一种弗吉尼亚栎组织培养方法

摘要

一种弗吉尼亚栎组织培养方法，属于植物组织培养方法。其特征在于包括以下步骤：1）外植体的选取；2）外植体消毒；3）初代培养；4）不定芽增殖培养；5）壮苗培养；6）生根培养；7）炼苗和移栽。上述一种弗吉尼亚栎组织培养方法，能较好的保持母本的抗逆性和观赏性，有效提高弗吉尼亚栎繁殖系数。与种子繁殖相比，组织培养降低对进口种子的依赖性，能有效降低苗木成本，节省开支；与扦插繁殖相比，组织培养育苗周期短，4个月即可获得生根苗木，节约了成本。

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养方法，具体为一种弗吉尼亚栎组织培养方法。

背景技术

弗吉尼亚栎（Quercus virginiana）属壳斗科(Fagaceae)栎属（Quercus）树种，原产美国，为常绿阔叶高大乔木。单叶，互生，老叶革质，叶表面深绿色具光泽，背面绿色泛白，叶片颜色、形状、大小、质地等性状随发育阶段、环境等影响具有很强的可塑性，新叶大而肉质，颜色淡绿，叶缘齿大而少；老叶小而革质，叶缘齿小而多。早春开花，花黄色，成熟果实呈褐色，俗称橡树果，为鸟类和动物提供丰富的食物来源，成熟以后即落下,种子活力较低。弗吉尼亚栎喜排水良好的砂质土壤，能够耐盐雾和较高的土壤盐分，对土壤水分敏感，可以忍受中等程度的干旱，粘土也可以生长，可以耐受最低-13℃的低温。弗吉尼亚栎幼年生长速度较快，幼苗在第一年可以生长至4英尺（1.2m）,随着苗木的长大，生长速度会减少。在没有限制的空间生长的成年弗栎平均可达15m高，胸径可达91-122cm，树冠范围可达46m以上，寿命长达数百年。弗吉尼亚栎主要分布于美国东南沿海和墨西哥湾海岸，即从弗吉尼亚州南部、佐治亚州、佛罗里达州、路易斯安娜州，直至德克萨斯州中南部一线；在俄克拉哈马州西南部和墨西哥东北山区也有零星分布，是美国沿海硬阔林和灌丛林地的重要组成树种，在美国东南沿海被广泛用作城市遮荫树和观赏树木。

中国林业科学研究院亚热带林业研究所从美国密苏里州引进的弗吉尼亚栎种子，成苗后大约5％的植株主干明显，高生长突出，分枝稀疏，冠形狭小；而多数苗木则没有明显主干，枝叶密集，冠形开张，或呈多干丛生状态。弗吉尼亚栎引种后，在我国浙江、上海、江苏、福建等亚热带、热带地区均可生长，同时由于弗吉尼亚栎具有很强的耐盐碱能力，加之根系发达，萌生性强，枝条具韧性，具有抗击飓风的能力，因此被广泛用于我国长三角地带的沿海防护林建设，弥补了目前我国沿海防护林体系中缺乏常绿阔叶抗风耐盐树种的缺陷，是目前东南沿海防护林体系中唯一一种耐盐常绿高大乔木树种。同时，橡树果吸引了大批的鸟类和动物汇集，丰富了沿海防护林体系的生物多样性。弗吉尼亚栎还可用于庭院、公园、农庄等公共休闲场所绿化，其树冠广阔，叶色鲜亮，为人们良好的遮荫、休闲场所和动物的栖息地。

弗吉尼亚栎在原产地每年会产生大量橡果，因此大多采用种子繁殖，只有少数苗木公司依靠无性繁殖获得不同性状的无性系用于不同的育种目的。目前国内弗吉尼亚栎苗木大多依赖进口种子繁殖，但由于弗吉尼亚栎种子没有休眠期，只要温度合适即可萌发，因此在进口种子过程中，由于机械损伤等原因，使得很大一部分种子在萌发后得不到及时播种而丧失活力，导致出苗率低，苗木成本较高。中国林业科学研究院亚热带林业研究所在国内首次引进弗吉尼亚栎并开展相关的研究，并开展了弗吉尼亚栎无性繁殖技术研究，在弗吉尼亚栎扦插繁殖方法方面取得了很大突破（ZL200910097684.0），成活率可高达80-85%。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种可显著提高其繁殖系数的弗吉尼亚栎组织培养方法的技术方案，且大大缩短了弗吉尼亚栎育苗周期，解决了依赖进口种子进行育苗的方式，节约了成本。

所述的一种弗吉尼亚栎组织培养方法，其特征在于包括以下步骤：

1）外植体的选取：外植体取自大田植株或室内培养的幼苗；

2）外植体消毒：取带芽茎段作为外植体，外植体经自来水冲洗10-14小时后，再以70-75%的酒精消毒25-35秒，然后升汞浸泡3-5分钟，然后以无菌水冲洗2-3次，置于无菌玻璃瓶备用；

3）初代培养：将消毒外植体剪成0.8-1.2cm的带芽茎段接入培养基中培养25-35天，给予光照约2500-3500 Lx，光周期14-18hr/6-10hr，温度25℃±2℃；所述的初代培养基由WPM培养基或1/4MS培养基+6-苄基腺嘌呤0.8-1.2mg/L组成；

4）不定芽增殖培养：将初代培养基中有生长迹象的带芽茎段接入增殖培养基中进行增殖培养，培养条件同步骤3），培养周期为40-50天；所述的增殖培养基由WPM或1/4MS+6-苄基腺嘌呤0.1-0.3mg/L+生长调节物质萘乙酸0.4-0.6 mg/L组成；

5）壮苗培养：将增殖培养基中叶色浓绿，长度1-2cm的不定芽逐个切下，接入WPM或1/4MS培养基中培养25-35天，培养条件同步骤3）； 

 6）生根培养：将壮苗培养后健壮的芽切去基部褐色物质和愈伤组织接入生根培养基中进行生根培养，先暗培养1.5-2.5周，再光照培养3.5-4.5周后生根，培养条件同步骤3）；所述的生根培养基由WPM或1/4MS+生长调节物质6-苄基腺嘌呤0.8-1.2 mg/L +生长调节物质萘乙酸0.4-0.6 mg/L组成； 

7）炼苗和移栽：将有生根的弗吉尼亚栎幼苗的培养基瓶盖打开，室温下室温下炼苗2-4天后，取出幼苗，洗去根部培养基，移栽装有河沙基质的苗床上，保持温度20-25℃，湿度85%-95%，适当遮荫即可。

所述的一种弗吉尼亚栎组织培养方法，其特征在于步骤1）中：

大田植株：一般应在上半年取材，选取当年萌发的带芽茎段为外植体，大田采集的外植体，另加入1-2滴吐温80消毒；

室内培养：选取无虫眼、颗粒饱满的弗吉尼亚栎种子，在自来水中浸泡22-26小时，弃去漂浮的种子，然后以饱和漂白粉上清液浸泡25-35分钟进行表面消毒，消毒后的种子播种于30cm×20cm×8cm的塑料容器中，容器中覆盖河沙，河沙厚度为4-6cm，将塑料容器置于光照培养箱中培养，温度25±1℃，光照强度11000- 13000Lx，光/暗周期为14-18h/6-10h。

所述的一种弗吉尼亚栎组织培养方法，其特征在于所述的初代培养基、不定芽增殖培养基、壮苗培养基、生根培养基中分别添加蔗糖15-25g.L-1，琼脂0.5-1.0%，调节PH至5.5-5.9。

所述的一种弗吉尼亚栎组织培养方法，其特征在于步骤3）所述的初代培养过程中需采取外植体防褐化措施，具体为：在初代培养基中加添加0.2-0.4%或0.4-0.6%的活性炭，或多次反复转接，即外植体第一次接种后，培养2-3天，转接到相同培养基，这样转2-3次。

所述的一种弗吉尼亚栎组织培养方法，其特征在于所述的WPM培养基由由大量元素、微量元素、铁盐、有机成分组成；

所述的大量元素为：（1）硝酸铵NH₄NO₃，400 mg·L^-1，（2）硝酸钙Ca(NO₃)₂，556 mg·L^-1, （3）氯化钙CaCl₂·H₂O，96mg·L^-1, （4）硫酸镁MgSO₄·7H₂O，370 mg·L^-1，（5）硫酸钾K₂SO₄，990 mg·L^-1，（6）磷酸二氢钾KH₂PO₄，170 mg· L^-1；

所述的微量元素为：（1）硼酸H₃BO₃，6.2 mg·L^-1，（2）钼酸钠Na₂MoO₄·2H₂O，0.25 mg·L^-1，（3）硫酸锰MnSO₄·4H₂O，22.3 mg·L^-1，（4）硫酸铜CuSO₄·5H₂O，0.25 mg·L^-1, （5）硫酸锌ZnSO₄·7H₂O，8.6 mg·L^-1；

所述的铁盐为：(1)乙二胺四乙酸二钠Na₂·EDTA，37.3 mg·L^-1，(2)硫酸亚铁FeSO₄·7H2O，27.8 mg·L^-1；

所述的有机成分为：（1）肌醇C₆H₁₂O₆2H₂O，100 mg·L^-1，（2）烟酸NC₅H₄·COOH，0.5 mg·L^-1，（3）盐酸硫胺素C₁₂H₁₇ClOS·2HCl，1.6 mg·L^-1。

所述的一种弗吉尼亚栎组织培养方法，其特征在于所述的MS培养基是由大量元素、微量元素、铁盐、有机成分组成；

所述的大量元素为：（1）硝酸钾KNO₃,1900 mg·L^-1,(2)硝酸铵NH₄NO₃,1650 mg·L^-1，(3)磷酸二氢钾KH₂PO₄,170 mg· L^-1，(4)硫酸镁MgSO₄·7H₂O,370 mg·L^-1，(5)氯化钙CaCl₂·H₂O,440 mg·L^-1；

所述的微量元素为：（1）碘化钾KI,0.83 mg·L^-1,(2)硼酸H₃BO₃,6.2 mg·L^-1,(3)硫酸锰MnSO₄·4H₂O,22.3 mg·L^-1,(4)硫酸锌ZnSO₄·7H₂O,8.6 mg·L^-1 (5)钼酸钠Na₂MoO₄·2H₂O,0.25 mg·L^-1 (6)硫酸铜CuSO₄·5H₂O,0.025 mg·L^-1,(7)氯化钴CoCl₂·6H₂O,0.025 mg·L^-1；

所述的铁盐为：(1)乙二胺四乙酸二钠Na₂·EDTA,37.3 mg·L^-1,(2)硫酸亚铁FeSO₄·7H2O,27.8 mg·L^-1；

所述的有机成分为：(1)肌醇C₆H₁₂O₆2H₂O,100 mg·L^-1 (2)甘氨酸NH₂CH₂·COOH,2 mg·L^-1,(3)盐酸硫胺素C₁₂H₁₇ClOS·2HCl,0.1 mg·L^-1 (4)盐酸吡哆醇C₈H₁₁O₃N·HCl,0.5 mg·L^-1 (5)烟酸NC₅H₄·COOH,0.5 mg·L^-1。

所述的一种弗吉尼亚栎组织培养方法，其特征在于所用1/4MS培养基为大量元素是MS基本培养基的1/4，其余成分微量元素、铁盐、有机成分同MS基本培养基。

上述一种弗吉尼亚栎组织培养方法，能较好的保持母本的抗逆性和观赏性，有效提高弗吉尼亚栎繁殖系数。与种子繁殖相比，组织培养降低对进口种子的依赖性，能有效降低苗木成本，节省开支；与扦插繁殖相比，组织培养育苗周期短，4个月即可获得生根苗木，节约了成本。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：一种弗吉尼亚栎组织培养方法，其培养步骤如下:

（1）外植体的选取：外植体采自中国林科院亚林所抗逆生理生态实验室内培养的植株。

（2）外植体消毒：取带芽茎段作为外植体，外植体经自来水冲洗12小时后，再以70-75%的酒精消毒30秒（若是大田采集的外植体，则加入1-2滴吐温80，以加强消毒剂的渗透），然后升汞浸泡3-5分钟，然后以无菌水冲洗数次，置于无菌玻璃瓶备用。

（3）初代培养：将消毒外植体剪成1cm左右的带芽茎段接入WPM或1/4MS+生长调节物质6-苄基腺嘌呤1.0mg/L培养基中培养30天，给予光照约3000lx，光周期16hr/8hr，温度25℃±2℃。由于弗吉尼亚栎外植体含较多酚类物质，因此在初代培养过程中需采取防褐化措施，具体措施包括：向培养基中添加0.2-0.4%或0.4-0.6%的活性炭，或多次反复转接，即外植体第一次接种后，培养3天，转接到相同培养基，这样转3次，可以有效防止褐化发生。

（4）不定芽增殖培养：将初代培养基中有生长迹象的带芽茎段接入WPM或1/4MS+生长调节物质6-苄基腺嘌呤0.2mg/L+生长调节物质萘乙酸0.5 mg/L培养基中进行增殖培养，培养条件同步骤3）初代培养，培养周期为45天。

（5）壮苗培养：将增殖培养基中叶色浓绿，长度1-2cm的不定芽逐个切下，接入WPM或1/4MS培养基中培养30天，培养条件同步骤3）初代培养。

（6）生根培养：将壮苗培养后健壮的芽切去基部褐色物质和愈伤组织接入WPM或1/4MS+生长调节物质6-苄基腺嘌呤1.0 mg/L+生长调节物质萘乙酸0.5 mg/L培养基中进行生根培养，先暗培养2周，再光照培养4周后生根，培养条件同步骤3）初代培养。

（7）炼苗和移栽：将有生根的弗吉尼亚栎幼苗的培养基瓶盖打开，室温下室温下炼苗3天后，取出幼苗，洗去根部培养基，移栽装有河沙基质的苗床上，保持温度20-25℃，湿度85%-95%，适当遮荫，成活率可达90%以上。

所述的WPM培养基由以下物质组成：

所述的大量元素为：（1）硝酸铵NH₄NO₃，400 mg·L^-1，（2）硝酸钙Ca(NO₃)₂，556 mg·L^-1, （3）氯化钙CaCl₂·H₂O，96mg·L^-1, （4）硫酸镁MgSO₄·7H₂O，370 mg·L^-1，（5）硫酸钾K₂SO₄，990 mg·L^-1，（6）磷酸二氢钾KH₂PO₄，170 mg· L^-1；

所述的微量元素为：（1）硼酸H₃BO₃，6.2 mg·L^-1，（2）钼酸钠Na₂MoO₄·2H₂O，0.25 mg·L^-1，（3）硫酸锰MnSO₄·4H₂O，22.3 mg·L^-1，（4）硫酸铜CuSO₄·5H₂O，0.25 mg·L^-1, （5）硫酸锌ZnSO₄·7H₂O，8.6 mg·L^-1；

所述的铁盐为：(1)乙二胺四乙酸二钠Na₂·EDTA，37.3 mg·L^-1，(2)硫酸亚铁FeSO₄·7H2O，27.8 mg·L^-1；

所述的有机成分为：（1）肌醇C₆H₁₂O₆2H₂O，100 mg·L^-1，（2）烟酸NC₅H₄·COOH，0.5 mg·L^-1，（3）盐酸硫胺素C₁₂H₁₇ClOS·2HCl，1.6 mg·L^-1。

所述的MS培养基由以下物质组成：

所述的大量元素为：（1）硝酸钾KNO₃,1900 mg·L^-1,(2)硝酸铵NH₄NO₃,1650 mg·L^-1，(3)磷酸二氢钾KH₂PO₄,170 mg· L^-1，(4)硫酸镁MgSO₄·7H₂O,370 mg·L^-1，(5)氯化钙CaCl₂·H₂O,440 mg·L^-1；

所述的微量元素为：（1）碘化钾KI,0.83 mg·L^-1,(2)硼酸H₃BO₃,6.2 mg·L^-1,(3)硫酸锰MnSO₄·4H₂O,22.3 mg·L^-1,(4)硫酸锌ZnSO₄·7H₂O,8.6 mg·L^-1 (5)钼酸钠Na₂MoO₄·2H₂O,0.25 mg·L^-1 (6)硫酸铜CuSO₄·5H₂O,0.025 mg·L^-1,(7)氯化钴CoCl₂·6H₂O,0.025 mg·L^-1；

所述的铁盐为：(1)乙二胺四乙酸二钠Na₂·EDTA,37.3 mg·L^-1,(2)硫酸亚铁FeSO₄·7H2O,27.8 mg·L^-1；

所述的有机成分为：(1)肌醇C₆H₁₂O₆2H₂O,100 mg·L^-1 (2)甘氨酸NH₂CH₂·COOH,2 mg·L^-1,(3)盐酸硫胺素C₁₂H₁₇ClOS·2HCl,0.1 mg·L^-1 (4)盐酸吡哆醇C₈H₁₁O₃N·HCl,0.5 mg·L^-1 (5)烟酸NC₅H₄·COOH,0.5 mg·L^-1。

上述步骤3）中外植体剪成0.8cm或1.2cm的带芽茎段，培养25天或35天，给予光照约2500 Lx、2600 Lx或3500 Lx，光周期14hr/6hr或18hr/10hr，所述的初代培养基中6-苄基腺嘌呤0.8mg/L或1.2mg/L；步骤4）中培养周期为40天或50天；所述的增殖培养基中6-苄基腺嘌呤0.1或0.3mg/L，生长调节物质萘乙酸0.4或0.6 mg/L。步骤5）中培养周期为25或35天；步骤6）中先暗培养1.5周或2.5周，再光照培养3.5周或4.5周，所述的生根培养基中生长调节物质6-苄基腺嘌呤为0.8或1.2 mg/L，生长调节物质萘乙酸为0.4或0.6 mg/L。其它步骤同实施例1，也能达到本发明所述的有益效果。