一种萝卜胞质雄性不育分子标记及其辅助选择育种的方法

摘要

本发明公开了一种萝卜胞质雄性不育分子标记及其辅助选择育种的方法，该方法以白玉春萝卜胞质不育材料育性分离的F2代和回交一代的基因组DNA为模板，通过RAPD分析，多次重复试验，筛选得到了与萝卜胞质不育育性恢复基因连锁的2个RAPD标记，S88-1526和S1344-415，其分别位于恢复基因的两侧，遗传距离分别为4.2cM和6.9cM。进一步成功将RAPD标记S88-1526转化为SCAR标记scar-88。连锁分析表明，标记scar-88与恢复基因之间的交换值为4.28％，相应的遗传距离为4.24cM。可以在萝卜胞质雄性不育育种中进行早期的分子标记辅助选择，加快育种进程。

说明书

技术领域

本发明属于农业的蔬菜品种选育与生物技术领域，具体涉及萝卜胞质雄性 不育的RAPD和SCAR标记及其用于辅助选择育种的应用。

背景技术

近三十多年以来，植物雄性不育一直是作物遗传育种、生物学研究的热门 领域。细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility，CMS)是其中最有利用 价值的雄性不育类型之一。20世纪70年代，Ogura报道了由细胞质不育基因S 和2对细胞核不育基因ms共同控制的萝卜胞质雄性不育(CMS)。自Ogura不 育胞质发现以来，国内外学者对萝卜雄性不育的不育机理及恢复基因进行了多 方面研究，但传统的萝卜雄性不育选育主要通过花期观察进行选择，周期长、 速度慢。RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)是由Williams和Welsh 两个研究小组于1990年分别研究提出，它是一种建立在PCR基础上的能对整个 未知序列的基因组进行多态性分析的DNA分子标记技术。RAPD标记技术具有操 作简单、灵敏度高、检测容易迅速、特异性强、DNA样品用量少等特点；但RAPD 反应条件不严谨，其重复性较差，需要转化成较稳定的SCAR标记。序列特异扩 增区域(Sequence Characterized Amplified Region，SCAR)是由Paran和 Michelmore于1993年提出并应用的，它以PCR技术为基础，操作简单、稳定， 可以更有效快速的识别由RAPD标记转化而来的新标记，由于SCAR标记通常为 显性标记，所以通过转化可以使RAPD标记的稳定性和信息量得以增加。

分子标记辅助育种(marker assisted selection，缩写为MAS)是分子育种 的一种，其基本原理是利用与目标基因紧密连锁的分子标记，通过对待选个体 目的片段的检测筛选目标基因个体，从而达到提高育种效率的目的。MAS可以在 植物生长的任意阶段进行，不受时间、标记数量和环境的限制；对于如病害、 抗性等后期性状，可以在苗期即进行检测，通过早期预防和控制减少后期人力、 物力和财力的浪费；对于表型难以确定或者性状连锁遗传基因，可以通过分子 标记方法与传统育种方法相结合，有目的地将有利基因聚合；此外，其还可以 鉴别显性和共显性标记，从而免去后代的再鉴定，缩短育种年限。

自从20世纪70年代开始，西北农林科技大学园艺学院蔬菜科学系在萝卜 种质资源、新品种选育和胞质雄性不育系进行了大量研究，育成了细胞质雄性 不育材料。由于不育性传统的选育方法需要等到花期通过田间直接观察完成， 对于携带恢复基因的优良材料，要将其转育为不育系，必须经过杂交、自交， 同时用不育系测交判断其基因型等过程，操作起来费时费力，周期长，育种进 程慢。为了加快萝卜胞质雄性不育育种速度，采用现代生物技术，进行分子标 记辅助育种十分迫切。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种萝卜胞质不育的RAPD和SCAR标记及其采 用该标记用于辅助选择育种的方法。本发明利用RAPD技术，得到与育性基因紧 密连锁的RAPD分子标记，然后将RAPD分子标记成功转化SCAR标记，为开展萝 卜胞质不育分子标记辅助育种奠定基础。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种萝卜胞质雄性不育的RAPD标记，其特征在于，该RAPD标记是特异片 段S88-1526(1526bp)和特异片段S1344-415(415bp)，其核苷酸序列分别为：

特异片段S88-1526(1526bp)：

TCACGTCCACTTCCAAAATACCGTGTTCTACTGCGTCACGGATCCAGCTGCCCACGTAAGCCAT GTCGGTTTCATCTCCATCGTGACGTTGTAGAGAGAATTTCTTTATAAGCGAACCATGTTGTGTTCGAT CCAAAAAGTTTCTGAGGCTCTCACCTCTCTCTGGTTTACCGTTTTCCGGGTCCACAGAGACAGAAGAA TAGAAATTAAAATAATCCACCAATCTAAATATATTTCTCCACTTTTTAGAAAGAAGAGATGTTAAAAC AGCCTGTTTTATCGGAAGTAAGGACAAGATGTCACCGAGAATCTCGTCAGGGAGGAAGCTGATTGCAT CTATAGAGATAAGGAAGACACTTAGCGATAATGTTAAACTTCCATATTGTGTTAATGTTAAACTTCCA TATCTTCACGGTAGAAGGAAACAATACGATGTATATATATGTTGCTATGAATGTCAATACAAGACACG CTTTCATATTATTTTATGGTATCAGAGCAGAAAACGATCTTTTGACCTAAATTCTCAAATTTTCGCTT CCGCATAACATCGTACTCTACTCCGTGCTTGTCAAGAAACAAACATGGCTACTACTTCTTCTACAGAG TCAGCTACTTCTCCATCCTCTGTTTCTACGATGTCTACTACTACTGGTGTTTCACCAAACCCTTATGC TCTTCATCACTCTGACAATCCGGGCGCGTTGATCACGCCGGTTCTTCTCAAAGGCGACAATTACTCCG AATGGGCAACCGAGTTCTGGAACTCGCTTCAAGCTAAACAAAAGATTGGGTTCATCGATGGTACCATA CCTAAACCTTCGACGAATCCCGATCTAGCTCTATGGACCTCTGCTAACTCAATGATCGTGGGATGGAT ACGCACGTCGATTGATCCTCCTGTTCGGTCTACTGTAAGTTACGTTCCAGACGCTCACCAACTCTGGG AATCTCTCAAGCGTCGATTCTCGGTAAAGAACAGCGTGCGCAAGCACTTACTTGAGGATGAAATCACC AATTGCAAACAAAACGGTGAAACTGTCCTTAGCTATTTTGGTCGTCTCTCTAAACTGTGGGAAGAACT ACAGAGCTTCAAATCTCATTACACCTGCACGTGTGAGGCGTCAACTCATCTTGAAAAAGAACGAGAAG ATGCCAAAGTCCACAAATTTCTGTTTGGTCTTGACGATTCAAGGTTCAGTGCGATTCGGTCGCAGATA ATCGACGAAGAACCACTACCTGACCTGAATCTAGCTTACTCACGAGTCATACGTGCTGAACAACACAT TCACACCATGCGCTCAACTGAACTCAAGCAAGATGTTCTCGGGTTTGCAGTCAAGACAGATTCTTCGG CTTCTACGACTTCTCCCAATGTCACCGCACCTCGCAGCCGTGATCCTAACCGTTTTTGCACTCACTGC AACCGCAAAGGCCATGAAGCTTCAGAATGCTTCCTATTGCACGGGTATCCAGATTGGTTCAACGATCA ACAAAGGAATGCTCAGTCCTCTGGTCAGTCGCAACGAGGTCGGGGTGGACGTGA；

特异片段S1344-415(415bp)：

AAGGCTCGACACGGTAATGTTGAGTTCCGAGGTCTGTACCCAACTAAACCTTCACCTCCGTCAT CAATCTTCATCCTAAGCACTTCTTTGGAAGTGAAGCTGGAGCTTGAGATTCGTCTAGTCTCTTCGGTA AGCTATGTTGGGTTCAAAGCTGAGAGTTCTTGTTTCAGCGCCAAATCAAATCATGTAGGACTTCGTAC TCTCAAGGTCGTCTACATTTCTAAAGCTCTTCACCTTAAGCTTTGGTCAGTCAACAACACAAGGTGTA TCAACGTCGTTCTCGACTATCAATTGTTCCTAGGAACAATCGCCATGGGATCAAAAGTGGAGCTTCCT ATCGGGTCTCTTCATTTCGCTGAGCTTGACTCGCCCCTAGATGGTTCTATCCTTAGCTGCTTTGTATT ATTTTTTAGTTTCTTTCGACCGTCGAGCCTT。

上述特异片段在序列前端分别为RAPD引物S88和S1344，在后端则分别为 两引物的反向互补序列；其序列为：

S88：5’-TCACGTCCAC-3’；

S1344：5’-AAGGCTCGAC-3’。

一种萝卜胞质雄性不育的SCAR标记，其特征在于，该SCAR标记是特异片 段scar-88，特异片段全长1521bp，其核酸序列为：

CAAAATACCGTGTTCTACTGCGTCACGGATCCAGCTGCCCACGTAAGCCATGTCGGTTTCATCT CCATCGTGACGTTGTAGAGAGAATTTCTTTATAAGCGAACCATGTTGTGTTCGATCCAAAAAGTTTCT GAGGCTCTCACCTCTCTCTGGTTTACCGTTTTCCGGGTCCACAGAGACAGAAGAATAGAAATTAAAAT AATCCACCAATCTAAATATATTTCTCCACTTTTTAGAAAGAAGAGATGTTAAAACAGCCTGTTTTATC GGAAGTAAGGACAAGATGTCACCGAGAATCTCGTCAGGGAGGAAGCTGATTGCATCTATAGAGATAAG GAAGACACTTAGCGATAATGTTAAACTTCCATATTGTGTTAATGTTAAACTTCCATATCTTCACGGTA GAAGGAAACAATACGATGTATATATATGTTGCTATGAATGTCAATACAAGACACGCTTTCATATTATT TTATGGTATCAGAGCAGAAAACGATCTTTTGACCTAAATTCTCAAATTTTCGCTTCCGCATAACATCG TACTCTACTCCGTGCTTGTCAAGAAACAAACATGGCTACTACTTCTTCTACAGAGTCAGCTACTTCTC CATCCTCTGTTTCTACGATGTCTACTACTACTGGTGTTTCACCAAACCCTTATGCTCTTCATCACTCT GACAATCCGGGCGCGTTGATCACGCCGGTTCTTCTCAAAGGCGACAATTACTCCGAATGGGCAACCGA GTTCTGGAACTCGCTTCAAGCTAAACAAAAGATTGGGTTCATCGATGGTACCATACCTAAACCTTCGA CGAATCCCGATCTAGCTCTATGGACCTCTGCTAACTCAATGATCGTGGGATGGATACGCACGTCGATT GATCCTCCTGTTCGGTCTACTGTAAGTTACGTTCCAGACGCTCACCAACTCTGGGAATCTCTCAAGCG TCGATTCTCGGTAAAGAACAGCGTGCGCAAGCACTTACTTGAGGATGAAATCACCAATTGCAAACAAA ACGGTGAAACTGTCCTTAGCTATTTTGGTCGTCTCTCTAAACTGTGGGAAGAACTACAGAGCTTCAAA TCTCATTACACCTGCACGTGTGAGGCGTCAACTCATCTTGAAAAAGAACGAGAAGATGCCAAAGTCCA CAAATTTCTGTTTGGTCTTGACGATTCAAGGTTCAGTGCGATTCGGTCGCAGATAATCGATGAAGAAC CACTACCTGACCTGAATCTAGCTTACTCACGAGTCATACGTGCTGAACAACACATTCACACCATGCGC TCAACTGAACTCAAGCAAGATGTTCTCGGGTTTGCAGTCAAGACAGATTCTTCGGCTTCTACGACTTC TCCCAATGTCACCGCACCTCGCAGCCGTGATCCTAACCGTTTTTGCACTCACTGCAACCGCAAAGGCC ATGAAGCTTCAGAATGCTTCCTATTGCACGGGTATCCAGATTGGTTCAACGATCAACAAAGGAATGCT CAGTCCTCTGGTCAGTCGCAACGAGGTCG。

上述特异片段的的两端有SCAR引物对scar-88的上游引物和下游引物的反 相互补序列，其序列为：

scar-88：5’-CAAAATACCGTGTTCTACTGCGTC-3’；

         5’-CGACCTCGTTGCGACTGAC-3’。

上述萝卜胞质雄性不育的RAPD和SCAR标记，经过发明人的实验证明，可 以在萝卜胞质雄性不育育种中进行早期的分子标记辅助选择，加快育种进程。

其辅助选择育种的方法是，首先用萝卜胞质雄性不育系与优良恢复系杂交、 然后用杂交一代与不育系回交得BC1代或杂交一代自交获得F2代育性分离群体 材料，接着进行单株DNA提取，用RAPD引物或SCAR引物进行扩增，进行RAPD 标记和SCAR标记在分离群体中分离规律分析，选择带有阳性RAPD和SCAR标记 的单株即为可育株，不带RAPD和SCAR标记的单株即为不育株。

辅助选择育种的具体步骤是：

1)群体材料的准备：

以萝卜胞质雄性不育系与优良恢复系杂交，蕾期将F1代与不育系回交或杂 交一代F1单株自交获得F2代，选取100粒～200粒饱满的BC₁(B20×A20，B21×A21 和B30×A30)代或F₂代(A20-1，A20-2，A21-2，A30)种子和亲本种子催芽春化 后播种于大田，在幼苗期，给BC₁代或F₂代单株编号，于苗期取幼苗嫩叶片用于 提取DNA，开花期鉴定植株育性；

2)DNA提取

A、取0.2g去掉主脉的新鲜嫩叶片，塞入1.5mL的离心管中，放入液氮中 速冻，用75％酒精浸泡过的塑料研磨棒迅速研磨至粉末；

B、向离心管中加700μL经65℃预热的1×CTAB提取液，(提取液的配方 是：CTAB：20g/L，Tris-HCl：100mmol/L，EDTA：20mmol/L，NaCl：1.4mol/L)， 再加入8μL的β-巯基乙醇，迅速混匀；

C、随后将离心管放入65℃水浴中，每间隔5min分钟摇一次，水浴30min；

D、取出离心管，加入700μL的酚、氯仿和异戊醇的混合物，其中，酚∶ 氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1，摇匀15min后，常温下12000r/min离心10min；

E、吸取600μL上层液相转移到另一离心管中，并加入600μL氯仿和异戊 醇的混合液，其中，氯仿∶异戊醇＝24∶1，轻轻摇匀10min，常温下12000r/min 离心10min；

F、取500μL上清，加入2倍体积的预冷的无水乙醇，轻轻混匀，使DNA 抱团，-20℃条件下沉淀过夜后，4℃条件下12000r/min离心10min；

G、弃上清，加入500μl的75％乙醇洗涤沉淀2次，沉淀物室温晾干；

H、加入500μL的1×TE缓冲液溶解DNA，并加入0.25μL的RNaseA，混 匀，离心后37℃保温30min；

I、待DNA完全溶解后，加入3mol/L的NaAC溶液50μL和2倍体积预冷的 无水乙醇，轻轻混匀，使DNA抱团，-20℃条件下沉淀30min；

J、在4℃、12000r/m条件下离心10min，弃上清，加入质量浓度为75％的 乙醇清洗沉淀1～2次，然后加入灭菌的400μL～500μL的ddH₂O进行稀释，然 后提取DNA，经纯度检测后，存于-20℃中备用；

3)RAPD-PCR扩增：

用引物S88和S1344进行RAPD-PCR扩增，在25μL PCR反应体系中进行， 反应体系为为25μl，其中ddH₂O 16.3μl，10×buffer 2.5μl，25mM的MgCl₂2μl，10mM dNTP 0.5μl，5μ/μl的Taq DNA聚合酶0.2μl，10μm的引物 1.5μl，20ng/μl的模板DNA 2μl。

PCR反应程序为：94℃变性：4min；94℃：60s，36℃：60s，72℃：90s，4 共进行5个循环；72℃延伸10min，扩增结束后置4℃待检测。

电泳：PCR产物采用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳缓冲液为1×TAE，120V 下电泳1h，电泳结束后EB染色，凝胶成像系统照相；

4)SCAR标记的扩增

用scar-88的上游引物和下游引物进行RAPD-PCR扩增，反应体系为25μL， ddH₂O：15.3μL，10×buffer：2.5μL，25mM的MgCl₂：2μL，10mMdNTP：0.5 μL，5μ/μL的Taq DNA聚合酶：0.2μL，10μM的引物正反向各1.0μL，20ng/ μL的模板DNA 2.5μL；

PCR反应程序：94℃变性：4min；94℃：60s，60℃：60s，72℃：2min， 共进行30个循环；72℃延伸5min，扩增结束后置4℃待检测；

电泳：利用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的多态性，电泳缓冲液为 1×TAE，150V下电泳1h，电泳结束后EB染色，凝胶成像系统照相；

5)选择带有阳性RAPD或SCAR标记的单株即为可育株，不带RAPD或SCAR标记 的单株即为不育株，不需要等到植株开花。

本发明对72个个体的群体单株进行RAPD引物扩增，其中引物S88在34株可育 株中全都扩增出差异条带S88-1526，38个不育株中有3株扩增出此差异条带。引 物S1344在群体单株验证中34株可育株全都扩增出差异条带S1344-415，不育的 38株中有5株扩增出此差异条带。经Mapmaker/Exp(Version 3.0b)软件计算， S88-1526与目的基因的遗传距离为4.2cM；S1344-415与目的基因的遗传距离为 6.9cM；S88-1526和S1344-415之间的距离为10.1cM，所以两个标记位于目的基 因的两侧。将RAPD标记S88-1526成功转化为SCAR标记后，在群体140个单株中 检验scar-88与可育基因的连锁关系，在可育群体73个单株中有3株无条带，其 余均有条带；在不育群体67株单株中有3株有条带，其余均没有条带。连锁分析 表明，标记scar-88与可育基因的的重组率为4.28％，相应的遗传距离为4.24cM。

附图说明

图1是CTAB法提取的萝卜基因组DNA质量检测，其中标记分别表示：M：DNA 标准分子量；1-15：随机选取的15个单株DNA；

图2是引物S88对DNA池内单株的扩增结果，其中标记分别表示：1-6：可育 单株，7-12：不育单株，M：DL2000，箭头所指为差异带S88-1526。

图3是引物S1344对DNA池内单株的扩增结果，其中标记分别表示：1-4：可 育池单株，5-8：不育池单株，M：DL2000，箭头所指为差异带。

图4是引物S88在BC1(B20×A20)群体中的单株扩增，其中标记分别表示： M：DNA标准分子量；1-16：随机选取的BC1群体单株；箭头所指为差异带S88-1526。

图5是引物S1344在BC1(B20×A20)群体中的单株扩增，其中标记分别表示： M：DNA标准分子量；1-22：随机选取的BC1群体单株；箭头所指为差异带 S1344-415。

图6是标记S88-1526和S1344-415与可育基因的连锁图。

图7是scar-88在建池单株中的扩增结果，其中标记分别表示：1-10为可育 池单株，11-20为不育池单株，M：DL2000，箭头所指为差异带。

图8是标记scar-88的BC1群体单株验证，其中标记分别表示：M：DNA标准分 子量；1-12：BC1群体单株，有条带：可育单株，无条带：不育单株。

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。

具体实施方式

本实施例以白玉春萝卜胞质雄性不育材料为研究对象，其中BC1代3份：B20 ×A20，B21×A21，B30×A30和F2代4份：A20-1，A20-2，A21-2，A30。以B20× A20群体作为标记筛选材料。

研究利用RAPD技术筛选与萝卜细胞质雄性不育相关的特异性标记，进一步 对特异片段克隆测序，将其转化为SCAR标记，并且通过标记在验证群体中的分 离表现，计算其连锁距离，将所得RAPD和SACR标记应用于分子育种。

首先通过育性表现分析不育材料的遗传规律，然后对分离群体进行RAPD引 物的筛选，对特异片段克隆测序后将其转化为SCAR标记，随后在群体中计算其 遗传距离，验证其与目标基因的连锁的关系。具体如下：

1、萝卜胞质不育育性遗传规律分析

花期对各育性分离材料的育性进行了调查，卡方测验表明：4个F2代的可育 株与不育株分离比均符合3∶1的分离比例。三个回交一代的可育株与不育株均符 合1∶1的比例。由此说明该萝卜雄性不育由一对细胞核基因控制，核内可育基因 与不育基因独立遗传，且可育基因对不育基因完全显性。

2、DNA提取

A、取0.2g去掉主脉的新鲜嫩叶片，塞入1.5mL的离心管中，放入液氮中 速冻，用75％酒精浸泡过的塑料研磨棒迅速研磨至粉末；

B、向离心管中加700μL经65℃预热的1×CTAB提取液，(提取液的配方 是：CTAB：2％，Tris-HCl 100mmol/L，EDTA 20mmol/L，NaCl 1.4mol/L)， 再加入8μL的β-巯基乙醇，迅速混匀；

C、随后将离心管放入65℃水浴中，每间隔5min分钟摇一次，水浴30min；

D、取出离心管，加入700μL的酚、氯仿和异戊醇的混合物，其中，酚∶ 氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1，摇匀15min后，常温下12000r/min离心10min；

E、吸取600μL上层液相转移到另一离心管中，并加入600μL氯仿和异戊 醇的混合液，其中，氯仿∶异戊醇＝24∶1，轻轻摇匀10min，常温下12000r/min 离心10min；

F、取500μL上清，加入2倍体积的预冷的无水乙醇，轻轻混匀，使DNA 抱团，-20℃条件下沉淀过夜后，4℃条件下12000r/min离心10min；

G、弃上清，加入500μl的75％乙醇洗涤沉淀2次，沉淀物室温晾干；

H、加入500μL的1×TE缓冲液溶解DNA，并加入0.25μL的RNaseA，混 匀，离心后37℃保温30min；

I、待DNA完全溶解后，加入3mol/L的NaAC溶液50μL和2倍体积预冷 的无水乙醇，轻轻混匀，使DNA抱团，-20℃条件下沉淀30min；

J、在4℃、12000r/m条件下离心10min，弃上清，加入75％乙醇清洗沉 淀1～2次，后加入灭菌的400μL～500μL的ddH₂O稀释。提取的DNA，经纯 度检测后，存于-20℃中备用；

3、RAPD-PCR扩增：

用引物S88和S1344进行RAPD-PCR扩增，在25μL PCR反应体系中进行， 反应体系为25μl，其中ddH₂O：16.3μl，10×buffer：2.5μl，25mM的MgCl₂： 2μl，10mM dNTP：0.5μl，5U/μl的Taq DNA聚合酶0.2μl，10μm的引物 1.5μl，20ng/μl的模板DNA 2μl；

PCR反应程序为：94℃变性：4min；94℃：60s，36℃：60s，72℃：90s，共 进行45个循环；72℃延伸10min，扩增结束后置4℃待检测；

电泳：PCR产物采用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳缓冲液为1×TAE，120V 下电泳1h，电泳结束后EB染色，凝胶成像系统照相；

4、SCAR标记的扩增：

用scar-88的上游引物和下游引物进行RAPD-PCR扩增，反应体系为25μL， ddH₂O：15.3μL，10×buffer：2.5μL，25mM的MgCl₂：2μL，10mMdNTP：0.5 μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶：0.2μL，10μM的引物正反向各1.0μL，20ng/ μL的模板DNA 2.5μL；

PCR反应程序：94℃变性：4min；94℃：60s，60℃：60s，72℃：2min， 共进行30个循环；72℃延伸5min，扩增结束后置4℃待检测；

电泳：利用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的多态性，电泳缓冲液为 1×TAE，150V下电泳1h，电泳结束后EB染色，凝胶成像系统照相；

5、RAPD标记序列分析与测序：

将引物S88和S1344扩增的得到的产物用1％琼脂糖凝胶分离，在紫外灯下切 下目的片段，用上海生工UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒纯化，纯化步骤如下：

A、按400μl/100mg凝胶的比例加入Binging Buffer II，置于50-60℃水浴 中N min，每1min混匀一次，使胶彻底熔化。

B、将熔化的胶溶液移到套放在2ml收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2min。

C、6000rpm室温离心1min。取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液。

D、将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，加入500μl Wash Solution，6000rpm 室温离心1min。

E、重复上一步洗涤一次。

F、取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放回到同一个收集 管中，12000rpm室温离心30sec。

G、将UNIQ-10柱放入一个新的1.5ml微量离心管中，在柱子膜中央加20/10μl Elution Buffer(或dd water，pH＞7.0)，室温或37℃放置2min(55-80℃洗脱 效果更好)。

H、12000rpm室温离心1min，离心管中的液体就是回收的目的片段。

将目的片断与pGEM-Teasy载体连接后转化到感受态细胞中，挑取单克隆菌 落，选取经PCR鉴定为阳性的单克隆菌落送北京三博远志生物技术有限公司测 序。

结果表明，特异条带S88-1526包含引物序列的特异片段长度为1546bp，特 异条带S1344-415包含引物序列的特异片段长度为435bp，在序列的两端分别为 RAPD引物S88和S1344的正向序列和反向互补序列。

特异片段S88-1526(1526bp+20bp)和S1344-415(415bp+20bp)的核酸序列 如核苷酸或氨基酸序列表和计算机可读形式的序列表所示。

上述特异片段S88-1526(1526bp+20bp)和S1344-415(415bp+20bp)在序 列前端分别为RAPD引物S88和S1344，在后端则分别为S88和S1344两引物的 反向互补序列。其序列为：

S88：5’-TCACGTCCAC-3’；

S1344：5’-AAGGCTCGAC-3’。

将S88-1526和S1344-415核苷酸序列分别输入GeneBank，用Blast对核苷 酸序列库进行同源性搜索和序列比对：S88-1526仅仅与大白菜BAC文库的克隆 KbrB091E13和KBrH001K17同源性为88％(291/332)；S1344-415仅仅与大白菜 BAC文库的克隆KbrB011P07同源性为75％(312/412)，说明这两个序列均是萝 卜的新序列。

6、SCAR标记的转化和序列分析

根据测序结果，采用Primer Premier5.0设计SCAR引物对，反应体系为25μ L，ddH₂O：15.3μL，10×buffer：2.5μL，25mM的MgCl₂：2μL，10mMdNTP：0.5 μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶：0.2μL，10μM的引物正反向各1.0μL，20ng/ μL的模板DNA 2.5μL。

PCR反应程序：94℃变性4min；94℃：60s，60℃：60s，72℃：2min，共进 行30个循环；72℃延伸5min，扩增结束后置4℃待检测。

电泳：利用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的多态性。电泳缓冲液为 1×TAE，150V下电泳1h，电泳结束后EB染色，凝胶成像系统照相。

将S88-1526成功转化为SCAR标记scar-88(如图7)。在群体140个单株 中检验scar-88与可育基因的连锁，在可育群体73个单株中有3株无条带，其 余均有条带；在不育群体67株单株中有3株有条带，其余均没有条带(图8)。 连锁分析表明，标记scar-88与可育基因的的重组率为4.28％，相应的遗传距离 为4.24cM。

将SCAR标记目的片段克隆测序后发现，序列全长与预期一致，为1521bp， 两端为SCAR引物对scar-88的上游引物和下游引物的反向互补序列。将序列 scar-88输入DNAstar与S88-1526对比验证，同源性为100％，已经成功转化改RAPD 标记为SCAR标记。

特异片段scar-88的核酸序列如核苷酸或氨基酸序列表和计算机可读形式 的序列表所示。

上述scar-88特异片段在序列前端和后端分别为scar-88引物的上游引物和 下游引物的反向互补序列。其序列为：

scar-88：5’-CAAAATACCGTGTTCTACTGCGTC-3’；

         5’-CGACCTCGTTGCGACTGAC-3’。

7、RAPD标记与细胞质雄性不育性状可育基因的连锁关系

对含有目的基因的萝卜回交一代群体(B20×A20)中单株进行育性统计和 RAPD标记分析，结果利用Mapmaker/Exp(Version 3.0b)软件分析RAPD标记与可 育基因间的连锁关系。标记S88-1526与可育基因的遗传距离为4.2cM，在群体间 的重组交换率为4.16％；标记S1344-415与目的基因的遗传距离为6.9cM，重组交 换率为6.94％。S88-1526和S1344-415之间的距离为10.1cM，所以两个标记位于 目的基因的两侧。

8、SCAR标记与细胞质雄性不育性状可育基因的连锁关系

对含有目的基因的萝卜回交一代群体B20×A20中单株进行育性统计和SCAR 标记scar-88分析，经过连锁分析，标记scar-88在BC1群体的140个单株中重组 率为4.28％，相应的遗传距离为4.24cM。

9、RAPD标记选择策略

选择带有阳性RAPD标记的单株即为可育株，不带RAPD标记的单株即为不育 株，不需要等到植株开花，缩短了育种进程，RAPD反应比较敏感，对操作条件 要求严格，有一定的局限性。

10、SCAR标记特征及其选择策略

SCAR标记以PCR技术为基础，比RAPD标记更稳定，并且扩增为单一条带、便 于观察，可以更有效的识别目的基因。所得到的SCAR标记scar-88为独立遗传的 完全显性标记，在可育株中能扩增出scar-88特异条带，不育株中则不能扩增出 该条带，只要在后代植株的DNA中检测得到scar-88特异条带就可判断其为可育 植株，没有条带的则为不育株，无需等到花期鉴定即可通过标记早期准确选择。

11、RAPD特异引物的筛选和分子标记连锁分析

如图1所示，所提取DNA片段条带清楚无污染，可以用于PCR扩增实验。利用 500条RAPD随机引物扩增检测可育DNA池和不育DNA池的多态性，结果90％以上的 引物都能在两池中扩出条带，不同引物扩增的RAPD条带数目为0～10条不等， RAPD片段大小在0.3～2.0kb之间。引物S88、S1344、S1389、S1287、S170在可 育DNA池与不育DNA池间可扩增出差异条带(可育池有此差异条带，不育池没有 此差异条带)，其中S1389、S1287、S170扩增得到的差异条带在多次重复验证中 稳定性较差，S88、S1344扩增的差异条带有很好的稳定性。

引物S88扩增出的特异条带为1526bp，命名为S88-1526(图2)，引物S1344 扩增出的特异条带大小为415bp，命名为S1344-415(图3)。分别用引物S88和 S1344对构成可育DNA池和不育DNA池的单株进行验证。引物S88在可育池的10株 中都扩增出此差异条带，不育池的10株中有1株扩增出此差异条带。引物S1344 在可育池的10株中都扩增出此差异条带，不育池的10株中有2株扩增出此差异条 带。

进一步用引物S88和S1344对分离群体BC₁(B20×A20)群体单株验证，其中：

引物S88在34株可育株中全都扩增出差异条带S88-1526，38个不育株中有3 株扩增出此差异条带(图4)。

引物S1344在群体单株验证中34株可育株全都扩增出差异条带S1344-415， 不育的38株中有5株扩增出此差异条带(图5)。

经Mapmaker/Exp(Version 3.0b)软件计算，S88-1526与目的基因的遗传距 离为4.2cM；S1344-415与目的基因的遗传距离为6.9cM；S88-1526和S1344-415 之间的距离为10.1cM，所以两个标记位于目的基因的两侧，其连锁关系见图6。