一株烟草普通花叶病毒生防粘质沙雷氏菌菌株

摘要

本发明公开了一株烟草普通花叶病毒生防粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)菌株，菌株代号为2A2，该菌株于2011年9月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.5230。菌株能够抑制烟草普通花叶病毒(Tobacco mosaic virus)的侵染，生防实验表明能够防治烟草普通花叶病毒。同时本发明还提供了一种从该菌株中得到拮抗多糖成分，在烟草普通花叶病毒防治方面，具有很高的应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一株烟草普通花叶病毒生防粘质沙雷氏菌菌株，该菌株 以及从该菌株中得到拮抗多糖成分在烟草普通花叶病毒防治方面的应用。

背景技术

烟草普通花叶病毒病由烟草普通花叶病毒(Tobacco mosaic virus，简称TMV)引起，最 显著的症状是形成黄绿相间的斑驳花叶，病叶边缘有时向背面卷曲。此病自苗床至大田整个 生育期均可连续发生，病叶经调制后颜色不均匀，吃味较差，品质下降。烟草普通花叶病毒 广泛分布于我国各烟区，以黑龙江、吉林、辽宁、山东、河南、安徽、广东等省受害较重。 尤其近年来由烟草普通花叶病毒与烟草黄瓜花叶病毒、烟草马铃薯Y病毒混合侵染的危害呈 上升趋势，症状加重，造成烟田严重减产。目前生产上尚没有特效抗病毒剂，而Mulvania于 1926年就发现被细菌污染的植物病毒汁液很快丧失侵染活力，因此利用拮抗细菌来抑制植物 病毒的侵染是植物病毒病防治的有效策略之一。

烟草是我国重要的经济作物，中国烤烟的主要产区分布在云南、贵州、四川、湖北、湖 南、陕西、河南、安徽、山东、辽宁、吉林、黑龙江等20多个省区的近900个县市。其中， 云南省是我国烟草种植面积最大的省。中国烟叶的质量在不断提高，全国良种化面积达到 90％以上，是世界上最大的烟草生产国。

烟草普通花叶病毒是烟草生产上的主要病毒病害，其寄主范围广，可侵染30个种199种 植物(Shew & Lucas，1991)，它的独立和抗逆性都很强，含病毒的新鲜汁液稀释到100万倍 仍有致病力，在汁液中病毒的钝化温度为93℃、10min或75℃、40d；干病叶120℃处理30 min仍有侵染活力。烟草普通花叶病毒在自然界存在很多株系，而不同株系在先后侵入烟株 时往往存在交叉保护作用。烟草花叶病毒主要通过汁液摩擦传播，侵入后引起花叶、坏死、 畸形、矮化、变色等组织病变，不仅造成烟草产量损失，而且使烟草品质下将，特别是上等 烟比例和内在质量下降，占所有烟草病害损失一半以上。2007年全国烟叶生产因病毒病产值 损失44795.08万元，2008年产值损失达到65174.94万元。

微生物之间的拮抗作用在自然界中普遍存在，是生物农药研制的依据。微生物源抗病毒 物质以细菌及其代谢产物、真菌及其代谢产物、放线菌及其代谢产物为主。微生物代谢产生 的有抗病毒作用的活性物质，具有活性强、安全高效的优点。从微生物资源中筛选，经分离 后获得多糖、蛋白类、核酸类、小分子等抗植物病毒物质，已经成为研究的热点，有的已经 形成产品，在农业生产中发挥重要作用，尤其是抗病毒型农用抗生素的研制已取得了突破性 进展，如宁南霉素是一种胞嘧啶核苷肽型抗生素，具有广谱和高效的抑制作用，并且低毒、 低残留等优点。1995年向固西等从诺尔斯链霉菌西昌变种(s.nourseivar.xiehangensis)的发酵 液中提取的胞嘧啶核苷肽型抗生素一宁南霉素(ningnanmyein)，对TMV的复制有抑制作用， 防效在65％以上，已形成2％宁南霉素水剂，1997年获得了临时登记图。2001年我国又新增 了嗜肤霉素，用于植物病毒病害防治的新型农用抗生素。

随着全球食品安全生产的日益重视，随着人们对吸烟健康的日益关注和重视，随着烟草可 持续发展以及化学农药抗性和污染问题的日益严重，生物农药越来越受到重视，并成为综合防 治的主要部分。生物农药选择性强，对人畜安全；无污染，对生态环境安全；效果好，防治 期更长；种类繁多，开发利用途径多。具有诱导烟草抗性的生物及化学激发子制剂农药是基 于诱导增强植物抗病性、抗逆性而研制的新型农药，产品安全无毒，不会引起植物的抗性，对植 物有显著抗病增产作用，同时能提高作物的品质，生产上可以减少或不使用化学农药，生产的 产品可以达到绿色产品和有机食品的要求，特别是在无公害烟叶生产中将发挥重要的作用，符 合当前我国对烟叶质量的要求，有利于提高烟叶质量，增加农民收入，具有非常广阔的市场前 景和良好的市场竞争能力，具有较好的综合效益。具有诱导抗性的生物及化学激发子生物农 药将成为21世纪农业可持续发展的重要内容，具有十分广阔的应用前景。

目前成功应用的植物病害生防细菌有Agrobacterium、Bacillus、Pseudomonas、Erwinia、 Xanthomonas等属的一些菌株。生防细菌防治植物病害发生发展的一个重要机制是产生拮抗 物质，大致包括以下几类：细菌素(bacteriocins)、荧光素(fluorescein)、土壤杆菌素(agrocin)、 酚类物质、多肽类抗生素(polypeptides)、蛋白质类等，在植物病害生物防治中起着关键的 作用。由生防细菌产生的拮抗物质种类多，作用范围广谱，同一种拮抗物质可以由多种细菌 菌株产生，而同一种细菌菌株也可以产生多种不同结构的拮抗物质。

目前生物农药的研发已经在原有微生物制剂开发的基础上，向新功能、分子设计或重组 生物农药方向发展。微生物源农药是利用微生物或其代谢物作为防治农业有害物质的生物制 剂，主要包括微生物杀菌剂、微生物杀虫剂和微生物除草剂。微生物杀虫剂包括昆虫病原细 菌、昆虫病毒、昆虫真菌、昆虫病原线虫和微孢子虫。微生物除草剂我国首次将真菌用于杂 草生物防治的研究是1963年利用炭疽病“鲁保一号”防治大豆菟丝子，1966年以后生物除 草剂“鲁保一号”推广到全国20多个省、市、自治区，防治效果稳定在80％以上。在活体 微生物除草剂中，以真菌所占比重最大，真菌除草剂的研究和开发最为活跃。美国成功开发 了用于防治水稻、麦类等作物菌期杂草的盘长孢状刺盘孢；日本烟草株式会社开发的黑腐病 菌，用于防治草坪内的杂草早熟禾及剪股颖，但目前尚无规模应用。农用抗生素主要指用于 防治病、虫、草等有害生物的微生物代谢产物，可分为抗菌素、杀虫素和杀草素。开发抗植 物病毒病的农用抗生素：农用抗生素因其具有内吸活性强、安全、低毒、高效、速效等诸多 优点，成为各国研究的热点，谁首先开发成功，谁就掌握了市场的主动权。因此，开发抗病 毒型农用抗生素已迫在眉睫。从植物中获取天然抗病毒物质：目前已从中草药中开发出若干 行之有效的抗病毒制剂，并且在筛选模式上也有所突破。进一步的研究和开发将会给病毒病 的防治带来新的生机。开发复配制剂：多种抗病毒型生物农药之间或生物农药与化学农药之 间进行复配，以期能达到好的防治效果。

研究已有的抗病毒型农用抗生素作用机理，明确其作用位点、作用时间，为进一步开发 更为高效的新型抗病毒型生物农药提供理论依据和研究手段。了解拮抗菌的抗病毒机理是增 强拮抗菌生防效力和确定拮抗菌筛选标准的重要前提，拮抗菌对植物病毒主要有3种作用机 制：即体外钝化作用、抑制作用(包括抑制侵染和抑制增殖)、诱导抗性，其中以体外钝化 作用最为显著。

因此本发明将从生物防治方面进行探索，筛选防效促生效果好的拮抗菌株，并对其抗病 毒机理进行研究，为将来通过常规和分子生物学途径，利用这些拮抗细菌及其拮抗物质防治 烟草普通花叶病毒病提供研究基础和实验材料。

在植物的根围、叶围及其它微生态区系中，拮抗细菌广泛存在，且由于培养方便、生长 周期短、作为新拮抗菌来源具有很大的开发潜力。

国内对烟草普通花叶病毒病生物防治已有报道，但多数仅限于对生防菌的筛选和盆栽试 验阶段，而对其产生抗菌物质的提取、生理生化特性和生防菌的防病机制等诸多方面国内尚 未深入研究。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术所存在的上述不足，而提供一株烟草普通花叶病毒生防粘 质沙雷氏菌菌株，用于烟草普通花叶病毒病的生物防治，为烟草普通花叶病毒病的防治提供 了新的微生物资源。

其技术方案为：

本发明所述菌株是从青岛即墨试验农场、烟田土样中分离获得的，鉴定2A2菌株为粘质 沙雷氏菌(Serratia marcescens)。该菌株的培养条件为28℃，LB培养基，pH7.0。该菌株为 肠杆菌科，沙雷氏菌属，菌株代号为2A2，该菌株于2011年9月7日保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.5230。

本发明所述方法，包括以下步骤：

1)将活化的2A2菌株接种于LB培养基中，28℃恒温，140rpm振荡培养48h，4℃，12000 rpm离心10min，去菌体，制成胞外代谢物的发酵上清液；

2)每1ml上清液加入1.5ml 95％乙醇、2.5mg CaCl₂，均匀搅拌后产生沉淀，3000rpm，5min 离心，取沉淀溶于适量水中；

3)重复步骤2)将所产生的沉淀无水乙醇产生沉淀，无菌水溶解，即为多糖粗品。

本发明的有益效果：

本发明获得的拮抗烟草普通花叶病毒病的生防粘质沙雷氏菌菌株2A2，可应用于对烟草 普通花叶病毒病的防治，采用接种枯斑寄主的生物学测定表明，其发酵液对TMV的抑制率 为98％，2A2菌株分泌的拮抗物质可用95％乙醇和CaCl₂提取，多糖稀释50倍对TMV的抑制率 为90.0％。粘质沙雷氏菌生产的粉剂稀释10倍对TMV的抑制作用可达到95％。2A2菌株分泌 的拮抗物质对TMV具有体外钝化、抑制侵染和增殖的作用。具有实际的应用价值。

附图说明

图1为2A2发酵液(1x10⁸cfu/ml)对TMV的枯斑抑制效果图；

图2为2A2多糖粗品对TMV枯斑抑制症状图；

图3为菌株2A2平板划线图；

图4为菌株2A2在透射电镜下的菌体形态图。

具体实施方式

下面结合具体和实施例对本发明的方法作进一步详细地说明。

实施例1、

1、1防治TMV拮抗细菌2A2菌株的筛选

挑取纯化菌株接种于LB液体培养基，28℃恒温，140rpm振荡培养48h，取20ml与等体 积40倍TMV汁液混合15min后，摩擦接种TMV的枯斑寄主三生-NN烟，每株接种上部2片叶， 以无菌水与TMV混合为对照，3～5d调查枯斑抑制率。经初步测试有拮抗活性的菌株采用 相同方法重复测试，每处理3株，三次重复。

枯斑抑制率调查显示菌株2A2对TMV的抑制效果最好，对TMV的枯斑抑制率达到98％， 生防细菌在生长代谢过程中产生了具有抑制病毒活性的抗生物质。(见表1)

枯斑抑制率计算公式：

表1菌株2A2对烟草普通花叶病毒的抑制作用

1、22A2菌株发酵上清及多糖对TMV的抑制作用

发酵上清液及胞外多糖的提取

将活化的2A2菌株接种于LB培养基中，28℃恒温，140rpm振荡培养48h，4℃，12000rpm 离心10min，去菌体，制成胞外代谢物的发酵上清液。

每1ml上清液加入1.5ml 95％乙醇、2.5mg CaCl₂，均匀搅拌后产生沉淀，3000rpm，5min 离心，取沉淀溶于适量无菌蒸馏水中。重复上述步骤，将所产生的沉淀用少量无菌蒸馏水溶 解，即为多糖粗品。

发酵上清液及胞外粗糖对TMV活性检测

取发酵上清液和多糖粗品液，分别稀释1x、10x、50x、100x分别与等体积40倍TMV 病毒汁液混合15min，接种三生NN烟，以无菌水与等体积TMV混合为对照，检测其枯斑抑 制率。

表22A2发酵上清液稀释后对TMV的抑制作用

2A2发酵上清液(1x)对TMV的枯斑抑制见图1。

从表2可知，2A2菌株发酵上清液稀释后对TMV的枯斑抑制率分别为96.8％、65.0％、 58.0％，而不接菌LB培养基对TMV几乎不存在抑制作用。

表32A2提取的多糖粗品对TMV的抑制作用

2A2多糖粗品对TMV枯斑抑制症状见图2。

实施例2

1.1拮抗细菌2A2在生产上的实际应用

(1)菌株2A2粉剂生产

将2A2发酵液(1x10⁸cfu/ml)以6ml∶1g的比例与白炭黑混合，搅拌均匀，在通风 光照处晾干，形成粉剂。将晾干的粉剂稀释10X、50X、100X，采用半叶法接种到三生-NN 烟上进行生物学实验，以稀释的粉剂与等量的病毒混合液为处理，以无菌水与等量的病毒汁 液混合为对照，检测抑制病毒效果。

表4稀释粉剂对病毒的抑制效果

粉剂稀释后，有很好的抑制病毒的效果。粉剂可克服运输的困难，易保存，便于生产上 的使用。

(2)菌株2A2与其他抗病毒药剂效果的对比

选取生产上经常使用的病毒抑制剂：宁南霉素(200x)、吗啉胍乙铜(400x)，与2A2 抗病毒效果的对比。每种病毒抑制剂与40倍病毒汁液均匀混合15min，以无菌水与TMV混合 为对照，半叶法接种到三生-NN烟上，每株接种上部2片叶，每处理3株，三次重复，3～5d 调查枯斑抑制。(表5)

表5多种病毒抑制剂的抗病效果

(3)对剪刀的消毒作用

灭菌剪刀在40倍TMV汁液中浸泡1min，取出后分别在下述①～④液体中浸泡30sec， 在5～6叶期普通烟NC89上，剪上部3片叶。每处理8株，3次重复。30d调查病情指数。 ①2A2发酵液，②LB培养基，③清水，④不浸泡，直接剪NC89叶片。

表62A2发酵液对剪叶剪的消毒作用

由表6看出，剪刀浸泡在TMV汁液中，沾取了病毒汁液，再在2A2发酵液中浸泡，能 杀死绝大部分病毒，发病率仅为0.46％，病情指数也远低于其他处理，因此，生产上可以用 2A2发酵液来消毒剪叶剪等操作器械。试验中还观察到浸泡在LB培养基和清水中的处理， 发病率也低于④不浸泡的处理，是因为稀释了沾取在剪刀上的病毒浓度，降低了侵染力。

1、22A2的分类地位分子鉴定

参照文献(林万明主编细菌分子遗传学分类鉴定方法[M].上海，上海科学技术出版社 1990)方法提取总体DNA，PCR扩增参照(C.W.迪芬巴赫，G.S.德维克斯勒著，黄培堂等译. PCR实验技术实验指南[M]，北京科学技术出版社，2000)方法进行。以2A2菌体基因组DNA 为模板，经PCR反应扩增，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条1.0kb以上的特异性片段， 测定该片段序列(PCR产物由北京华大中生生物科技有限公司测序)，结果表明，测得2A2 菌株为1026bp。将测得的16s rDNA全序列(见附录SEQ ID NO1)提交GenBank (www.ncbi.nlm.nlh.gov)，应用其中的BLAST软件和DNAMAN软件进行分析，发现，2A2 菌株测得的序列与粘质沙雷氏菌16s rDNA部分序列相同。因此鉴定2A2菌株为粘质沙雷氏菌 (Serratia marcescens)。同时将2A2登陆Genbank，登陆号为FN812753，系统发育树显示2A2 与粘质沙雷氏菌同源性98％。

2菌株2A2生理生化的研究

菌株2A2平板划线见图3。

菌株的菌落基本上是凸起，中心不透明，边缘不规则，大小为1～2.5mm，均产生 红色色素。

菌株2A2在透射电镜下的菌体形态见图4。

负染标本制作，取粘质沙雷氏菌的新鲜培养物，用生理盐水作成，均匀悬液，加一滴到 铜网载膜上，1％磷钨酸负染。

负染标本用H-600透射电镜，在加速电压75KV下观察。临界点观察。

粘质沙雷氏菌的细胞多分散存在，无成双或成链的规则排列，呈直杆状，，两端钝圆。 大小为0.62～0.87x0.87x1.1～2.3um。偶然可见丝状体。细胞具有明显的周鞭毛和茂密的 菌毛，图未见到显著的荚膜。

附：本发明所涉及的核苷酸序列

SEQ ID NO1(2A2菌株16S rDNA全序列)：

TTACaCATGCAAGTCGAGCGGTAGCACAGGGGAGCTTGCTCCCTGGGTGACGAGCGGCGGACGGGT GAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCA TAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATT AGCTAGTAGGTGGGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAG CCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAAT GGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCA GCGAGGAGGAAGGTGGTGAACTTAATACGCTCATCAATTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGG CTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTA AAGCGCACGCAGGCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTT GAAACTGGCAAGCTAGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAG AGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAA GCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGATTTGGAGGT TGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCA AGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAT GCAACGCGAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCG GGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGTCTGTGCACCAATCCATCTCTGCTAAGTTCTCTGGATGTCA AGAGTAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCC CGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGATTTAACGCGTTAGCTC CGGAAGCCACGCCTCAAGGGCACAACCTCCAAATCGACATCGTTTACAGCGTGGACTACCAGGGT ATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTGAGCGTCAGTCTTCGTCCAGGGGGCCGCCTTC GCCACCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCCCCCTCTACG AGACTCTAGCTTGCCAGTTTCAAATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGATTTCACATCTGACTTAA CAAACCGCCTGCGTGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTACCGCG GCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTGCGAGTAACGTCAATTGATGAACGTATTAAGCT CACCACCTTCCTCCTCGCTGAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATGGCT GCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTC TCAGTTCCAGTGTGGCTGGTCATCCTCTCAGACCAGCTAGGGATCGTCGCCTAGGTGAGCCATTAC CCCACCTACTAGCTAATCCCATCTGGGCACATCTGATGGCAAGAGGCCCGAAGGTCCCCCTCTTTG GTCTTGCGACGTTATGCGGTATTAGCTACCGTTTCCAGTAGTTATCCCCCTCCATCAGGCAGTTTCC CAGACATTACTCACCCGTCCGCCGCTCGTCACCCAGGGAGCAAGCTCCCCTGTGCTACCGCTCGAC TTGCATGTGTTAAGCCTGCCGCCAGCGTTCAATCTGAGCAGAGAACAAACACTTCCCAA