一种微流控浓度梯度液滴生成芯片及生成装置及其应用

摘要

本发明公开了一种微流控浓度梯度液滴生成芯片及微流控浓度梯度液滴生成装置，所述微流控浓度梯度液滴生成芯片是在玻璃、石英或耐有机溶剂材料加工的芯片基材上加工一条样品分散通道，一条以上试剂通道，一条以上不互溶相通道，一条液滴反应和检测通道，所述样品分散通道的入口端加工一与芯片一体化的取样探针，所述样品分散通道的末端依次与试样通道的出口端、不互溶相通道的出口端连通，样品分散通道的出口端再与液滴反应和检测通道的入口端连通。本发明提供的微流控浓度梯度液滴生成装置单次注入样品可形成浓度梯度范围大于三个数量级的液滴阵列，样品消耗很少，浓度梯度生成快，特别适合于高通量筛选研究中。

说明书

一、技术领域：

本发明涉及微流控液滴分析领域，特别是涉及一种微流控浓度梯 度液滴生成装置及将其用于基于流动注射梯度和液滴微流控技术的 液滴生成方法。

二、背景技术：

基于液滴的微流控系统是当前微流控领域的重要研究方向和热 点领域。它主要通过微通道网络的设计，在不互溶载液的作用下，将 一相连续的流体分割成非连续的液滴。由于被不互溶相隔离，因此每 个液滴可以看作一个独立的微反应器。基于液滴的微流控系统解决了 基于连续流动的微流控系统中混合速度慢、分析通量低、易引起交叉 污染等问题，并进一步减少了试剂和样品的消耗。另外，微液滴技术 的操作自动化、生成频率高、分析速度快等优点，使其广泛应用于高 通量筛选、单细胞分析、酶动力学测定等方面。

在进行化学和生物学研究中，通常需要配置一系列不同浓度的样 品和试剂溶液，来考察不同浓度试样对实验对象的影响。比如在高通 量药物筛选研究中，为了考察药物对酶或者细胞的作用效率，需要配 置横跨几个数量级浓度的药物溶液。这些溶液一般利用手工或者自动 化液体操作机器人，采用逐级稀释的方法来配置。配置操作过程繁琐、 费时，且需要消耗大量的样品和试剂(微升至毫升级)，因此带来分 析成本高，分析通量低的问题。

目前，在微流控芯片上一般采用T型或者十字型接口进行高通量 液滴的生成。这类方法存在的问题是难以生成具有不同浓度的液滴。 为了生成具有浓度梯度的液滴，Ismagilov研究组通过改变水相通道 中样品、缓冲液和试剂的流速，对液滴内试样组分的浓度进行调节(H. Song，J.D.Tice，R.F.Ismagilov.A microfluidic system for controlling reaction networks in time.Angewandte Chemie-International Edition. 2003.42(7)：768-772)。Damean等人结合微流控层流扩散与液滴生 成技术，自动化生成了具有不同浓度试剂的液滴(N.Damean，L.F. Olguin，F.Hollfelder，C.Abell，WTS Huck.Simultaneous measurement of reactions in microdroplets filled by concentration gradients.Lab On A Chip.2009.9(12)：1707-1713)。Jambovane等人则采用一系列的微阀， 通过调节微阀的开启时间来调节试样注入液滴的体积，从而达到调节 液滴内试样浓度的目的(S.Jambovane，D.J.Kim，E.C.Duin，S.K. Kim，J.W.Hong.Creation of Stepwise Concentration Gradient in Picoliter Droplets for Parallel Reactions of Matrix Metalloproteinase II and IX.Analytical Chemistry.2011.83(9)：3358-3364)。然而，上述几 种方法存在的问题是生成试样浓度的范围太窄，通常在一个到两个数 量级之内，难以满足药物筛选等领域的要求。最近，Theberge等人将 超高效液相色谱结合液滴生成技术来生成不同浓度梯度液滴(A.B. Theberge，G.Whyte，WTS Huck.Generation of Picoliter Droplets with Defined Contents and Concentration Gradients from the Separation of Chemical Mixtures.Analytical Chemistry.2010.82(9)：3449-3453)。这 种方法利用液相色谱分离中试样区带的扩散行为来获得不同浓度的 试样，具有浓度范围宽(2-3个数量级)、试样消耗低等特点。但是 该方法耗时较长(约40分钟)，而且使用了较为昂贵的色谱仪器，不 易普及。此外，色谱分离缓冲液中常用的甲醇或乙腈等有机添加剂对 生物常用的酶或者细胞带来负面影响，限制了其在生化分析中的应 用。

流动注射梯度技术是一种广泛使用的自动化液体处理和分析技 术。它利用精确控制试样区带在连续载液中的物理扩散，结合基于出 峰时间的电子矫正技术，从而获得连续的试样浓度信息。流动注射梯 度技术具有分析时间短，试样消耗低，重现性好等优点。并且载液中 不需要加入对生化分析有害的有机试剂等添加剂，具有较好的生物兼 容性。然而，流动注射梯度技术并没有应用于基于液滴的微流控分析 领域中。

三、发明内容：

本发明提出了一种快速形成具有宽范围连续浓度梯度液滴的方 法及其专用的微流控浓度梯度液滴生成装置，为药物筛选提供一种超 低试样消耗(皮升至纳升级)和超高通量的技术手段。

本发明采用的技术方案是：

一种微流控浓度梯度液滴生成芯片，所述微流控浓度梯度液滴生 成芯片是在玻璃、石英或耐有机溶剂材料加工的芯片基材上加工一条 样品分散通道，一条以上试剂通道，一条以上不互溶相通道，一条液 滴反应和检测通道，所述样品分散通道的入口端加工一与芯片一体化 的取样探针，所述取样探针呈前端尖形，所述取样探针的尖端处加工 有取样通道的入口端，所述取样探针内的取样通道的出口端与样品分 散通道的入口端连通，所述样品分散通道的末端依次与试样通道的出 口端、不互溶相通道的出口端连通，样品分散通道的出口端再与液滴 反应和检测通道的入口端连通；所述液滴反应和检测通道的出口端为 最终出口；

所述取样通道、样品分散通道、试剂通道为亲水性，所述的不互 溶相通道、液滴反应和检测通道及取样探针的外壁表面为疏水性；或 所述取样通道、样品分散通道、试剂通道为疏水性，所述的不互溶相 通道、液滴反应和检测通道及取样探针的外壁表面为亲水性。所述亲 水性或疏水性可采用本领域技术人员公知的亲水化处理方法或疏水 化处理方法达到，这些方法都是常用的，本发明不再赘述。

本发明所述一条以上试剂通道是指试剂通道至少为一条，其具体 条数可根据实际反应需要进行增加，需要加入多少种不同的试剂即可 加工相应条数的试剂通道。

本发明所述一条以上不互溶相通道通道是指不互溶相通道至少 为一条，不互溶相通道的条数可以增加，但为了操作和加工简便，通 常不会多于2条。

所述试剂通道及不互溶相通道的入口端可设置储液池用于储存 液体，或直接利用注射器等驱动设备注入液体。这是本领域技术人员 公知的液体注入方法。

所述试剂通道为2条以上时，不同的试剂通道的出口端应相互靠 近，也就是说，不同的试剂通道的出口端与样品分散通道的末端的交 叉连通口应越接近越好，主要目的是降低额外的稀释或者分散，缩短 分析时间，这是本领域技术人员能够理解并操作的。

所述不互溶相通道为2条以上时，不同的不互溶相通道的出口端 应相互靠近，也就是说，不同的不互溶相通道的出口端与样品分散通 道的末端的交叉连通口应越接近越好，这是本领域技术人员能够理解 并操作的。

本发明所述样品分散通道的末端依次与试样通道的出口端、不互 溶相通道的出口端连通，也就是说，试剂通道与样品分散通道的连通 口位于不互溶相通道与样品分散通道的连通口的靠近样品分散通道 的入口端方向，优选的，所述试样通道的出口端与不互溶相通道的出 口端相互靠近，也就是说，试剂通道与样品分散通道端的连通口与不 互溶相通道与样品分散通道的连通口的位置越接近越好，这是为了降 低样品额外的稀释或者分散，缩短分析时间，这是本领域技术人员应 当能够理解并操作的。通常试剂通道与样品分散通道的连通口和不互 溶相通道与样品分散通道的连通口之间的距离设为1mm以下。

进一步，本发明所述取样通道、样品分散通道、试剂通道、不互 溶相通道、液滴反应和检测通道的宽度范围优选是1微米至1毫米， 所述取样通道、样品分散通道、试剂通道、不互溶相通道、液滴反应 和检测通道的深度范围优选是1微米至1毫米。

所述取样探针的尺寸优选小于5毫米宽×5毫米高×20毫米长。

所述样品分散通道的长度优选为1毫米以上，这是为了保证样 品在经过样品分散通道时，经分散形成足够范围的浓度梯度，本领域 技术人员应该能够根据所需样品溶液的浓度梯度范围来选择合适的 样品分散通道长度。通常可设为1mm～20cm。

所述液滴反应和检测通道的长度应保证在通道内流体的一定流 速下，液滴内的样品与试剂能充分反应，本领域技术人员应当能够根 据实际需要进行选择加工。通常可设为10mm～20cm。

所述试剂通道、不互溶相通道的长度也没有具体的限制，根据基 片基材形状自行设计即可，通常可设为1mm～20cm。

本发明所述的微流控浓度梯度液滴生成芯片是在玻璃、石英或耐 有机溶剂材料加工的芯片基材加工各种通道和取样探针制成，所述加 工方法通常为平板光刻法结合湿法刻蚀技术、干法刻蚀、模塑法、热 压法、LIGA技术、多层光刻-LIGA技术、激光烧蚀法、软刻蚀法等， 这都是本领域技术人员常用的加工微流控芯片的方法，本发明中不再 赘述。

本发明所述样品分散通道、试剂通道、不互溶相通道、液滴反应 和检测通道的形状可以为直线型、弯曲线型或者弯折线型，任意形状 的通道都适用于本发明。

本发明还提供一种微流控浓度梯度液滴生成装置，所述微流控浓 度梯度液滴生成装置包括微流控浓度梯度液滴生成芯片和驱动系统， 所述微流控浓度梯度液滴生成芯片是在玻璃、石英或耐有机溶剂材料 加工的芯片基材上加工一条样品分散通道，一条以上试剂通道，一条 以上不互溶相通道，一条液滴反应和检测通道，所述样品分散通道的 入口端加工一与芯片一体化的取样探针，所述取样探针呈前端尖形， 所述取样探针的尖端处加工有取样通道的入口端，所述取样探针内的 取样通道的出口端与样品分散通道的入口端连通，所述样品分散通道 的末端依次与试样通道的出口端、不互溶相通道的出口端连通，样品 分散通道的出口端再与液滴反应和检测通道的入口端连通；所述液滴 反应和检测通道的出口端为最终出口；

所述取样通道、样品分散通道、试剂通道为亲水性，所述的不互 溶相通道、液滴反应和检测通道及取样探针的外壁表面为疏水性；或 所述取样通道、样品分散通道、试剂通道为疏水性，所述的不互溶相 通道、液滴反应和检测通道及取样探针的外壁表面为亲水性；

所述取样探针内的取样通道、样品分散通道、试剂通道、不互溶 相通道、液滴反应和检测通道通过驱动系统驱动通道内的液体流动。

进一步，所述不互溶相通道采用正压驱动系统，所述取样通道、 样品分散通道、试剂通道、液滴反应和检测通道采用负压驱动系统。

所述正压驱动系统为气压驱动、机械泵驱动或液位差驱动，所述 负压驱动系统为真空驱动、机械泵驱动或液位差驱动。这都是本领域 技术人员公知的微流体驱动方式。

进一步，本发明所述微流控浓度梯度液滴生成装置还包括检测装 置，所述检测系统设于液滴反应和检测通道出口端位置或进行离线检 测。所述检测系统可以采用荧光、化学发光、电化学、紫外-可见吸 收光度等多种检测系统，或将液滴在芯片蜿蜒通道内进行孵育直接用 显微镜进行观察。

本发明还提供利用所述的微流控浓度梯度液滴生成装置来快速 生成具有宽范围连续浓度梯度液滴并进行快速检测的方法，所述方法 利用微流控浓度梯度液滴生成装置，所述装置包括微流控浓度梯度液 滴生成芯片、驱动系统和检测系统，所述微流控浓度梯度液滴生成芯 片是在玻璃、石英或耐有机溶剂材料加工的芯片基材上加工一条样品 分散通道，一条以上试剂通道，一条以上不互溶相通道，一条液滴反 应和检测通道，所述样品分散通道的入口端加工一与芯片一体化的取 样探针，所述取样探针呈前端尖形，所述取样探针的尖端处加工有取 样通道的入口端，所述取样探针内的取样通道的出口端与样品分散通 道的入口端连通，所述样品分散通道的末端依次与试样通道的出口 端、不互溶相通道的出口端连通，样品分散通道的出口端再与液滴反 应和检测通道的入口端连通；所述液滴反应和检测通道的出口端为最 终出口；

所述取样探针内的取样通道、样品分散通道、试剂通道、不互溶相通 道、液滴反应和检测通道通过驱动系统驱动通道内的液体流动；所述 检测系统设于液滴反应和检测通道出口端位置或进行离线检测；

所述方法的操作步骤为：

(1)在驱动系统的作用下，将载液通过取样探针引入并流动充 满微流控浓度梯度液滴生成芯片上的样品分散通道，试剂溶液经试剂 通道入口端引入并流动充满试剂通道，不互溶相经不互溶相通道入口 端引入并流动充满不互溶相通道；所有液体最后都经液滴反应和检测 通道的出口端流出；

(2)将取样探针插入样品液中，在驱动系统的作用下，将一段 皮升至纳升级的样品溶液引入到取样探针的取样通道中；

(3)将取样探针插入载液中，在驱动系统的作用下，载液带动 取样通道中的样品溶液流经样品分散通道内，经轴向对流和分子扩散 后，在载液中分散形成具有较宽范围的浓度梯度；所得较宽范围的浓 度梯度的样品区带在样品分散通道的末端，依次流经试剂通道与样品 分散通道的连通口和不互溶相通道与样品分散通道的连通口，该样品 区带在试剂通道与样品分散通道的连通口与试剂溶液混合，然后流经 不互溶相通道与样品分散通道的连通口，被不互溶相间隔成皮升至纳 升级的具有不同样品浓度的液滴，所得具有不同样品浓度的液滴进入 液滴反应和检测通道，在液滴反应和检测通道内进行反应，然后在液 滴反应和检测通道的出口端用检测系统进行实时检测或将反应后的 液滴引出收集后进行离线检测；

所述样品溶液、载液、试剂溶液相互均为互溶相，所述不互溶相 与样品溶液、载液、试剂溶液均不互溶；

所述样品溶液为亲水性液体时，所述取样通道、样品分散通道、 试剂通道为亲水性，所述的不互溶相通道、液滴反应和检测通道及取 样探针的外壁表面为疏水性；

或所述样品溶液为疏水性液体时，所述取样通道、样品分散通道、 试剂通道为疏水性，所述的不互溶相通道、液滴反应和检测通道及取 样探针的外壁表面为亲水性。

优选的，所述不互溶相通道采用正压驱动系统，所述取样通道、 样品分散通道、试剂通道、液滴反应和检测通道采用负压驱动系统；。 所述正压驱动系统为气压驱动、机械泵驱动或液位差驱动，所述负压 驱动系统为真空驱动、机械泵驱动或液位差驱动。

所述样品分散通道、试剂通道、不互溶相通道、液滴反应和检测 通道内的流速通常为1纳升/分钟～100微升/分钟。

本发明首次结合流动注射梯度技术和液滴技术，将经分散的样品 区带隔离至皮升至纳升级的液滴中，形成具有大于三个数量级浓度梯 度的液滴阵列，克服了现有液滴系统中难以形成较宽连续浓度梯度的 缺点，为基于液滴的高通量筛选分析提供了一种有效的技术手段。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.单次注入样品可形成浓度梯度范围大于三个数量级的液滴阵 列，浓度梯度生成快，特别适合于高通量筛选研究中。

2.单次分析的样品体积消耗在皮升至纳升级，显著地降低了样 品消耗和分析成本。

3.形成的浓度梯度范围大于三个数量级，将样品引入、样品分 散与梯度形成、试剂注入、液滴形成、液滴内混合和液滴内反应集成 在一块芯片上，大大地提高了系统的集成化水平。

4.结合自动化的样品引入系统，可实现对不同样品的自动化引 入和梯度生成。

四、附图说明：

图1是实施例1的微流控浓度梯度液滴生成芯片俯视图。

图2是实施例1中浓度梯度液滴的生成方法和过程示意图。

图3是实施例1的微流控浓度梯度液滴生成芯片生成具有范围连 续浓度梯度荧光素钠液滴对应的信号记录图。

图4是实施例2中利用微流控浓度梯度液滴生成芯片进行酶抑制 分析的酶反应产物荧光信号记录图。

图5是实施例2中经浓度校正后得到的酶抑制曲线图。

五、具体实施方式：

下面以具体实施例来对本发明做进一步说明，但本发明的保护范 围不限于此。

实施例1

图1是根据本发明所建立的基于流动注射梯度技术的微流控浓 度梯度液滴生成芯片俯视图。通过微加工的方法在芯片基材1上加工 了取样探针2、样品分散通道3、试剂通道6和试剂通道7、两条不 互溶相通道9、液滴反应和检测通道10。所述样品分散通道3的入口 端设有取样探针2，所述样品分散通道3的末端依次与试样通道6和 7的出口端、不互溶相通道9的出口端连通，样品分散通道3的出口 端再与液滴反应和检测通道10的入口端连通。试剂通道6的出口端 和试剂通道7的出口端分列于样品分散通道3末端同一横截面位置的 两侧与样品分散通道3交叉连通，两条不互溶通道9的出口端也分列 于样品分散通道3末端同一横截面位置的两侧与样品分散通道3交叉 连通。

在芯片使用前，要对样品分散通道3、试剂通道6和7、不互溶 相通道9、液滴反应和检测通道10及取样探针2的外壁表面进行憎 水化或亲水化处理。

现结合图1和图2对浓度梯度液滴的生成方法和过程进行进一步 说明。

将样品分散通道内预充满载液13，以及用于驱动不互溶相用的 两个注射器内充满不互溶相16并与不互溶相通道9的入口端8相连 提供正压驱动，使不互溶相通道9内充满不互溶相16。用于吸液的 注射器则装入少量载液并与液滴反应和检测通道10的出口端11相连 提供负压驱动。在试剂通道6的入口端4加入试剂14，充满试剂通 道6，试剂通道7的入口端5加入试剂15，充满试剂通道7。

取样探针2引入一段皮升至纳升级的样品溶液12至取样探针的 取样通道中，再流经样品分散通道3(图2(A))；在样品溶液12 随载液13流动的过程中，经轴向的对流和分子扩散后，在载液13中 分散形成具有一定浓度梯度的样品溶液12区带(图2(B))；样品 溶液12区带在样品分散通道3和试剂通道6、7的交叉连通口处与试 剂14、15混合；再流经样品分散通道3与不互溶相通道9的交叉连 通口，在不互溶相16的作用下，被间隔成皮升至纳升级的具有不同 样品浓度的液滴18，并进入液滴反应和检测通道10(图2(C))。

更具体的，实施例1中采用玻璃为芯片基材1，其上用平板光刻 法结合湿法刻蚀的微加工的方法上加工了取样探针2、样品分散通道 3、试剂通道6和试剂通道7、两条不互溶相通道9、液滴反应和检测 通道10。取样探针2长6mm，尖端直径为200μm，末端直径为2mm。 样品分散通道3、试剂通道6和试剂通道7长度均为6.3cm，两条不 互溶相通道9长度均为4.3cm，液滴反应和检测通道10长为10.5cm， 试剂通道与样品分散通道的连通口和不互溶相通道与样品分散通道 的连通口之间的距离为1mm。所有通道宽度皆为150μm、深度为30 μm。

在芯片使用前，要对样品分散通道3、试剂通道6和7、不互溶 相通道9、液滴反应和检测通道10及取样探针2的外壁表面进行憎 水化或亲水化处理。例如，样品和载液为亲水性时，玻璃芯片的不互 溶相通道9、液滴反应和检测通道10及取样探针2的外壁表面要进 行疏水化处理。具体处理方法如下所述：用2％浓度的十八烷基三氯 硅烷甲苯溶液处理不互溶相通道9、液滴反应和检测通道10及取样 探针2的外壁表面约10min，再依次用甲苯、甲醇和水清洗通道各5 min。

图3是上述尺寸芯片，以荧光素钠溶液为模型样品，通过引入 16纳升样品溶液，生成具有连续浓度梯度荧光素钠液滴对应的信号 记录图。

具体的，以10mM三羟甲基氨基甲烷溶液(pH7.3)为载液，1mM 的荧光素钠溶液为样品溶液，以十四烷为不互溶相，试剂入口4和5 中均加入10mM三羟甲基氨基甲烷溶液。

具体操作为：将取样探针2插入装有载液10mM三羟甲基氨基 甲烷溶液中，使样品分散通道3内预充满载液10mM三羟甲基氨基 甲烷溶液。将用于驱动不互溶相用的两个注射器内充满不互溶相十四 烷并与不互溶相通道9的入口端8相连提供正压驱动，将不互溶相十 四烷注入不互溶相通道9内，使不互溶相通道9内充满不互溶相十四 烷。用于吸液的注射器则装入少量载液10mM三羟甲基氨基甲烷溶 液并与液滴反应和检测通道10的出口端11相连提供负压驱动。此时， 在不互溶相剪切力的作用下，载液在十字交叉口处被连续分割成油包 水型液滴，进入液滴反应和检测通道10中。控制样品分散通道3流 体流速为0.32μL/min，试剂通道6和7流体流速为0.29μL/min，不 互溶相通道9流体流速为0.35μL/min，液滴反应和检测通道流体流 速为1.6μL/min。

取样探针2插入1mM的荧光素钠溶液中并停留3s，引入一段 16纳升的荧光素钠溶液至取样探针的取样通道中，再流经样品分散 通道3(图2A)。样品荧光素钠溶液在样品分散通道3中，经轴向 的对流和分子扩散后，在载液中分散形成具有一定浓度梯度的样品溶 液区带(图2B)；然后流经样品分散通道3与不互溶相通道9的交 叉连通口，被不互溶相间隔具有不同样品浓度的液滴，并进入液滴反 应和检测通道10(图2C)。

在液滴反应和检测通道10的末端采用共聚焦型激光诱导荧光检 测器，检测液滴的荧光信号，所得荧光信号记录图如图3所示。每个 液滴检测信号为一个单峰，由峰高可计算出液滴中的荧光素钠浓度。 图3中最高峰所对应液滴的荧光素钠浓度为67.5μM，最低处液滴内 荧光素钠的浓度为15.6nM，即所生成的液滴浓度梯度范围为3-4个 数量级。

实施例2

图4是采用实施例1的芯片，以β-半乳糖苷酶抑制剂2-苯乙基 -β-D-硫代半乳糖苷(PETG)溶液为样品的酶抑制分析结果记录图。

具体的，以10mM三羟甲基氨基甲烷溶液(pH7.3)为载液，PETG 溶液为样品溶液，采用β-半乳糖苷酶溶液和底物FDG溶液与样品进 行反应，以十四烷为不互溶相。

具体操作为：将取样探针2插入装有载液10mM三羟甲基氨基 甲烷(pH7.3)溶液中，将样品分散通道内预充满载液。将用于驱动 不互溶相用的两个注射器内充满不互溶相十四烷并与不互溶相通道9 的入口端8相连提供正压驱动，将不互溶相十四烷注入不互溶相通道 9内，使不互溶相通道9内充满不互溶相十四烷。用于吸液的注射器 则装入少量载液10mM三羟甲基氨基甲烷溶液(pH7.3)并与液滴反 应和检测通道10的出口端11相连提供负压驱动。在试剂通道6的入 口端4加入浓度为0.125mg/mL的β-半乳糖苷酶溶液，在液滴反应和 检测通道10的出口端11的注射器的负压驱动下充满试剂通道6，试 剂通道7的入口端5加入200μM浓度的底物FDG溶液，在液滴反 应和检测通道10的出口端11的注射器的负压驱动下充满试剂通道7。

液滴反应和检测通道10的出口端11用注射器吸液，驱动样品随 载液流动，以及试剂在试剂通道内的流动。不互溶相则通过不互溶相 通道9的入口端8的注射器注入不互溶相，驱动不互溶相的流动。控 制样品分散通道3流体流速为0.32μL/min，试剂通道6和7流体流 速为0.29μL/min，不互溶相通道9流体流速为0.35μL/min，液滴反 应和检测通道流体流速为1.6μL/min。

将取样探针2插入1.25mM的PETG溶液并在溶液中停留3s， 引入一段16纳升的PETG溶液至取样探针的取样通道中，再流经样 品分散通道3(图2A)。样品PETG溶液在样品分散通道3中，经 轴向的对流和分子扩散后，在载液中分散形成具有一定浓度梯度的样 品溶液区带(图2B)，然后在样品分散通道3的末端与和试剂通道 6、7的交叉连通口处，与β-半乳糖苷酶溶液和底物FDG溶液混合， 再流经样品分散通道3与不互溶相通道9的交叉连通口，被不互溶相 间隔形成具有不同抑制剂浓度而酶和底物浓度相同的液滴。液滴在液 滴反应和检测通道10中混合、反应(图2C)，反应产物的荧光信 号设于液滴反应和检测通道10的末端的共聚焦型激光诱导荧光检测 器检测，所得检测信号记录图如图4所示。检测结果记录图中每一个 峰对应一个液滴的酶反应信号，由于液滴中的抑制剂浓度不同，酶反 应所产生的信号也不同。

图5是利用图4的实验结果绘制的抑制率(PI％)-抑制剂浓度关 系图。抑制率由下式计算

$\mathrm{PI}(\%)=(1-\frac{S_i-S_b}{S_0-S_b})\times 100\%$

其中，PI％(percent inhibition％)为抑制率；S_b为背景信号强度； S₀为无抑制剂时酶与底物反应的信号强度；S_i为有抑制剂时酶与底物 反应的信号强度。液滴的抑制剂浓度由流动注射梯度分析中常用的梯 度校正计算出。梯度校正步骤为：首先，将10nM-80μM的荧光素钠 溶液依次引入芯片微通道，测定信号强度，并绘制荧光信号强度-浓 度的标准曲线；其次，在与酶抑制分析相同的条件下注射相同体积的 1.0mM的荧光素钠样品，记录荧光信号-时间图。根据上述标准曲线 计算每个液滴信号对应的荧光素钠浓度。液滴的相对时间定义为该液 滴流经检测点时的时间(即步骤2中液滴的检测时间点)与流动注射 峰信号最高点对应的检测时间的差值，即t-t_max；然后，根据 计算液滴中的荧光素钠扩散系数(D_t-tmax表示的意义为：

当相对时间为t-t_max时液滴中的荧光素钠相对于原始浓度的稀释倍 数，C₀为荧光素钠的原始浓度(1.0mM)，C_t-tmax表示相对时间为t-t_max对应的液滴中荧光素钠的浓度)，绘制扩散系数-相对时间关系图；根 据扩散系数-相对时间关系图计算酶抑制分析液滴中抑制剂的浓度。 再根据抑制率计算公式计算每个液滴的抑制率，作抑制率(PI％)对 应抑制剂浓度关系图。