巫山淫羊藿的组培快繁方法和繁育的巫山淫羊藿

摘要

本发明涉及巫山淫羊藿的组培快繁方法和繁育的巫山淫羊藿。该方法包括以下步骤：A.将巫山淫羊藿种子消毒后于0～10℃低温沙藏层积处理；B.将层积处理后的种子进行消毒处理，再用无菌镊子将种胚剥出，备用；C.将消毒后的种胚接种于诱导培养基中培养，使种胚诱导愈伤组织而分化出不定芽，或者使种胚直接诱导出芽；D.将步骤C中所得芽转入增殖培养基中，生成组培丛芽；E.将步骤D诱导分化的芽丛长成的小植株转入生根培养基中，培养以形成白色须根，进而形成完整植株。该方法可以提高巫山淫羊藿的繁殖系数，缩短繁殖周期，对于保护野生巫山淫羊藿资源，促进其可持续利用及产业化具有重要价值。

说明书

技术领域

本发明属中药材栽培技术领域，涉及巫山淫羊藿繁育方法，特别涉及巫山淫羊藿的 组培快繁方法。

背景技术

巫山淫羊藿Epimedium wushanense T.S.Ying为小檗科淫羊藿属多年生宿根性草本 药用植物，为《中华人民共和国药典》2010年版一部所载品种。以其干燥的叶入药，有 补肾阳，强筋骨，祛风湿的功效，且具有改善心血管系统，调节内分泌和抗骨质疏松等 生理活性。巫山淫羊藿药材原料主要依靠野生资源，随着国内外对其需求量的不断增大， 巫山淫羊藿野生资源遭到严重破坏，不能满足国内外市场的需求。目前淫羊藿的繁殖方 式主要有：通过地下根茎的无性繁殖及种子繁殖(有性繁殖)，淫羊藿种子存在明显的休 眠现象，繁殖发芽率低，且生长缓慢，生产上大多采用分株繁殖。

人们期待有一种能够以低成本、高繁殖率、和/或繁殖周期短的方法来繁育和栽培巫 山淫羊藿，以满足越来越大的巫山淫羊藿药用需求，并保护野生药用资源。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够以低成本、高繁殖率、和/或繁殖周期短的方法来繁育 和栽培巫山淫羊藿。本发明人发现以巫山淫羊藿种子为繁育材料，使用特定的培养条件， 可以有利地实现上述有关巫山淫羊藿繁育中的一个或多个方面的要求。本发明基于此发 现而得以完成。

为此，本发明第一方面涉及一种巫山淫羊藿的组培快繁方法，包括以下步骤：

A.外植体层积处理：将巫山淫羊藿种子消毒后于0～10℃低温沙藏层积处理；

B.外植体消毒：将层积处理后的种子进行消毒处理，再用无菌镊子将种胚剥出， 备用；

C.初代诱导：将消毒后的种胚接种于诱导培养基中培养，使种胚诱导愈伤组织而 分化出不定芽，或者使种胚直接诱导出芽；

D.继代增殖：将步骤C中所得芽转入增殖培养基中，生成组培丛芽；

E.再生植株诱导生根：将步骤D诱导分化的1～4cm长的健康的芽丛长成的小植株 转入生根培养基中，培养以形成白色须根，进而形成完整植株。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤A中，所述消毒是如下方式处理：将种子用 流水冲洗，于酒精中浸泡，再在HgCl₂中浸泡，再用无菌水冲洗。在一个实施方案中， 步骤A中，所述消毒是如下方式处理：流水冲洗15-30min(例如约30min)，于45-75％(例 如约75％)酒精中浸泡10-60s(例如约30s)，再在0.1-0.5％(例如约0.5％)的HgCl₂中浸泡 2-8min(例如约6min)，无菌水冲洗2-6次(例如约5次)。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤A中，所述低温沙藏层积处理是如下方式处 理：使种子与河沙按1∶2～5的比例混合，保持含水量50～70％，经3～8℃低温沙藏层积 处理75～120天。由此处理的种子可以打破种子的休眠。在一个实施方案中，所述河沙是 经高温灭菌1-5h(例如约2h)后再冷却至室温的河沙。在一个实施方案中，所述种子与河 沙按1∶(1-5)，例如约1∶3的比例混合。在一个实施方案中，所述种子与河沙按1∶3的比 例混合，保持含水量40-70％(例如约60％)。在一个实施方案中，所述种子与河沙按1∶3 的比例混合，保持含水量60％，经2-5℃低温沙藏层积处理60-100天(例如约90天)。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤B中，所述消毒是先用酒精消毒，接着用 HgCl₂消毒。在一个实施方案中，步骤B中，将层积处理结束后的种子洗去河沙，于 45-75％(例如约75％)酒精中浸泡10-60s(例如约30s)，无菌水冲洗2-6次(例如约5次)， 再用0.1-0.5％(例如约0.5％)的HgCl₂消毒2-8min(例如约6min)，无菌水冲洗2-6次(例 如约5次)。在一个实施方案中，步骤B中，用灼烧冷却后的镊子和解剖刀将种胚轻轻剥 出，无菌滤纸吸干水分后，备用于下一处理步骤。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤C中，所述诱导培养基是包含MS+2，4-D 2mg/L+IBA 2mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+0.6％琼脂的培养基，或者是包含 MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L+IBA 1mg/L+蔗糖30g/L+0.6％琼脂的培养基，或者是包 含MS+IBA 2mg/L+6-BA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+0.6％琼脂的培养基。在一个实施方案中， 步骤C中，所述诱导培养基是包含MS+2，4-D 2mg/L+IBA 2mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖 30g/L+0.6％琼脂的培养基，以及包含MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L+IBA 1mg/L+蔗糖 30g/L+0.6％琼脂的培养基；或者是包含MS+IBA 2mg/L+6-BA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+0.6％ 琼脂的培养基。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤C的初代诱导是如下处理的：将消毒后的种 胚接种于包含MS+2，4-D 2mg/L+IBA 2mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+0.6％琼脂的诱 导培养基中培养，产生愈伤组织，接着在包含MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L+IBA 1mg/L+蔗糖30g/L+0.6％琼脂的诱导培养基中培养，分化出不定芽；或者，将消毒后的 种胚接种于包含MS+IBA 2mg/L+6-BA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+0.6％琼脂的诱导培养基中 培养，直接诱导出芽。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤D中，所述增殖培养基是包含MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+0.6％琼脂的培养基。在一个实施方案中，在增殖 培养基中培养的时间为20～60天，优选25～45天，例如约30天。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤E中，所述生根培养基是包含1/2MS+0.1 NAAmg/L的培养基。

根据本发明第一方面的方法，其中各步骤中使用的培养基的pH值为pH5.0～7.0， 优选pH5.5～6.5，更优选pH5.8。

根据本发明第一方面的方法，其中各步骤中使用的MS培养基中各自独立地添加 30g/L蔗糖和0.6％琼脂。

根据本发明第一方面的方法，其中各步骤中使用的培养基经100-130℃(例如约 121℃)，0.1-0.5Mpa(例如约0.1Mpa)高温灭菌15-25min(例如约25min)处理。

根据本发明第一方面的方法，其中各步骤中使用培养基培养的条件是温度20～30℃， 光照强度1500～3000lx，光照8～15h/d。根据本发明第一方面的方法，其中各步骤中使用 培养基培养的条件是温度25±2℃，光照强度2000lx，光照12h/d。

根据本发明第一方面的方法，其包括以下步骤：

A.外植体层积处理：将巫山淫羊藿种子，流水冲洗，消毒后于0～10℃低温沙藏层 积处理；

B.外植体消毒：将层积处理后的种子，先用酒精浸泡，再用升汞浸泡，无菌水冲 洗干净，用无菌镊子将种胚剥出，备用；

C.初代诱导：将消毒后的种胚接种于包含MS+2，4-D 2mg/L+IBA 2mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+0.6％琼脂的诱导培养基中培养，产生愈伤组织，接着在包含 MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L+IBA 1mg/L+蔗糖30g/L+0.6％琼脂的诱导培养基中培 养，分化出不定芽；或者，将消毒后的种胚接种于包含MS+IBA 2mg/L+6-BA 0.5mg/L+ 蔗糖30g/L+0.6％琼脂的诱导培养基中培养，直接诱导出芽；

D.继代增殖：将步骤C中所得芽转入包含MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗 糖30g/L+0.6％琼脂的增殖培养基中，生成组培丛芽；

E.再生植株诱导生根：将诱导分化的1～4cm长的健康的芽丛长成的小植株转入生 根培养基中，1个月后形成白色须根，进而形成完整植株。

根据本发明第一方面的方法，其中各步骤中，在进行培养时，其培养的时间以及培 养的程度可以根据本领域技术人员的技术经验以及操作的具体条件来确定，而不作特别 的限定。例如，在本发明步骤C中，种胚接种于包含MS+2，4-D 2mg/L+IBA 2mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+0.6％琼脂的诱导培养基中培养1个月左右，将会产生愈伤组织；接 着在包含MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L+IBA 1mg/L+蔗糖30g/L+0.6％琼脂的培养基中 培养1个月左右会分化出不定芽。

本发明第二方面涉及一种巫山淫羊藿株植，其是由组培快繁方法繁殖得到的。

根据本发明第二方面的巫山淫羊藿的株植，其是由本发明第一方面任一实施方案所 述组培快繁方法繁殖得到的。在一个实施方案中，所述巫山淫羊藿的株植是由本发明第 一方面任一实施方案所述步骤A、B、C、D和E的处理过程经组培快繁方法繁殖得到的。

本发明第三方面涉及一种巫山淫羊藿的芽，其是由组培快繁方法繁殖得到的。

根据本发明第三方面的巫山淫羊藿的芽，其是由本发明第一方面任一实施方案所述 组培快繁方法繁殖得到的。在一个实施方案中，所述巫山淫羊藿的株植是由本发明第一 方面任一实施方案所述步骤A、B、C和D的处理过程经组培快繁方法繁殖得到的。

本发明第四方面涉及一种巫山淫羊藿的愈伤组织，其是由组培快繁方法繁殖得到 的。

根据本发明第四方面的巫山淫羊藿的愈伤组织，其是由本发明第一方面任一实施方 案所述组培快繁方法繁殖得到的。在一个实施方案中，所述巫山淫羊藿的株植是由本发 明第一方面任一实施方案所述步骤A、B和C的处理过程经组培快繁方法繁殖得到的。

本发明第一方面任一实施方案中的任一技术特征同样适用于任一其它实施方案，只 要这种适用不会出现矛盾。下面对本发明方法进一步详细描述将有助于对本发明的了解。

在本发明中，MS或者MS培养基，是Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞 培养设计的(并因此简称为MS培养基)，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的 离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养 和生理需要，因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本 培养基。本发明使用的培养基或其中加入的添加剂是本领域技术人员根据已有知识可以 获得的，或者可以直接从市场上购得。例如MS培养基可以直接以商品方式购得。在本 发明中，如未另外说明，提及MS培养基是添加了6g/L琼脂和30g/L蔗糖的MS培养 基，如果以MS+6g/L琼脂+30g/L蔗糖等类似方式提及的培养基，亦是指添加了6g/L 琼脂和30g/L蔗糖的MS培养基。

在本发明中，2，4-D指的是2，4-二氯苯氧乙酸

在本发明中，6-BA指的是6-苄基腺嘌呤

在本发明中，IBA指的是吲哚丁酸

在本发明中，NAA指的是α-萘乙酸

本发明提供了一种巫山淫羊藿的组培快繁方法。本发明方法可以缩短培养时间，扩 大繁殖系数，保证种苗数量和质量，最终解决种苗的生产及供应问题，对实现巫山淫羊 藿的可持续利用具有重要意义。

本发明的目的在于提供一种巫山淫羊藿的组培快繁方法，使巫山淫羊藿成熟种子的 种胚在MS培养基上1个月后诱导出愈伤组织，两个月后分化出芽，4个月后生根长成 完整植株。

本发明所提供的巫山淫羊藿的组培快繁方法，包括：

A.外植体选择及处理：将采集到的巫山淫羊藿种子，去除杂质和不饱满颗粒，流 水冲洗30min，于75％酒精中浸泡30s，再在0.1％HgCl₂中浸泡6min，无菌水冲洗5 次后与经高温灭菌2h冷却至室温的河沙按1∶3的比例混合，保持含水量60％，经5℃ 低温层积处理90天打破种子休眠。

B.外植体消毒：将层积处理结束后的种子洗去河沙，于75％酒精中浸泡30s，无 菌水冲洗5次，再用0.1％HgCl₂消毒6min，无菌水冲洗5次，用灼烧冷却后的镊子和 解剖刀将种胚轻轻剥出，无菌滤纸吸干水分后，备用。

C.初代诱导：将经步骤B处理所得种胚接入初代诱导培养基，培养条件为MS分 别附加6g/L琼脂，30g/L蔗糖，pH5.8，温度(25±2)℃，光强2000lx，光照12h/d。在 MS+2，4-D 2mg/L+IBA 2mg/L+NAA 0.5mg/L的培养基上培养1个月后愈伤组织诱导率达 63.3％；在MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L+IBA 1mg/L的培养基上继续培养1月后愈伤 组织分化率可达73.8％。或者，将经步骤B处理所得种胚接入到MS+IBA 2mg/L+6-BA 0.5mg/L培养基上培养1～2月后芽诱导率可达77.8％。

D.继代增殖：将步骤C中愈伤组织分化的不定芽或直接诱导的芽丛分瓶，转接 到继代增殖培养基中，1个月后在MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L的增殖培养基上芽 的增殖系数可达2.17。

E.再生植株诱导生根：将诱导分化的1～4cm长的健康的芽丛长成的小植株转入生 根培养基1/2MS+0.1NAAmg/L中，1个月后形成白色须根，根系数一般在2～5条。

本申请还请求保护根据上述巫山淫羊藿的组培快繁方法获得的巫山淫羊藿愈伤组 织、芽及植株，其特征是：选择巫山淫羊藿成熟种子的种胚为外植体，在MS培养基上 培养1个月后诱导出愈伤组织，再过1个月分化出不定芽，也可不经过愈伤组织途径直 接诱导出芽，然后转接到生根培养基上，诱导生根形成完整植株。

本申请还请求保护一种巫山淫羊藿的组培快繁方法得到的巫山淫羊藿植株，其特征 是：先诱导出白色或绿色致密、坚实且生长旺盛的愈伤组织再分化成芽，或直接诱导出 芽，然后诱导生根形成完整植株。

本发明的优点在于：本发明诱导种胚产生愈伤组织分化出不定芽，愈伤组织分化不 定芽的过程，不需要更换培养基配方，分化率达73.8％，且种胚可以直接诱导出不定芽， 大大缩短了不定芽的诱导过程。本发明可以提高巫山淫羊藿的繁殖系数，缩短繁殖周期， 且方法简单，成本较低，适宜于生产应用。

附图说明

图1显示了成熟种子纵切后的种胚外植体的照片，图中标尺表示0.5mm。

图2显示了培养10天后外植体边缘长出绿色、白色的瘤状组织的照片，图中标尺 表示1mm。

图3显示了培养1个月后外植体形成的白色光滑，致密的愈伤组织的照片，图中标 尺表示1mm。

图4显示了培养2个月后愈伤组织分化出不定芽的照片，图中标尺表示5mm。

图5显示了芽增殖后形成的丛生芽的照片。

图6显示了生根形成完整植株的照片。

具体实施方式

实施例1：巫山淫羊藿种子处理及种胚的诱导试验

一、外植体选择及处理：将采集到的巫山淫羊藿种子，去除杂质和不饱满颗粒，流 水冲洗30min，于75％酒精中浸泡30s，再在0.1％HgCl₂中浸泡6min，无菌水冲洗5 次，无菌滤纸吸干水分后与经121℃、0.1Mpa高温灭菌2h后冷却至室温的河沙按1∶3 的比例混合均匀，保持含水量60％，经5℃低温层积处理90天打破种子休眠。

二、外植体消毒：将层积处理结束后的种子洗去河沙，于75％酒精中浸泡30s，无 菌水冲洗5次，再用0.1％HgCl₂消毒6min，无菌水冲洗5～6次，无菌滤纸吸干水分后， 用灼烧冷却后的镊子和解剖刀将种胚轻轻剥出，无菌滤纸吸干水分后，备用。

三、初代诱导

1.愈伤组织的诱导及分化

将步骤二所得种胚接种于添加6g/L琼脂和30g/L蔗糖的MS培养基中，该培养基 中还任选地添加了2，4-D、6-BA、NAA、IBA四者之一或者任意两种或更多种的组合以 及它们的不同浓度的添加剂。各培养基pH5.8，并且经121℃、0.1Mpa高温灭菌25min 处理。培养温度(25±2)℃，光照强度2000lx，光照12h/d。本发明人发现，诱导巫山淫羊 藿愈伤组织产生的最优培养基为MS+2，4-D 2mg/L+IBA 2mg/L+NAA 0.5mg/L，诱导率达 63.3％；愈伤组织分化的最适培养基为MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L+IBA 1mg/L，分 化率达73.8％。其它组成的培养基在愈伤组织诱导率和愈伤组织分化率均在40％以下。

2.芽的诱导

将步骤二所得种胚接种于不同浓度2，4-D(1、2、4、6mg/L)、IBA(0.5、1、2、4mg/L) 分别与6-BA(0.5、1mg/L)自由组合的MS培养基上。本发明人发现，在MS+IBA 2mg/L+6-BA 0.5mg/L培养基上芽的诱导率最高，为77.8％，而其它组合的培养基上芽的 诱导率均在45％以下。

四.继代增殖

将步骤三所得丛生芽长至2cm左右再分割成2～3个芽的芽丛接种到MS添加不同浓 度的6-BA(0.1、1、10mg/L)和NAA(0.5mg/L)组合的培养基中进行芽的增殖，以不加激 素处理作为对照，结果表明，MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L为芽的增殖培养基，既 可以使芽生长健壮，增殖速度适当，并保持较高增殖倍数，增殖系数达2.17。其它组合 的培养基在增殖系数方面远低于以上包含MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L的增殖培养 基所得的结果。

五.再生植株诱导生根

将诱导分化的1～4cm长的健康的芽丛长成的无根苗转入生根培养基1/2MS+0.1 NAAmg/L中进行生根培养，1个月后芽的基部逐渐长出白色的须根，根数一般在2～5条。

以上结果表明，巫山淫羊藿种胚愈伤组织诱导和分化的最适培养基分别为 MS+2，4-D 2mg/L+IBA 2mg/L+NAA 0.5mg/L、MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L+IBA 1mg/L，诱导率和分化率分别达63.3％、73.8％；芽诱导的最适培养基为MS+IBA 2mg/L+6-BA 0.5mg/L，诱导率达77.8％；芽增殖培养基为MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L，增殖系数为2.17；生根培养基为1/2MS+0.1NAAmg/L。

实施例2：组培快繁方法培育巫山淫羊藿

A.外植体选择及处理：将采集到的巫山淫羊藿种子，去除杂质和不饱满颗粒，流 水冲洗30min，于75％酒精中浸泡30s，再在0.1％HgCl₂中浸泡6min，无菌水冲洗5 次，无菌滤纸吸干水分后与经121℃，0.1Mpa高温灭菌2h冷却至室温的河沙按1∶3的 比例混合均匀，保持含水量60％，经5℃低温层积处理90天打破种子休眠。

B.外植体消毒：将层积处理结束后的种子洗去河沙，于75％酒精中浸泡30s，无 菌水冲洗5次，再用0.1％HgCl₂消毒6min，无菌水冲洗5～6次，无菌滤纸吸干水分后， 用灼烧冷却后的镊子和解剖刀将种胚轻轻剥出，无菌滤纸吸干水分后，备用。

C.初代诱导：将经步骤B处理所得种胚接入初代培养基，1个月后MS+2，4-D 2mg/L+IBA 2mg/L+NAA 0.5mg/L培养基上愈伤组织诱导率达63.3％；MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L+IBA 1mg/L培养基上愈伤组织分化率达73.8％；MS+IBA 2mg/L+6-BA 0.5mg/L培养基上芽诱导率达77.8％。

D.继代增殖：将步骤C中愈伤组织分化的不定芽及直接诱导的芽丛分瓶，转接 到继代增殖培养基中，1个月后增殖系数为2.17。

E.再生植株诱导生根：将诱导分化的1～4cm长的健康的芽丛长成的小植株转入生 根培养基中，1个月后形成白色须根，根系数一般在2～5条。