一种用于合成胞二磷胆碱的生物工程方法

摘要

本发明提供一种用于合成胞二磷胆碱的生物工程方法，该方法包括以下步骤：用基因工程方法重组构建含有磷酸胆碱胞苷转移酶的大肠杆菌工程菌株；利用该工程菌株进行大规模高密度培养并分离纯化，得到高纯度、高活性的磷酸胆碱胞苷转移酶；利用磷酸胆碱胞苷转移酶在合适的条件下进行酶法催化合成，得到胞二磷胆碱；在酶法催化合成胞二磷胆碱的体系中加入阳离子交换树脂，使得胞二磷胆碱在合成的过程中不断地被吸附在树脂上，实现胞二磷胆碱反应与分离的耦合。该方法具有底物利用率高、产物回收率高、反应条件温和、反应时间短、对环境污染小、成本低等优点，适合工业化大规模生产。

说明书

技术领域

本发明涉及一种磷酸胆碱胞苷转移酶的制备方法，并通过此酶在体外催化合成胞二磷胆碱，同时实现反应与分离耦合的生物工程方法。该方法可用于胞二磷胆碱的大规模生产制备。 

背景技术

胞二磷胆碱又称胞磷胆碱钠(cytidine diphosphate choline，简称CDP-Choline，CDP-C)，其分子式为C₁₄H₂₅N₄NaO₁₁P₂，分子量为510.31，呈白色晶体状，并极易溶于水。它是核苷衍生物，是磷脂类磷脂酰胆碱的前体物质，为卵磷脂合成的主要前体。胞二磷胆碱改善脑功能的作用可能与促进卵磷脂的生物合成有关。其药理作用主要有以下几个方面：①能增强脑干网状结构上行激活系统的功能，增强锥体系和抑制锥体外系的作用，促进催醒和抑制募集反应；②改善脑血管张力，降低脑血管阻力，增加脑血流量，改善脑血液循环；③增加脑细胞氧耗，改善脑组织代谢，脑能量代谢等。此外，胞二磷胆碱尚有降低高血脂和血小板粘滞度，促进糖代谢和预防黑质内多巴胺生成障碍的作用。 

目前制备胞二磷胆碱的方法有：①化学合成法，以CMP、磷酸胆碱(CP)为底物，用对甲苯磺酰氯为缩合剂，在N-二甲基甲酰胺(DMF)环境中，化学合成胞二磷胆碱；②酶促合成，提取细胞液中的磷酸胆碱胞苷转移酶，并利用三磷酸胞苷和磷酸胆碱合成胞二磷胆碱。但抽 提酶液收率低、成本高；③游离酵母合成胞二磷胆碱，此法需要大量游离酵母，且产物回收率较低，不适合工业化生产。 

发明内容

本发明的目的在于提供了一种用于合成胞二磷胆碱的生物工程方法，旨在解决化学合成和生物提取酶法合成胞二磷胆碱的种种缺陷，使得胞二磷胆碱的制备过程更易进行，产品的收率更高。 

为了解决上述问题，本发明通过以下步骤实现：用基因工程方法重组构建含有编码磷酸胆碱胞苷转移酶核苷酸序列的大肠杆菌工程菌株；利用该工程菌株进行大规模高密度培养，并分离纯化得到高活性的磷酸胆碱胞苷转移酶；利用磷酸胆碱胞苷转移酶在合适的条件下进行酶法催化合成，得到胞二磷胆碱；更近一步地在酶法催化合成胞二磷胆碱的体系中加入阳离子交换树脂，使得胞二磷胆碱在合成的过程中不断地被吸附在树脂上，实现胞二磷胆碱反应与分离的耦合。 

上述的基因工程菌株已于2010年12月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。建议的分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏号为CGMCC NO：4428。 

本发明采用胞二磷胆碱反应与分离耦合的方法，明显提高了反应和纯化过程的可控性，使得本发明适合工业化生产。 

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。 

附图说明

图1是生物催化合成反应前的图；图2是生物催化合成反应后的图。其中图1保留时间为17.952min的峰为CTP；图2所示，其中保留时间为7.150min的峰为胞二磷胆碱，保留时间为18.049min的峰为CTP，由此可推算出反应的CTP转化率为68％。 

具体实施方式

实施例1 

采用常规方法提取肺炎链球菌样品RNA，反转录获得肺炎链球菌cDNA。以权利说明6中所述引物为引物，采用PCR方法从肺炎链球菌cDNA中钓取CCT基因。具体PCR条件为： 

95℃，5min； 

72℃，10min 

产物经琼脂糖凝胶电泳检测，大小为690bp，与预计一致。用限制型内切酶NdeI和XhoI将上述CCT基因酶切，回收后与经NdeI及XhoI酶切过的载体pET28a连接，转化大肠杆菌，筛选具有卡那霉素抗性的转化子。经质粒提取，酶切鉴定后，证明重组蛋白CCT基因已克隆pET28a中。 

用CaCl₂法将pET28a-CCT转化BL21(DE3)，在含有卡那霉素的LB平板上筛选转化子，经质粒检测获得含有pET28a-CCT的重组转化子BL21(DE3)/pET28a-CCT。 

实施例2 

在实施例1中所得的重组工程菌按照2％接种量接入培养基(含有胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物10g/L，K₂HPO₄·3H₂O 15g/L，NaH₂PO₄·2H₂O 10g/L，1ml消泡剂。121℃灭菌20分钟，接种前加入卡那霉素至最终浓度50mg/L，无菌MgSO₄至终浓度0.8g/L，无菌葡萄糖至终浓度2g/L，无菌微量元素浓缩液10ml/L，pH值调节至6.55)在5L发酵罐中进行补料分批高密度发酵，pH值控制在6.55±0.05，37℃培养5小时后，IPTG诱导的工作浓度为0.1mM，诱导20小时后，离心收集菌体，放入-20℃冰箱保存，备用。 

实施例3 

称取实施例2中所得的菌体10g，使用磷酸盐缓冲液稀释至100g/L，置于冰水浴中，使用超声细胞破碎仪，设置超声波功率30％，工作4秒停6秒，循环1小时，得到100m l破菌液。将其于4℃、12000rpm离心1小时，收集离心上清液。上样至已用50mM磷酸缓冲液平衡好的镍亲和层析柱(2.6/10cm)，用同样的缓冲液将层析柱平衡后，用含有20mM咪唑的缓冲液洗脱柱上的杂蛋白，最后用含有300mM咪唑的缓冲液洗脱柱上的目的蛋白，收集洗脱液，并使用20mM的磷酸盐缓冲液将其透析，冻干，得到重组磷酸胆碱胞苷转移酶制剂。测定酶制剂的浓度和比活力，放入-20℃冰箱保存，备用。 

实施例4 

在1升反应体系中进行酶催化合成，反应液含有：20mM  CTP，40mM磷酸胆碱，20mM氯化镁，50mM Tris-HCl，pH值调节至7.5，加入实施例3中得到的磷酸胆碱胞苷转移酶50mg，30℃反应2小时，反应产率一般可达到65％-70％。 

实施例5 

在1L反应体系中进行酶催化合成，反应液含有：20mM  CTP，40mM磷酸胆碱，20mM氯化镁，50mM Tris-HCl，100ml经过预处理的离子交换树脂，pH值调节至7.5，加入实施例3中得到的磷酸胆碱胞苷转移酶50mg，30℃反应2小时。通过过滤的方法将离子交换树脂收集，使用200ml 50mM Tris-HCl缓冲液洗涤离子交换树脂两次，再使用含有500mM NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液将吸附在离子交换树脂的胞二磷胆碱洗涤下来，通过紫外检测其含量，并计算回收率。反应产率一般可达到80％以上，胞二磷胆碱在离子交换树脂的吸附率可达到80％以上。 

应理解，上述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件执行。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。