利用SCAR标记鉴定甘蔗抗褐锈病性方法

摘要

本发明涉及一种利用SCAR标记鉴定甘蔗抗褐锈病性的方法，包括基因组DNA的提取、SCAR-PCR标记的检测体系建立和SCAR-PCR产物的检测。本发明的利用SCAR标记鉴定甘蔗抗褐锈病性的方法，具有灵敏度高，所需要的DNA用量少的特点；与常规的抗性鉴定相比，具有操作简便、检测时间短、准确性高、容易判断、重复性好和不受环境条件影响等优点。为甘蔗种质资源的评价和新品种的审定工作，提供了更为简便有效的抗褐锈病性鉴定体系，对加强我国抗褐锈病甘蔗育种和抗褐锈病甘蔗种质资源的保护工作具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用分子标记技术鉴定植物抗病性方法，具体涉及利用SCAR标记鉴定甘蔗抗褐锈病性方法，属于生物技术领域。

背景技术

甘蔗（Saccharum officinarum）是禾本科甘蔗属植物，原产于热带、亚热带地区，具有高光效、光饱和点高、二氧化碳补偿点低、光呼吸率低和光合强度大的优点。甘蔗是我国最主要的糖料作物和生物量最高的绿色能源作物，其生产不仅关系我国食糖安全，还能为能源酒精的发展提供充足的原料。

由黑顶柄锈菌（Puccinia melanocephala）引起的甘蔗褐锈病是我国甘蔗生产中最重要的真菌性病害之一，在国外爪哇、古巴、澳大利亚、美国、墨西哥、印度、泰国和毛里求斯等国家普遍发生并多次爆发流行。该病主要由夏孢子传播，借风力附着在蔗叶表面，经气孔侵入。甘蔗褐锈病主要发生在叶片上。初次侵染源主要来自甘蔗本身和其他中间寄主。受褐锈病菌侵染后，侵染初期甘蔗叶片上长出黄色小斑点，色泽呈褐色至橙褐色，周围有黄色晕环，侵染后期病斑因夏孢子堆呈脓疱状，最后病斑变黑色，叶组织坏死，使甘蔗叶片失去光合能力，表现早衰，而此时甘蔗正处于大生长期中后期至糖分积累期，因此，不仅造成蔗茎产量损失，还对蔗糖分积累造成严重影响，一般减产10-25 %，重的可高达40 %，蔗糖分降低10-36 %。

由于甘蔗褐锈病一般在9月中下旬开始发生，此时甘蔗植株高大，冠层大，化学防治是不可能进行的，成本高，防治效果差。加强田间管理如剥除老叶增加通风等虽然有一定的作用，但是，必然会大幅度增加劳动力成本，蔗农所挽回的损失与人工付出无经济效益可言，因此，甘蔗生产上根本不可能采用。至于收获后残余的蔗叶，目前为了省工节本，一般留在田间，更增加了病害初侵染源。上述原因导致我国蔗区病害胁迫压力日趋加大，只有培育抗病品种，提高品种对褐锈病的抗性，才能实现对该病害的有效控制，这也是最经济的甘蔗褐锈病控制策略，而抗病性鉴定的效率和准确性直接影响抗褐锈病育种的进程和效果。

目前，国内外都是采用待鉴定甘蔗材料与感褐锈病甘蔗品种隔行种植，利用自然诱发感病品种发病，为待鉴定抗性的甘蔗基因型提供接种源---夏孢子，而后在整个生长季中，调查不同叶片上病原夏孢子堆所占叶片面积的比例来确定抗性的等级。该方法主要存在的问题：一是耗时长，每个作物季长达1年，且至少需要2个作物季的鉴定结果进行综合判断；二是工作量大、占地面积大、管理和调查成本高，难以对大规模的样品进行鉴定，这与甘蔗杂交育种是以分离世代（即实生苗）大群体为选择基础的甘蔗杂交育种相矛盾。就目前而言，我国年定植100万实生苗，显然，目前的褐锈病抗性鉴定技术只能在经过多年产量、品质等性状鉴定选择后的不多育种材料上进行，也即只能对十来个，最多几十个育种材料，才能实施对褐锈病抗性的鉴定，因此，必然失去了很多可供选择的机会；三是在病原、甘蔗基因型和环境三个因素互作的系统中，只有三个因素都具备，病害才能发生，也就是说，即便田间有病原、甘蔗基因型也是感病的，要发生病害，还需要合适的环境条件，三者缺一不可，因此，田间基于诱发的抗病性鉴定方法，鉴定结果难以预料。不同地点、不同年份间的鉴定结果有较大的差异，鉴定结果准确性不够。因此，研究并开发更高效、准确性更高且不受环境影响的抗褐锈病性鉴定方法，是甘蔗抗褐锈病育种最关键的技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用SCAR标记鉴定甘蔗抗褐锈病性的方法。

本发明利用SCAR标记鉴定甘蔗抗褐锈病性的方法，包括基因组DNA的提取、SCAR-PCR标记的检测体系建立和SCAR-PCR产物的检测，其特征在于：

1、              SCAR-PCR标记的检测：使用的检测引物是甘蔗SCAR-A和SCAR-B，其中，SCAR-A

是5'-ACTCGGTGTCCTAGTTGTGT-3′，SCAR-B是5'-GGACTCGGTATAGGACATCA-3'；   

2、SCAR-PCR标记的检测建立：SCAR-PCR扩增体系为总体积25 μl，内含2.5 μl 10×PCR缓冲液，2.5 μl 25 mmol/L MgCl₂，0.5 μl 10 mmol/L dNTP，10 mmol/L 的检测引物SCAR-A和SCAR-B各1.0 μl，1.25 U Taq DNA Polymerase，20-50 ng基因组DNA，ddH₂O补足到25 μl；SCAR-PCR扩增程序如下：94 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃10 min；所述10×PCR缓冲液组成成分为100 mmol/L pH8.5 Tris-HCl，500 mmol/L KCl和15 mmol/L MgCl₂；

3、SCAR-PCR产物的检测：电泳检测的SCAR-PCR扩增图谱中，在分子量为680 bp的位置出现DNA条带，为甘蔗抗褐锈病的标志。

本发明具有以下优点：

本发明的利用SCAR标记鉴定甘蔗抗褐锈病性的方法，具有灵敏度高，所需要的DNA用量少的特点；与常规的抗性鉴定相比，具有操作简便、检测时间短、准确性高、容易判断、重复性好和不受环境条件影响等优点。

1、操作简便：该检测方法得到的显性标记可显著减少甘蔗抗褐锈病性鉴定的工作量，检测时只需要SCAR-PCR扩增和产物检测即可快速鉴定甘蔗抗褐锈病性；而常规的抗性鉴定则需要大量的人力和物力开展田间种植和数据收集处理，当品种多时鉴定工作难以进行。

2、检测时间短：该检测方法所需时间为1-2天，而常规的抗性鉴定试验所需时间为2年以上。

3、准确性高、容易判断、重复性好，而且不受环境因素的影响：该检测方法以基因组DNA为材料，DNA是稳定的遗传物质，不受环境因素等的影响，同时它的680 bp条带的显性判断一目了然，减少了环境条件的影响和人为判断的偏差，大大提高了准确性；而常规的抗性鉴定试验中，受田间抗性鉴定数据收集时间和种植环境以及人工判读的影响，给准确判断造成困难。

本发明为甘蔗种质资源的评价和新品种的审定工作，提供了更为简便有效的抗褐锈病性鉴定体系，对加强我国抗褐锈病甘蔗育种和抗褐锈病甘蔗种质资源的保护工作具有重要意义。

附图说明

图1为使用甘蔗SCAR-A和SCAR-B检测引物鉴定8个甘蔗品种抗褐锈病性的SCAR-PCR扩增图谱。其中各泳道中，M代表分子量标准；C代表空白对照；R代表经本发明鉴定为抗褐锈病的对应甘蔗品种，经田间抗性鉴定证实为抗褐锈病；S代表经本发明鉴定为感褐锈病的对应甘蔗品种，经田间抗性鉴定证实为感褐锈病；1-8代表8个甘蔗品种，具体为1，CP72-356；2，MT70-611；3，ROC5；4，ROC10；5，MX703；6，MT79-83；7，GT11；8，YT93-159。

具体实施方式

    下面结合附图和实施例对本发明做进一步的阐述。

实施例1  一种利用SCAR标记鉴定甘蔗抗褐锈病性的方法

一种利用SCAR标记鉴定甘蔗抗褐锈病性的方法，包括以下步骤： 

1、基因组DNA的提取

（1）取5克待检测甘蔗植株的嫩叶，置研钵，加入液氮磨粹成粉末，并在解冻前转入50 ml的离心管中；

（2）加入15 ml、65 ℃预热的SDS提取液，混匀后在65 ℃水浴保温40 min；

（3）加8 ml 3 mol/L KAC混匀后，冰浴30 min；

（4）25000 g，4 ℃离心，20 min；收集上清液，并加入12 ml于4 ℃预冷的异丙醇；

（5）-20 ℃放置30 min后，钩出漂浮在液面的DNA，置于一干净的1.5 ml 离心管中，晾干后加入750 μl TE溶液；加等体积的平衡饱和酚，摇匀，12000 g，4 ℃离心，10 min； 

（6）转移上清至另一干净的1.5 ml 离心管中，加等体积的氯仿，12000 g，4 ℃，离心10 min后移出上层水相；

（7）在水相中加2倍体积的无水乙醇，12000 g，4 ℃离心10 min，留沉淀，用体积浓度为70 %的乙醇清洗2次，并晾干；

（8）加灭菌后的TE溶液200 μl溶解后，置-20 ℃冰箱中保存备用。

2、SCAR-PCR标记的检测建立

SCAR-PCR扩增体系为总体积25 μl，内含2.5 μl 10×PCR缓冲液，2.5 μl 25 mmol/L MgCl₂，0.5 μl 10 mmol/L dNTP，10 mmol/L 的检测引物SCAR-A和SCAR-B各1.0 μl，1.25 U Taq DNA Polymerase，20-50 ng基因组DNA，ddH₂O补足到25 μl。  

SCAR-PCR扩增程序如下：94 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃10 min。

    所述专用检测引物SCAR-A和SCAR-B，是采用RAPD-PCR技术，经过大量的筛选试验，获得了抗褐锈病甘蔗的特异DNA片段，以此片段的DNA序列为基础，设计甘蔗抗褐锈病性鉴定的检测引物。所述检测引物SCAR-A和SCAR-B的具体内容为：       

SCAR-A：5'-ACTCGGTGTCCTAGTTGTGT-3′，

SCAR-B：5'-GGACTCGGTATAGGACATCA-3'。

3、SCAR-PCR扩增产物的检测

具体的检测方法为，取SCAR-PCR扩增产物10 μl，加5 μl含有溴酚蓝的上样缓冲液，混匀后点样于含有0.5 μg/ml溴化乙锭的1.5 %琼脂糖凝胶上，于0.5×TBE缓冲液中，10 V/cm恒定电压下电泳1.5 h，结束后在凝胶成像系统上成像并进行凝胶分析。

SCAR-PCR产物的检测结果：采用检测引物SCAR-A和SCAR-B对甘蔗进行SCAR-PCR扩增，结果如图1所示，只有抗褐锈病甘蔗出现分子量为680 bp的DNA条带，而感褐锈病甘蔗不出现680 bp的DNA条带。

我们取8个待检测抗褐锈病性的甘蔗品种用SCAR标记方法鉴定和田间抗性鉴定的结果进行比较，结果是一致的。如图1所示，出现分子量为680 bp的DNA条带的甘蔗品种，经田间抗性鉴定均为抗褐锈病品种；未出现分子量为680 bp的DNA条带的甘蔗品种，经田间抗性鉴定均为感褐锈病品种。

本发明采用的主要试剂如下（所有化学试剂均为分析纯）

1、SDS提取液：NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na₂HPO₄ 1.44 g、KH₂ PO₄ 0.24 g、SDS 2 g、甘油50 ml, 灭菌去离子1 L，pH 值7.4；

2、TE溶液：10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA；

3、上样缓冲液：0.1 %溴酚蓝，40 %蔗糖；

4、0.5×TBE缓冲液：44.5 mmol/L Tris，50 mmol/L HBO₃，1 mmol/L EDTA；

5、PCR扩增试剂购自大连宝生物公司。

本发明所使用的仪器主要如下：

1、PCR扩增仪：德国Eppendorf 5331 PCR扩增仪；

2、电泳仪：北京六一仪器厂DYCZ-20A DNA序列分析电泳仪；

3、离心机：德国Eppendorf 5810/5810R多功能台式离心机；

4、凝胶成像系统：美国BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。 

<110>  福建农林大学

 

<120>  利用SCAR标记鉴定甘蔗抗褐锈病性方法

 

<130> 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  Saccharum officinarum

 

<400>  1

actcggtgtc ctagttgtgt                                                   20

 

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  Saccharum officinarum

 

<400>  2

ggactcggta taggacatca                                                   20