94℃变性5min；之后进行10个循环的降落程序(94℃变性30s，复性温度从63℃开始，每进行一个热循环温度降低0.8℃，直降至55℃，变性时间为30s，72℃延伸30s)；然后接25个循环的恒定扩增(94℃变性30s；55℃退火30s，72℃延伸30s)；最后72℃保温10min。对于-337A等位基因，Bi-PASA PCR会产生大小为226和559bp的2个片段，而对于-337C等位基因则会产生大小分别为384和559bp的2个片段。取PCR产物5μL，加溴酚蓝上样缓冲液1μL，以120V电压在2％琼脂糖凝胶中电泳30min。用0.5μg/mL溴化乙锭染色后在紫外灯下观察带型，发现3种基因型，-337A/A，-337A/C和-337C/C(参见图3)。 

统计抗热群体和感病群体中位点-375和-337的不同基因型个体出现的频率(参见表1和图4)，利用SPSS11.5软件进行Chi-square Test分析后 发现，-375不同基因型个体在抗热群体和热敏感群体中出现的频率无显著差异，而-337C/C个体在敏感群体中出现的频率显著高于抗热群体，-337A/A个体在抗热群体中出现的频率显著高于敏感群体(参见表1和图4)。因此，-337C/C为热敏感相关的金属硫蛋白基因标记，而-337A/A为是抗热相关的金属硫蛋白基因标记。 

表1：海湾扇贝金属硫蛋白不同基因型在抗热群体和热敏感群体中分布频率的卡方检验 

3.携带抗热相关基因标记个体的快速筛查 

取海湾扇贝全血1μl作为模版，以AiMT1pP(5′-ttcaggttggaaagttcatgtaagggcact-3′)，AiMT1pQ(5′-caacacaccttcggaagacatcacagc-3′)，AiMT1pA(5′-ggggggggggcatattttgaacagttc-3′)和AiMT1pB(5′-ggggggggggctcagctagacatgat-3′)为引物进行Bi-PASA PCR。PCR反应采用热启动及降落程序来增强扩增的特异性，反应条件如下：94℃变性5min；之后进行10个循环的降落程序(94℃变性30s，复性温度从63℃开始，每进行一个热循环温度降低0.8℃，直降至55℃，变性时间为30s，72℃延伸30s)；然后接25个循环的恒定扩增(94℃变性30s；55℃退火30s，72℃延伸30s)；最后72℃保温10min。将PCR产物琼脂糖凝胶电泳分型后选择-337A/A个体作为抗热个体。 

实施例2 

海湾扇贝抗热相关金属硫蛋白基因标记辅助育种方法： 

以在抗热群体中高频出现的金属硫蛋白基因型-337A/A作为抗热相关金属硫蛋白基因标记。将携带这种抗热相关基因标记的海湾扇贝进行繁殖，培育后代，克隆获得后代中的金属硫蛋白基因，研究其多态性；同时进行热胁迫处理实验，研究抗热相关金属硫蛋白基因标记的遗传规律及其与扇贝抗热力的关系，从中筛选出既含有抗热相关金属硫蛋白基因标记，抗热能力又提高的贝苗，进行多代繁殖和培育后即可建立抗热优良品种。