组织因子向活化的血小板的靶向

摘要

本发明涉及促凝血融合蛋白、编码所述融合蛋白的多核苷酸和表达所述融合蛋白的细胞。此外，本发明涉及用作药物的融合蛋白。使用本发明的融合蛋白，可以治疗具有凝血病（诸如具有或没有抑制剂的A型和B型血友病）的个体。

说明书

技术领域

本发明涉及促凝血融合蛋白、编码所述促凝血融合蛋白的多核苷酸、表达所述促凝血融合蛋白的细胞以及它们的应用。

背景技术

组织因子(TF)（一种跨膜糖蛋白）是血液凝固的主要细胞引发剂。它主要在内皮下细胞（诸如平滑肌细胞和成纤维细胞）的表面上表达，并在内皮的完整性被破坏时（诸如当血管被切断时），结合酶原凝血因子VII (FVII)和活化形式因子VIIa (FVIIa)。当TF结合FVII时，它促进FVII活化为FVIIa。TF也极大地增强因子VIIa对它的生理底物（因子IX和X）的蛋白水解活性。FVIIa在溶液中保持酶原样状态，作为相对较差的酶起作用。TF会为最佳大分子外部相互作用提供支架，包括FVIIa的蛋白酶结构域的构象变化，导致它的活性部位的成熟，并使FVIIa定位在细胞表面上实现最佳底物相互作用。这些效应一起导致FVIIa的催化能力增加了几个数量级。因此，在传统上称作血液凝固的外源性途径的起始复合物中，TF是FVIIa的辅因子。随后的凝血连锁步骤最终导致纤维蛋白聚合物的形成，所述纤维蛋白聚合物被活化的血小板结合，并与FXIIIa交联。

血小板（也称作凝血细胞）源自它们的细胞前体巨核细胞。当内皮未受损时，正常的静止血小板在血液循环中自由流动。当单层内皮障碍受损时，静止血小板借助于糖蛋白(GP)受体粘附至内皮下结构。例如，GPIaIIa和GPVI会结合胶原；GPIcIIa会结合纤连蛋白；GPIc*IIa会结合层粘连蛋白，且GPIb-V-IX会结合von Willebrand因子(vWF)聚合物。血小板以此方式的粘附，会造成它们改变形状，并释放它们的α颗粒和致密颗粒。这又导致过量的其它糖蛋白血小板受体（诸如GPIIbIIIa (其结合纤维蛋白原/纤维蛋白)和TREM-样转录物1 (TLT-1)）的暴露；以及下述物质的释放：凝血因子I (纤维蛋白原)、V和XI；其它促凝血剂诸如ADP、Ca²⁺、血清素和血小板因子3/4；抗凝剂诸如组织因子途径抑制剂(TFPI)；和化合物诸如血小板衍生的生长因子(PDGF)，它是血小板补充和愈合所必需的。活化的血小板彼此结合，并在快速反应中交联纤维蛋白，例如通过GPIIbIIIa受体复合物。

因此，活化的血小板和凝血连锁的纤维蛋白聚合物产物一起形成血块。凝血的血小板聚集被称作初级止血反应，而凝血连锁反应被称作次级止血反应。尽管在初级止血反应过程中产生纤维蛋白，通过所谓的凝血起始(独立于FIX/FVIIIa)，在该时点产生的量对于强凝聚胶是不足的。最初的纤维蛋白用作活化的血小板在损伤部位处的聚集物，后者又为活化的凝血因子的功能提供最佳的细胞表面。

在具有凝血病的受试者中，诸如在具有A型和B型血友病的人中，由于例如不存在凝血因子或凝血因子存在不足，使得凝血连锁的不同步骤出现功能障碍。一部分凝血的这种功能障碍导致血液凝固不足和可能威胁生命的出血。

本发明的一个目的是，提供适合用作这样的受试者的促凝血药的化合物。本发明的第二个目的是，提供这样的化合物：其能够改变血液凝固的物理起点，使得外源性凝血不唯一地依赖于内皮下的细胞-结合的组织因子。本发明的第三个目的是，提供这样的化合物：其在生理上合适的微环境中上调血液凝固。本发明的第四个目的是，将可溶性的组织因子或其生物学功能片段或变体引导至活化的血小板的表面。本发明的另一个目的是，增加内源因子VIIa对它的生理底物（因子IX和X）的蛋白水解活性。因而，该目的是，使得在位于血管内或血管外的活化的血小板的表面上能够起始血液凝固。这是除了正常的且唯一的内皮下的（通常血管外的）血液凝固起始之外的血液凝固起始。

WO06/096828 公开了包含可溶性的组织因子(sTF)和磷脂酰丝氨酸(PS)结合域（诸如膜联蛋白V）的嵌合蛋白。PS暴露于活化的细胞（诸如单核细胞、内皮细胞和发生细胞凋亡的细胞）的表面上，以及活化的血小板和静止的血小板上。所述嵌合蛋白是促凝剂和抗凝剂；后者是因为下述事实：即在更高的剂量，构建体与凝血因子竞争结合活化的血小板上的PS。因而，WO06/096828的嵌合蛋白具有与本文所述的融合蛋白不同的性质集合。

发明内容

本发明提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含：(i)至少一种组织因子多肽或其生物学功能变体或片段，其共价地连接至(ii)配体，所述配体能够结合(iii)受体和/或其片段，其中所述受体仅在活化的血小板的表面上表达。所述融合蛋白/构建体可以包含：(i)组织因子或其生物学功能变体或片段，和(ii)配体，所述配体结合(iii) TLT-1。根据本发明，(ii)可以是单克隆抗体或单克隆抗体的抗原结合部分。例如，(ii)可以选自：Fab片段、F(ab')₂片段、Fab’片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段或分离的互补性决定区(CDR)。根据本发明，(ii)可以包含0012 (2F105) LC的可变结构域。根据本发明，(ii)可以包含0012 (或者称作2F105) LC的可变结构域以及人LC的恒定区κ和HPC4标签(pTT-0012LC.HPC4，也称作pTT-2F105LC.HPC4)。

本发明的融合蛋白/构建体如下靶向血小板-凝块生长的起始期：通过活化的血小板的特异性靶向，同时并存地将静止或基础血小板（resting or basal platelets）直接募集至损伤部位，从而全身地活化所述静止或基础血小板。本发明的组合物是基于当血小板不再静止但是处于被活化过程中时出现在血小板膜上的特定受体和组分表位的鉴别。

本发明也提供了下述的：分离的核苷酸序列，其编码根据本发明的任意融合蛋白/构建体；载体，其包含分离的核苷酸序列，后者又编码根据本发明的任意融合蛋白/构建体；分离的细胞，其包含编码本发明的任意融合蛋白/构建体的核苷酸序列。所述核苷酸序列又可以由细胞内载体表达。所述分离的细胞可以是真核细胞，诸如哺乳动物细胞，诸如BHK或CHO或HEK细胞。

此外，本发明提供了一种使组织因子靶向活化的血小板的表面的方法，所述方法包括：使活化的血小板接触任意构建体，所述构建体包含：(i)组织因子或其功能变体，和(ii)配体，所述配体能够结合(iii)在活化的血小板上存在的受体，诸如TLT-1。以此方式，本发明也涉及一种上调在活化的血小板的表面上的FX活化的方法，其中所述方法包括：在有FX同时存在下，使活化的血小板接触所述构建体。

类似地，本发明涉及用作药物和用于治疗凝血病的融合蛋白。在一个实施方案中，将治疗有效量的所述构建体肠胃外地（诸如静脉内地或皮下地）施用给有此需要的个体。这样的有需要的个体可能具有任意先天性的、获得性的和/或医源性的凝血病。

附图说明

图1：人TLT-1 核苷酸和氨基酸序列。在图1中，显示了表示hTLT-1的核苷酸序列和氨基酸序列。在这里，核苷酸序列位置1-45编码预测的信号肽，在位置46-486处的核苷酸序列编码hTLT-1的胞外结构域，核苷酸序列位置487-555编码跨膜区，且在位置556-933处的核苷酸序列编码hTLT-1的细胞内结构域。

图2：表示含有C-端His-6标签的人TLT-1的胞外结构域的核苷酸和氨基酸序列。在图2中，显示了表示具有C-端His标签的hTLT-1的胞外结构域的核苷酸序列和氨基酸序列。在这里，标有下划线的序列(7-15)指示kozak序列的位置，在位置16-60处的核苷酸序列编码预测的信号肽，在位置61-501处的核苷酸序列编码hTLT-1的胞外结构域，在位置502-519处的核苷酸序列编码6xHis标签(粗体)。也显示了限制性酶位点HindIII (在位置1-6处的核苷酸序列)和EcoRI (在位置523-528处的核苷酸序列)，用星号标记终止密码子(520-522)。

图3：0012LC和0012HC的可变结构域，包括Kabat编号：

A) 0012LC的可变结构域

B) 0012LC的可变结构域- Kabat编号

C) 0012HC的可变结构域

D) 0012HC的可变结构域- Kabat编号。

在图3A中，在位置1-57处的核苷酸序列编码LC信号肽序列；在位置58-396处的核苷酸序列编码0012LC的可变结构域。在图3B中，用粗体和灰色显示的序列表示根据Kabat编号的0012LC CDR位置。在图3C中，在位置1-54处的核苷酸序列编码0012HC信号肽，在位置55-396处的核苷酸序列编码0012HC的可变结构域。在图3D中，用粗体和灰色显示的序列表示根据Kabat编号的0012HC CDR位置。

图4: 0012LC的可变结构域以及人LC的恒定区κ和HPC4标签(由pTT-0012LC.HPC4编码)。在图4中，在位置1-57处的核苷酸序列编码LC信号肽，核苷酸序列58-396编码0012LC的可变结构域，核苷酸序列397-714编码人0012LC的恒定区κ，且核苷酸序列715-750编码HPC4标签。

图5: 0012HC的可变结构域以及人IgG4的恒定区(pTT-0012HC)。在图5中，核苷酸序列1-54编码HC信号肽，核苷酸序列55-396编码0012HC的可变结构域，且核苷酸序列397-1377编码人IgG4的恒定区(粗体)。

图6: 0012V_H-CH1-L4a-hTF.1-219的核苷酸序列和氨基酸序列，由pTT-0012V_H-CH1-L4a-hTF.1-219编码。所述pTT-0012V_H-CH1-L4a-hTF.1-219 构建体编码Gly-Ser连接物L4a和人组织因子的胞外结构域AA 1-219。在这里，在位置1-54处的核苷酸序列编码预测的信号肽，在位置55-396处的核苷酸序列编码0012HC的可变结构域，在位置397-699 (粗体)处的核苷酸序列编码人IgG4 CH₁ 恒定区，在位置700-750 (下划线)处的核苷酸序列编码Gly-Ser连接物（命名为L4a），在位置701-1407处的核苷酸序列编码人组织因子的胞外结构域(氨基酸1-219，标有虚线的序列)。0012V_H-CH1-L4a-hTF.1-219 氨基酸序列由SEQ ID no. 51 (0012VH-VH1)、SEQ ID no. 61 (L4a)和SEQ ID no. 14 (hTF.1-219)组成。

图7: 因子VIIa活性的刺激。图7中的数据证实，使用Fab-hTF.1-219和mAb-hTF.1-219 融合蛋白得到了与使用未融合的hTF.1-219类似的FVIIa酰胺分解活性的浓度-依赖性的刺激。这表明，TF与Fab或mAb片段的连接没有影响FVIIa与TF-融合蛋白的TF组分的结合。

图8: 通过FACS分析测定蛋白ID no. 0010和0011与活化的血小板的结合。通过抗-HPC4标签(图8A)或抗-LC抗体(图8B)进行检测。

图9: 图9A显示了在没有或有血小板存在下i) 0.03 nM Innovin^?、ii) 10 nM sTF、iii) 10 nM 0011 Fab-hTF.1-219、iv) 10 nM 0010 Fab抗-TLT-1抗体或v) 10 nM 0012 mAb抗-TLT-1抗体对FVIIa-介导的FX活化的影响。图9B显示了在该试验中用酶原rFVII替换rFVIIa的影响。

图10: 图10A中的数据表明，10 nM 0011 Fab-hTF.1-219与TLT-1受体的结合会特异性地刺激活化的血小板上的FVIIa-介导的FX活化，对于静止血小板则不会。刺激随着活化的血小板的数目而增加，并在EC₅₀ ≈12.000 血小板/μl时饱和。图10B对比了图10A中的结果和用0.1 nM膜联蛋白V - hTF.1-219 融合蛋白(AV- hTF.1-219)得到的结果。图10B表明，AV-hTF.1-219与血小板磷脂的结合会刺激活化的和静止的血小板上的FX活化。使用静止血小板观察到FX活化的显著刺激，其在测试的最大血小板数目超过在相同数目的活化的血小板的表面上的Fxa产生。图10B清楚地表明，AV-TF不能用于选择性地增加活化的血小板上的Fxa产生。

图11: 图11中的数据显示了由10 nM Fab-hTF.1-219 融合蛋白对活化的血小板上的FX活化的刺激的FVIIa/FVII浓度依赖性。将0020 Fab-hTF.1-219对活化的血小板的作用与0094 Fab-hTF.1-219 同种型融合蛋白的作用相对比，后者不结合TLT-1，但是结合未融合的hTF.1-219。也显示了0020 Fab-hTF.1-219对静止血小板的作用的对比。使用FVIIa和FVII在所有浓度得到类似的刺激，表明TF-融合蛋白会介导活化的血小板上的FVII有效反馈活化，且该刺激在FVII/FVIIa的生理浓度是最佳的。在TLT-1靶向以后，诱导了显著的刺激，使用非靶向的hTF.1-219衍生物则没有。

图12: 图12中的数据显示了由不同浓度的Fab-hTF.1-219 融合蛋白对活化的血小板上10 nM FVIIa/FVII介导的FX活化的刺激。将0070 Fab-hTF.1-219对活化的血小板的作用与0094 Fab-hTF.1-219 同种型融合蛋白的作用相对比，后者不结合TLT-1，但是结合未融合的hTF.1-219。0070 Fab-hTF.1-219在宽浓度范围内显著刺激FX活化，其机理需要靶向TLT-1，如通过与未结合对照的对比所指示的。

图13: 图13中的数据显示了由不同浓度的Fab-hTF.1-219 融合蛋白对TLT-1富集的磷脂上0.1 nM FVIIa/FVII介导的FX活化的刺激。将0070 Fab-hTF.1-219的作用与0094 Fab-hTF.1-219 同种型融合蛋白的作用相对比，后者不结合TLT-1，但是结合未融合的hTF.1-219。0070 Fab-hTF.1-219在宽浓度范围内显著刺激FX活化，其机理需要靶向TLT-1，如通过与未结合对照的对比所指示的。

图14: 图14显示了由0070 Fab-hTF.1-219 融合蛋白介导的对“血友病样”人全血(HWB)中的纤维蛋白凝块形成的刺激。图14A显示了在加入HWB（通过加入针对人FVIII的抗体形成“血友病样”）中的不同浓度(0、0.1、0.2、1.0和10 nM)的0070 Fab-hTF.1-219 融合蛋白所测得的凝块形成的TEG迹线。FVIII抗体显著减小凝血时间，增加的0070 Fab-hTF.1-219 浓度急剧恢复FVIII抗体的作用。图14B显示了图14A中的TEG迹线的R时间，并将0070 Fab-hTF.1-219的R时间与0094 Fab-hTF.1-219同种型融合蛋白和hTF.1-219（与相同供体平行地运行）得到的R时间相对比。0070 Fab-hTF.1-219显著地刺激“血友病样”HWB的凝块形成，其机理需要靶向TLT-1，如通过与未结合对照的对比所指示的。

图15: 表明，与不相关的FAb-TF-构建体相比，TLT1-FAb-TF会减少血友病小鼠（在诱导出血之前2分钟，输入人血小板）的尾部出血失血。

图16: 在有和没有0023存在下HX分析的TLT-1肽的序列覆盖。在HX分析的肽(显示为水平条)的上面显示了基本序列(使用成熟的编号)。用白色表示在有和没有0023存在下显示出类似的交换模式的肽，用黑色表示在0023结合以后表现出减少的氘掺入的肽。

图17: 在有和没有0051存在下HX分析的TLT-1肽的序列覆盖。在HX分析的肽(显示为水平条)的上面显示了基本序列(使用成熟的编号)。用白色表示在有和没有0051存在下显示出类似的交换模式的肽，用黑色表示在0051结合以后表现出减少的氘掺入的肽。

图18: 在有和没有0062存在下HX分析的TLT-1肽的序列覆盖。在HX分析的肽(显示为水平条)的上面显示了基本序列(使用成熟的编号)。用白色表示在有和没有0062存在下显示出类似的交换模式的肽，用黑色表示在0062结合以后表现出减少的氘掺入的肽。

图19: 在有和没有0061存在下HX分析的TLT-1肽的序列覆盖。在HX分析的肽(显示为水平条)的上面显示了基本序列(使用成熟的编号)。用白色表示在有和没有0061存在下显示出类似的交换模式的肽，用黑色表示在0061结合以后表现出减少的氘掺入的肽。

图20：HX分析的TLT-1区域126-162的肽的序列覆盖。在HX分析的肽(显示为水平条)的上面显示了基本序列(使用成熟的编号)。所有肽在0061结合以后表现出减少的氘掺入。

图21: 表达载体pTT的质粒图谱。可以将DNA片段插入HindIII和EcoRI限制性酶位点。

图22: 表达载体pTT-hIgG4的质粒图谱。所述表达载体含有人IgG4 CH1-铰链-CH2-CH3 DNA序列。可以将编码V_H的DNA序列插入HinDIII和NheI限制性酶位点，产生完整的HC编码质粒。

图23: 表达载体pTT-hCLκ的质粒图谱。所述表达载体含有编码人LC的恒定区κ（命名为hCLκ）的DNA序列。可以将编码V_L的DNA序列插入HinDIII和BsiWI限制性酶位点，产生完整的LC编码质粒。

图24: 表达载体pTT-L4a-hTF.1-219的质粒图谱。所述表达载体含有编码17个氨基酸长的Gly-Ser连接物和人TF.1-219的DNA序列。可以将编码HC、LC或V_H-CH1的DNA序列插入HinDIII和BamHI限制性酶位点，产生编码HC-L4a-hTF.1-219、LC-L4a-hTF.1-219或V_H-CH1-L4a-hTF.1-219的质粒。

图25: 表达载体pTT-hTF.1-219-L4b的质粒图谱。所述表达载体含有编码人TF.1-219和17个氨基酸长的Gly-Ser连接物的DNA序列。可以将编码HC、LC或V_H-CH1的DNA序列插入BamHI和EcoRI限制性酶位点，产生编码hTF.1-219-L4b-HC、hTF.1-219-L4b-LC或hTF.1-219-L4b-V_H-CH1 的质粒。

图26: mAb-LC-hTF.1-219和Fab-LC-hTF.1-219 构建体的方案。抗体组分的标准表示如下：VL、CL、VH、CH1、CH2和CH3。组织因子的纤连蛋白III结构域被表示为Fbn-III。

图27: 通过测量FVII/FVIIa-介导的在i)活化的血小板和ii) TLT-1富集的磷脂上的FX活化，筛选TF-融合蛋白促凝剂活性。如在实施例37中所述，在来自各个人供体的血小板上，刺激活化的血小板的FX活化。总是包括使用0020 Fab-hTF.1-219得到的刺激，并设定为100%。如在实施例40中所述，使用0.1 nM FVII/FVIIa和10 nM Fab融合蛋白或1.0 nM mAB融合蛋白，刺激TLT-1富集的磷脂的FX活化。总是包括使用0020 Fab-hTF.1-219 得到的刺激，并设定为100%。

图27A列出了在mAb-TF融合蛋白上的数据，图27B列出了在Fab-TF融合蛋白上的数据。也显示了0020 Fab-hTF.1-219对静止血小板的数据和使用未结合的同种型抗体的结果。

序列

序列如下：

SEQ ID NO: 1提供了人(h)TLT-1的核苷酸序列。

SEQ ID NO: 2提供了hTLT-1的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 3提供了hTLT-1-His6的胞外结构域的核苷酸序列。

SEQ ID NO: 4提供了hTLT-1-His6的胞外结构域的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 5-8提供了hTLT-1片段：hTLT-1.20-125、hTLT-1.16-162、hTLT-1.126-162和hTLT-1.129-142的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 9提供了mAb 0012 (2F105) LC的可变结构域的核苷酸序列。

SEQ ID NO: 10提供了mAb 0012 (2F105) LC的可变结构域的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 11提供了0012 (2F105) HC的可变结构域的核苷酸序列。

SEQ ID NO: 12提供了0012 (2F105) HC的可变结构域的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 13提供了hTF.1-219的核酸序列。

SEQ ID NO: 14提供了hTF.1-219的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 15提供了人组织因子的核酸序列。

SEQ ID NO: 16提供了人组织因子的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 17提供了mAb 0012的重链的核苷酸序列。

SEQ ID NO: 18提供了mAb 0012和Fab 0012的轻链的核苷酸序列。

SEQ ID NO: 19提供了mAb 0023的重链的核苷酸序列。

SEQ ID NO: 20提供了mAb 0023和Fab 0023的轻链的核苷酸序列。

SEQ ID NO: 21提供了mAb 0051的重链的核苷酸序列。

SEQ ID NO: 22提供了mAb 0051和Fab 0051的轻链的核苷酸序列。

SEQ ID NO: 23提供了mAb 0052的重链的核苷酸序列。

SEQ ID NO: 24提供了mAb 0062的重链的核苷酸序列。

SEQ ID NO: 25提供了mAb 0052、Fab 0052和mAb 0062的轻链的核苷酸序列。

SEQ ID NO: 26提供了mAb 0061的重链的核苷酸序列。

SEQ ID NO: 27提供了mAb 0082的重链的核苷酸序列。

SEQ ID NO: 28提供了mAb 0061、Fab 0061、mAb 0082和Fab 0082的轻链的核苷酸序列。

SEQ ID NO: 29提供了Fab 0012 VH-CH1的核苷酸序列。

SEQ ID NO: 30提供了Fab 0023 VH-CH1的核苷酸序列。

SEQ ID NO: 31提供了Fab 0051 VH-CH1的核苷酸序列。

SEQ ID NO: 32提供了Fab 0052 VH-CH1的核苷酸序列。

SEQ ID NO: 33提供了Fab 0061 VH-CH1的核苷酸序列。

SEQ ID NO: 34提供了Fab 0082 VH-CH1的核苷酸序列。

SEQ ID NO: 35提供了Fab AP-3 VH-VH1的核苷酸序列。

SEQ ID NO: 36提供了Fab AP-3 LC的核苷酸序列。

SEQ ID NO: 37提供了Fab-AP-3 LC.C34S的核苷酸序列。

SEQ ID NO: 38提供了hIgG4 铰链-CH2-CH3的核苷酸序列。

SEQ ID NO: 39提供了mAb 0012 HC (小鼠VH-人IgG4 CH1-CH2-CH3)的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 40提供了mAb 0012 LC (小鼠VL - 人κCL)和Fab 0012 LC (小鼠VL - 人κCL)的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 41提供了mAb 0023 HC (小鼠VH-人IgG4 CH1-CH2-CH3)的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 42提供了mAb 0023 LC (小鼠VL - 人κCL)和Fab 0023 LC (小鼠VL - 人κCL)的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 43提供了mAb 0051 HC (小鼠VH-人IgG4 CH1-CH2-CH3)的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 44提供了mAb 0051 LC (小鼠VL - 人κCL)和Fab 0051 LC (小鼠VL - 人κCL)的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 45提供了mAb 0052 HC (小鼠VH-人IgG4 CH1-CH2-CH3)的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 46提供了mAb 0052 LC (小鼠VL - 人κCL)、Fab 0052 LC (小鼠VL - 人κCL)、mAb 0062 LC (小鼠VL - 人κCL)的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 47提供了mAb 0061 HC (小鼠VH-人IgG4 CH1-CH2-CH3)的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 48提供了mAb 0061 LC (小鼠VL - 人κCL)、Fab 0061 LC (小鼠VL - 人κCL)和mAb 0082 LC (小鼠VL - 人κCL)、Fab 0082 LC (小鼠VL - 人κCL)的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 49提供了mAb 0062 HC (小鼠VH-人IgG4 CH1-CH2-CH3)的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 50提供了mAb 0082 HC (小鼠VH-人IgG4 CH1-CH2-CH3)的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 51提供了Fab 0012、小鼠VH - 人IgG4 CH1的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 52提供了Fab 0023、小鼠VH - 人IgG4 CH1的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 53提供了Fab 0051、小鼠VH - 人IgG4 CH1的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 54提供了Fab 0052、小鼠VH - 人IgG4 CH1的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 55提供了Fab 0082、小鼠VH - 人IgG4 CH1的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 56提供了Fab AP-3、小鼠VH - 人IgG4 CH1的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 57提供了Fab AP-3 LC (小鼠VL - 人κCL)的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 58提供了Fab AP-3.LC.C34S LC (小鼠VL - 人κCL)的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 59-68提供了任选的连接物L2-L10的氨基酸序列。任选的连接物被编号，并列于表1中。

SEQ ID NO: 69提供了纯化标签HPC4的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 70-155提供了在开发实施例4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、18、19、20、24、25所述的表达构建体的过程中使用的引物的核酸序列。

SEQ ID NO: 156提供了Fab 0061 VH-CH1的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 157提供了hIgG4-铰链-CH2-CH3的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 158提供了His6标签的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 159提供了hTLT-1.18-188的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 160提供了引物编号1004的核酸序列。

SEQ ID NO: 161提供了引物编号1005的核酸序列。

SEQ ID NO: 162提供了Fab 0100 HC的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 163提供了Fab 0100 LC的氨基酸序列。

发明详述

本发明涉及融合蛋白：即从已经人工地连接的2个或更多个基因表达的蛋白，所述基因例如通过重组技术或化学偶联，且它们最初编码单独的蛋白。本发明的融合蛋白能够结合仅仅(其含义是非遍在的)存在于发生与活化有关的构象变化和功能变化的血小板上的受体。这样的受体的实例可能源自静止血小板的α颗粒或致密颗粒。这样的受体的一个具体实例是TREM-样转录物1 (TLT-1)。

在髓样细胞上表达的触发受体(TREM)在不同髓样谱系的生物学中具有非常确定的作用，在先天性和适应性免疫的调节中起重要作用。TLT-1属于相同的蛋白家族，尽管TLT-1基因仅在单个谱系（即巨核细胞和凝血细胞(血小板)）中表达，且排它地存在于巨核细胞和血小板的α-颗粒中。TLT-1是一种跨膜蛋白，其在α-颗粒释放以后暴露于活化的血小板的表面。迄今为止，尚未在静止血小板的表面上或在任意其它细胞类型的表面上发现TLT-1。

已知TLT-1的胞外部分由单个免疫球蛋白-样(Ig-样)结构域组成，所述结构域通过称作茎（stalk）的连接区与血小板细胞膜相连(Gattis等人, Jour Biol Chem, 2006, Vol. 281, No. 19, 第13396-13403页)。人TLT-1 (hTLT-1)的Ig-样结构域由105个残基组成，并通过37-氨基酸茎连接至膜上。因而，预期TLT-1的Ig-样结构域具有相当大的运动自由。

hTLT-1的假定的跨膜区段的长度是20个氨基酸。TLT-1也具有细胞质的免疫-受体基于酪氨酸的抑制基序，其可以起细胞内信号转导结构域的功能。

尚未充分阐述TLT-1在血小板生物学中的作用；据信，TLT-1在调节损伤部位处的凝血和炎症中起作用。已经报道了含有Ig-样结构域的TLT-1的可溶形式(Gattis等人, Jour Biol Chem, 2006, Vol. 281, No. 19, 第13396-13403页)。可溶性的TLT-1相对于血小板结合的TLT-1的具体功能有待确定。

诸如TLT-1等受体包含这样的表位：所述表位是本发明的融合蛋白/构建体的有用靶物。融合蛋白可以结合TLT-1的可用于体内结合的任意部分，诸如Ig-样结构域的表面可接近的残基或茎的一部分。因此，融合蛋白可以结合在TLT-1 (20-125)、TLT-1 (16-162)、TLT-1 (126-162)和/或TLT-1 (129-142)内的一个或多个残基。

在一个优选的实施方案中，融合蛋白结合TLT-1的茎，诸如TLT-1 (126-162)或TLT-1 (129-142)的一个或多个残基。结合TLT-1的茎的融合蛋白不可能干扰Ig-样结构域的功能，且可能不会与血小板表面分离（如果所述Ig-样结构域脱落）。此外，结合TLT-1的茎的融合蛋白将它们的TF部分在活化的血小板的细胞表面上放置在有利的位置和朝向（相对于FVII和FVIIa）。在另一个优选的实施方案中，使TF与抗体的C-端或其片段融合，会在活化的血小板的细胞表面上甚至更有利地放置TF（相对于FVII和FVIIa）。

关于本发明，TLT-1可以来自任意脊椎动物，诸如任意哺乳动物，诸如啮齿动物(诸如小鼠、大鼠或豚鼠)、兔类动物(诸如兔)、偶蹄动物(诸如猪、牛、绵羊或骆驼)或灵长类动物(诸如猴或人类)。TLT-1优选地是人TLT-1。从产生功能性TLT-1蛋白的任意天然存在的基因型或等位基因，可以翻译出TLT-1。一种人TLT-1的一个非限制性实例是SEQ ID NO. 2的多肽序列。

本发明的融合蛋白包含组织因子-样组分。组织因子是一种263个氨基酸长的完整膜糖蛋白受体。它由折叠成2个紧凑的纤连蛋白III型-样结构域（它们各自被单个二硫键稳定化）的胞外部分(1-209)、短连接物(210-219)、跨膜区段(220-242)和短细胞质尾巴(243-263)组成。它与因子VII/FVIIa形成紧密的Ca²⁺-依赖性的复合物。

关于本发明，“组织因子或其任意生物学功能变体或片段”可以是能够结合因子VII/VIIa从而刺激血液凝固的任意组织因子-样多肽。“组织因子”可以源自任意脊椎动物，诸如任意哺乳动物，诸如啮齿动物(诸如小鼠、大鼠或豚鼠)、兔类动物(诸如兔)、偶蹄动物(诸如猪、牛、绵羊或骆驼)或灵长类动物(诸如猴或人类)。“组织因子或其任意生物学功能变体或片段”可以是人组织因子的胞外结构域。“组织因子或其任意生物学功能变体或片段”可以是与组织因子的多肽序列具有至少90%、诸如至少91%、诸如至少92%、诸如至少93%、诸如至少94%、诸如至少95%、诸如至少96%、诸如至少97%、诸如至少98%、诸如至少99%同一性的任意多肽。“组织因子或其任意生物学功能变体或片段”可以是与组织因子的胞外结构域或其变体的多肽序列具有至少90%、诸如至少91%、诸如至少92%、诸如至少93%、诸如至少94%、诸如至少95%、诸如至少96%、诸如至少97%、诸如至少98%、诸如至少99%同一性的任意多肽。“组织因子或其任意生物学功能变体或片段”可以是能够起FVII和FVIIa的辅因子的功能的任意多肽。因此，“组织因子或任意生物学功能变体或其片段”可以是能够刺激FVIIa的酰胺分解活性的任意多肽。所述“组织因子或其任意生物学功能变体或片段”可以是TF的胞外结构域(1-219)。“组织因子多肽”可以是这样的多肽：其包含组织因子的可溶性胞外结构域，即氨基酸1-219 (在下文中称作sTF或sTF(1-219))，或其功能变体或截短形式。优选地，组织因子多肽至少包含与组织因子的氨基酸序列6-209相对应的片段。其实例是sTF(6-209)、sTF(1-209)、sTF (1-210)、sTF (1-211)、sTF (1-212)、sTF (1-213)、sTF (1-214)、sTF (1-215)、sTF (1-216)、sTF (1-217)、sTF (1-218)、sTF(1-219)、sTF(2-219)、sTF(3-219)、sTF(4-219)、sTF(5-219)。

根据本发明，“组织因子或其任意生物学功能变体或片段”可以具有任意一种或多种上面列出的特征。

本发明的融合蛋白也包含“配体”。术语“配体”表示能够结合生物分子并与其形成复合物从而起生物学作用的任意物质。在该术语的一个方面，它是借助于分子间力（诸如离子键、氢键和范德华力）而结合靶蛋白上的位点的信号触发分子。配体与所述生物分子的结合通常是可逆的。天然存在的配体与它的副本受体的结合可能改变或不改变受体蛋白的构象。关于本发明，所述配体的一个目的是，将TF-样组分靶向活化的或处于被活化过程中的血小板的表面。

所述配体可以是任意天然存在的或合成的配体，其结合优选地仅存在于经历活化的血小板上的受体。本发明的配体可以是任意天然存在的或合成的结合TLT-1的配体，或所述配体可以是已经针对TLT-1产生的抗体或其片段。本发明的配体可以导致或不导致TLT-1的构象结构的变化。此外，本发明的配体可以导致或不导致细胞内信号传递，这作为与TLT-1结合的结果。在一个优选的实施方案中，本发明的配体能够结合TLT-1的茎。因此，本发明的配体利用天然存在的受体或其部分，从而实现本发明独有的并提供的效果。

如上所述，发明的融合蛋白的配体组分可以是抗体或其片段。在本文中提及的术语“抗体”包括整个抗体及其任意抗原结合片段(即，“抗原结合部分”)或单链。抗体表示包含通过二硫键相连的至少2个重(H)链和2个轻(L)链的糖蛋白或其抗原结合部分。每个重链包含重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区。每个轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。VH和VL区可以进一步细分成超变区（称作互补性决定区(CDR)），所述超变区中散布着更保守的区域，称作框架区(FR)。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的不同细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。

本发明的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。在一个实施方案中，本发明的抗体是单克隆抗体。本发明的抗体可以是嵌合的抗体、CDR-移植的抗体、人或人源化的抗体或它们中的任一种的抗原结合部分。为了生产单克隆抗体和多克隆抗体，实验动物是合适的哺乳动物，诸如山羊、兔、大鼠或小鼠。

单克隆抗体在结构方面用具有对特定表位的单一结合特异性和亲和力的单个分子物质来表示。通过多种众所周知的技术，可以生产本发明的单克隆抗体(mAb)，所述技术包括常规的单克隆抗体方法学，例如，Kohler和Milstein (1975) Nature 256: 495的标准的体细胞杂交技术，或B淋巴细胞的病毒或致癌转化。用于制备杂交瘤的优选动物系统是鼠系统。在小鼠中生产杂交瘤是非常确定的规程。免疫方案和分离用于融合的免疫的脾细胞的技术是本领域已知的。融合配偶体(例如，鼠骨髓瘤细胞)和融合规程也是已知的。

为了制备生产本发明的单克隆抗体的杂交瘤，可以从免疫的小鼠分离脾细胞和/或淋巴结细胞，并与适当的永生化细胞系（诸如小鼠骨髓瘤细胞系）融合。可以针对抗原-特异性的抗体的生产，筛选得到的杂交瘤。可以重新铺板分泌抗体的杂交瘤，再次筛选，如果仍然是合适的IgG阳性的，可以通过有限稀释将单克隆抗体亚克隆至少2次。然后可以在体外培养稳定的亚克隆，以在组织培养基中产生小量抗体，用于表征。

通过重组方式，可以制备、表达、建立或分离本发明的抗体，例如：(a)从动物(例如，小鼠)或由其制备的杂交瘤分离抗体，所述动物是目标免疫球蛋白基因转基因的或转染色体的，(b)从转化成表达目标抗体的宿主细胞（例如，从转染瘤）分离抗体，(c)从重组的、组合的抗体文库分离抗体，和(d)通过包含将免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序列上的任意其它方式，制备、表达、建立或分离抗体。

借助于前缀“mAb”以及4-位数编号，在本文中鉴别出在表1中所示的合适的单克隆抗体。因此，所述单克隆抗体可以是mAb 0012或其变体(应当指出，称作“2F105”的mAb的可变结构域与mAb 0012的可变结构域相同)。所述单克隆抗体可以是mAb 0023或其变体。所述单克隆抗体可以是mAb 0051或其变体。所述单克隆抗体可以是mAb 0061或其变体。所述单克隆抗体可以是mAb 0062或其变体。所述单克隆抗体可以是mAb 0082或其变体。

表1: 合适的单克隆抗体的非限制性实例

mAb IDHCLC0012SEQ ID NO: 39SEQ ID NO: 400023SEQ ID NO: 41SEQ ID NO: 420051SEQ ID NO: 43SEQ ID NO: 440052SEQ ID NO: 45SEQ ID NO: 460061SEQ ID NO: 47SEQ ID NO: 480062SEQ ID NO: 49SEQ ID NO: 460082SEQ ID NO: 50SEQ ID NO: 48

术语抗体的“抗原结合部分”表示，抗体的保留特异性地结合抗原（诸如TLT-1或本文所述的另一种靶受体）的能力的一个或多个片段。已经证实，抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来实现。在术语抗体的“抗原结合部分”内包括的结合片段的实例，包括Fab片段、F(ab')₂片段、Fab’片段、Fd片段、Fv片段、ScFv片段、dAb片段和分离的互补性决定区(CDR)。在术语抗体的“抗原结合部分”内也意图包括单链抗体(诸如scFv)和重链抗体(诸如VHH)和骆驼抗体。使用本领域技术人员已知的常规技术，可以得到这些抗体片段，且以与完整抗体相同的方式，可以筛选所述片段的实用性。

借助于前缀“Fab”以及4-位数编号，在本文中鉴别出在表2中所示的合适的Fab片段。所述Fab片段可以是Fab 0012或其变体。所述Fab片段可以是Fab 0023或其变体。所述Fab片段可以是Fab 0051或其变体。所述Fab片段可以是0052或其变体。所述Fab片段可以是Fab 0061或其变体。所述Fab片段可以是Fab 0062或其变体。所述Fab片段可以是Fab 0082或其变体。

表2: 合适的Fab片段的非限制性实例

Fab IDVH-CH1LC0012SEQ ID NO: 51SEQ ID NO: 400023SEQ ID NO: 52SEQ ID NO: 420051SEQ ID NO: 53SEQ ID NO: 440052SEQ ID NO: 54SEQ ID NO: 460061SEQ ID NO: 156SEQ ID NO: 480082SEQ ID NO: 55SEQ ID NO: 48AP-3SEQ ID NO: 56SEQ ID NO: 57AP-3.LC.C34SSEQ ID NO: 56SEQ ID NO: 58

本发明的抗体可以是人抗体或人源化的抗体。本文使用的术语“人抗体”意图包括具有这样的可变区的抗体：在所述可变区中，框架区和CDR区都源自人种系免疫球蛋白序列。此外，如果所述抗体含有恒定区，所述恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机诱导或定点诱变或通过体内体细胞突变导入的突变)。但是，本文使用的术语“人抗体”无意包括这样的抗体：其中源自另一个哺乳动物物种（诸如小鼠）的种系的CDR序列已经被移植到人框架序列上。

这样的人抗体可以是人单克隆抗体。这样的人单克隆抗体可以由杂交瘤生产，所述杂交瘤包括从转基因的非人动物（例如，转基因的小鼠）得到的B细胞，所述B细胞具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组，并与永生化细胞融合。

可以如下制备人抗体：体外免疫人淋巴细胞，随后用非洲淋巴细胞瘤病毒转化淋巴细胞。

术语“人抗体衍生物”表示人抗体的任意修饰形式，例如，所述抗体和另一种药剂或抗体的缀合物。

术语“人源化的抗体”意图表示这样的抗体：其中源自另一个哺乳动物物种（诸如小鼠）种系的CDR序列已经移植到人框架序列上。可以在人框架序列内产生额外的框架区修饰。

可以测试本发明的抗体对靶蛋白的结合，例如，通过标准的ELISA或蛋白印迹法。ELISA试验也可以用于筛选表现出与靶蛋白的阳性反应性的杂交瘤。通过监测抗体与表达靶蛋白的细胞的结合，也可以测定抗体的结合特异性，例如，通过流式细胞术。

通过测定抗体是否结合其它蛋白，可以进一步研究本发明的抗体对靶蛋白的特异性。例如，在希望生产特异性地结合TLT-1或TLT-1的特定部分（例如表位）的抗体的情况下，可以如下评估抗体的特异性：测定所述抗体是否也结合其它分子或缺少目标部分的TLT-1修饰形式。

通过截短，例如通过从多肽的N和/或C端末端去除一个或多个氨基酸，可以制备根据本发明的多肽或抗体“片段”。以此方式，可以从N和/或C末端去除最多10个、最多20个、最多30个、最多40个或更多个氨基酸。通过一个或更多个内部删除，也可以产生片段。

本发明的抗体可以是，或可以包含，抗-TLT-1抗体的片段或其变体。本发明的抗体可以是，或可以包含，上面另外讨论的该抗体的抗原结合部分或其变体。例如，本发明的抗体可以是该抗体的Fab片段或其变体，或可以是源自该抗体的单链抗体或其变体。

可以以它们的表位和/或互补位（paratope）的方式，定义抗体以及包含抗体的融合蛋白或其片段。术语“表位”包括能够特异性地结合免疫球蛋白(或T-细胞受体)的任意蛋白决定簇。表位决定簇通常由诸如氨基酸或糖侧链等分子的化学活性表面分型组成，通常具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。具有抗原活性的表位是抗体免疫特异性地结合的多肽部分，所述结合通过本领域众所周知的任意方法（例如，通过免疫测定）测得。抗原表位不一定是免疫原性的。

关于本发明，“表位”表示这样的抗原(Ag)部分或区域：它是在活化的血小板上的受体，融合蛋白的抗体(Ab)部分能够特异性地结合它，即与Ab发生物理接触的部分或区域。抗原的表位可以包含Ag的直接参与结合Ab的氨基酸残基(表位的免疫显性组分)和不直接参与结合的其它氨基酸残基，诸如被Ab有效地阻断的Ag的氨基酸残基(换而言之，所述氨基酸残基是在Ab的“溶剂排斥表面”和/或“脚印”内)。术语表位在本文中包括受体的任意特定区域中的两类结合位点，诸如特异性地结合抗-TLT-1抗体的TLT-1，或根据本发明的另一种TLT-1-特异性的试剂，除非另有说明(例如，在有些上下文中，本发明涉及直接结合特定氨基酸残基的抗体)。诸如TLT-1等受体可以包含许多不同的表位，所述表位可以包括、但不限于：(1)线性的肽抗原决定簇，(2)构象抗原决定簇，其由在成熟的受体构象中彼此靠近的一个或多个非连续氨基酸组成；和(3)翻译后抗原决定簇，其全部或部分地由共价地连接TLT-1的分子结构组成，诸如碳水化合物基团。

使用多种实验和计算表位作图方法，可以在不同的详细水平定义和表征给定的抗体(Ab)/抗原(Ag)对的表位。实验方法包括诱变、X-射线晶体学、核磁共振(NMR)波谱学、氢氘交换质谱法(HX-MS)和各种竞争结合方法。由于每种方法依赖于独特的原理，表位的描述与用于测定它的方法紧密相关。因而，根据采用的表位作图方法，不同地定义给定的Ab/Ag对的表位。

在它的最详细的水平，通过定义在Ag-Ab相互作用中存在的原子接触的空间坐标，以及关于它们对结合热力学的相对贡献的信息，可以定义Ag和Ab之间的相互作用的表位。在详细度更低的水平，通过定义Ag和Ab之间的原子接触的空间坐标，可以表征表位。在详细度进一步更低的水平，通过它包含的氨基酸残基（由特定标准限定，例如Ab和Ag中的原子之间的距离），可以表征表位。在详细度进一步更低的水平，通过功能，例如通过与其它Ab的竞争结合，可以表征表位。也可以更一般地将表位定义为包含这样的氨基酸残基：另一种氨基酸所述氨基酸残基的置换会改变Ab和Ag之间的相互作用特征。

在X-射线衍生的晶体结构（由Ab（例如Fab片段）和它的Ag之间的复合物的空间坐标限定）的上下文中，除非另外指出或上下文相矛盾，术语表位在本文中被具体地定义为，特征在于在离Ab中的重原子4 ?距离内具有重原子(即非氢原子)的血小板受体残余物。

鉴于在不同详细水平得到表位的描述和定义（依赖于使用的表位作图方法），可以类似地在不同详细水平对比不同Ab在相同Ag上的表位。

如果表位含有相同的氨基酸残基集合，则称作在氨基酸水平描述（例如从X-射线结构测定）的表位是相同的。如果表位共有至少一种氨基酸，则称作表位是重叠的。如果表位不共有氨基酸残基，则称作表位是单独的(独特地的)。

如果对应的Ab的结合是互相排斥的，即如果一种Ab的结合排斥另一种Ab的同时结合，则称作通过竞争结合表征的表位是重叠的。如果Ag能够适应两种对应的Ab同时结合，则称作表位是单独的(独特地的)。因而，本发明的融合蛋白可以能够结合与mAb 0012相同的表位。融合蛋白可以能够结合与mAb 0023相同的表位。融合蛋白可以能够结合与mAb 0051相同的表位。融合蛋白可以能够结合与mAb 0061相同的表位。融合蛋白可以能够结合与mAb 0062相同的表位。

所述表位可以包含一个或多个选自下述的残基：SEQ ID NO: 4的K133、I134、G135、S136、L137、A138、N140、A141、F142、S143、D144、P145和A146。

所述表位可以包含一个或多个选自下述的残基：SEQ ID NO: 5的V17、Q18、C19、H20、Y21、R22、L23、Q24、D25、V26、K27、A28、L63、G64、G65、G66、L67、L68、G89、A90、R91、G92、P93、Q94、I95和L96。

所述表位可以包含一个或多个选自下述的残基：SEQ ID NO: 5的L36、P37、E38、G39、C40、Q41、P42、L43、V44、S45、S46、A47、V73、T74、L75、Q76、E77、E78、D79、A80、G81、E82、Y83、G84、C85、M86、R91、G92、P93、Q94、I95、L96、H97、R98、V99、S110和L111。

所述表位可以包含一个或多个选自下述的残基：SEQ ID NO: 5的V17、Q18、C19、H20、Y21、R22、L23、Q24、D25、V26、K27、A28、R91、G92、P93、Q94、I95、L96、H97、R98、V99、S100和L101。

所述表位可以包含一个或多个选自下述的残基：SEQ ID NO: 7的E5、T6、H7、K8、I9、G10、S11、L12、A13、E14、N15、A16、F17、S18、D19、P20和A21。

所述表位可以包含一个或多个选自下述的残基：SEQ ID NO: 7的K133、I134、G135、S136、L137、A138、N140、A141、F142、S143、D144、P145和A146。

通过反转角度，从上面“表位”的定义衍生出术语“互补位”的定义。因而，术语“互补位”表示Ag特异性地结合（即与Ag发生物理接触的）的Ab的部分或区域。

所述互补位可以包含一个或多个选自下述的残基：抗-TLT-1轻(L)链(SEQ ID NO: 40)的H50、N52、Y56、H58、Y73、F79、S115、T116、V118和Y120，和抗-TLT-1重(H)链(SEQ ID NO: 39)的残基V20、F45、R49、Y50、W51、E68、T75、N77、S116、G117、V118和T120。

在X-射线衍生的晶体结构（由Ab（例如Fab片段）和它的Ag之间的复合物的空间坐标限定）的上下文中，除非另外指出或上下文相矛盾，术语互补位在本文中被具体地定义为，特征在于在离血小板受体中的重原子4 ?距离内具有重原子(即非氢原子)的Ag残余物。

通过常规方法，可以鉴别给定的抗体(Ab)/抗原(Ag)对的表位和互补位。例如，通过评估抗体的结合TLT-1的不同片段或变体的能力，可以测定表位的一般位置。使用常规方法，诸如在实施例中描述的那些方法，也可以测定在TLT-1内与抗体(表位)接触的具体氨基酸和在抗体内与TLT-1 (互补位)接触的具体氨基酸。例如，可以组合抗体和靶分子，并可以使Ab/Ag复合物结晶。可以测定复合物的晶体结构，并用于鉴别抗体和它的靶物之间的相互作用的特定位点。

以它们的互补性决定区(CDR)的方式，也可以定义包含配体（它是抗体或其片段）的融合蛋白。术语“互补性决定区”或“高变区”在本文中用于表示负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。互补性决定区或“CDR”通常包含在轻链可变结构域中的氨基酸残基24-34 (L1)、50-56 (L2)和89-97 (L3)以及在重链可变结构域中的氨基酸残基31-35 (H1)、50-65 (H2)和95-102 (H3); (Kabat等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, 美国卫生和人类服务部, NIH Publication No. 91-3242)和/或来自“超变环”的那些残基(轻链可变结构域中的残基26-32 (L1)、50-52 (L2)和91-96 (L3)，和重链可变结构域中的残基26-32 (H1)、53-55 (H2)和96-101 (H3); Chothia和Lesk, J. Mol. Biol 1987;196:901-917)。通常，通过Kabat等人（同上）所述的方法，对该区域中的氨基酸残基编号。诸如“Kabat位置”、“Kabat残基”和“根据Kabat”等短语在本文中表示重链可变结构域或轻链可变结构域的该编号系统。使用Kabat编号系统，肽的实际线性氨基酸序列可以含有更少的或额外的氨基酸，所述氨基酸与可变结构域的FR或CDR的缩短或插入相对应。例如，重链可变结构域可以包括在CDR H2的残基52后面的氨基酸插入(根据Kabat，残基52a、52b和52c)和在重链FR残基82后面插入的残基(例如，根据Kabat，残基82a、82b和82c等)。通过比对抗体序列的同源性区域和“标准的”Kabat编号的序列，可以确定给定的抗体的残基的Kabat编号。

术语“框架区”或“FR”残基表示，不是在本文定义的CDR内的那些VH或VL氨基酸残基。

在一个实施方案中，所述重链包含：

· SEQ ID NO: 41的氨基酸50-54(DYFMY)的CDR1序列，其中这些氨基酸之一可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 41的氨基酸69-85(YISNGGDSSSYPDTVKG)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个、2个、3个或4个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 41的氨基酸118-129(NKNWDDYYDMDY)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换。

在另一个实施方案中，所述轻链包含：

· SEQ ID NO: 42的氨基酸44-60(KSSQSLLNSRTRKNYLA)的CDR1序列，其中这些氨基酸中的1个、2个、3个或4个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 42的氨基酸76-82(WASTRES)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 42的氨基酸115-122(KQSYNLLT)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换。

在另一个实施方案中，所述重链包含：

· SEQ ID NO: 43的氨基酸50-54(DYSMH)的CDR1序列，其中这些氨基酸之一可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 43的氨基酸69-85(VISTYYGDVRYNQKFKG)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个、2个、3个或4个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 43的氨基酸118-129(APMITTGAWFAY)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换。

在另一个实施方案中，所述轻链包含：

· SEQ ID NO: 44的氨基酸44-54(KASQSVSNDVA)的CDR1序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 44的氨基酸70-76(YASSRYT)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 44的氨基酸109-117(QQDYSSPYT)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换。

在另一个实施方案中，所述重链包含：

· SEQ ID NO: 49的氨基酸50-54(SHWIE)的CDR1序列，其中这些氨基酸之一可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 49的氨基酸69-85(EILPGSGNTNYNEKFKG)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个、2个、3个或4个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 49的氨基酸118-130(GYYGLNYDWYFDV)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换。

在另一个实施方案中，所述轻链包含：

· SEQ ID NO: 46的氨基酸44-54(RASQDISNYLN)的CDR1序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 46的氨基酸70-76(YTSRLHS)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 46的氨基酸109-117(QQDTKLPYT)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换。

在另一个实施方案中，所述重链包含：

· SEQ ID NO: 47的氨基酸49-53(RYWMT)的CDR1序列，其中这些氨基酸之一可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 47的氨基酸68-84(EINPDSSTINYNPSLKD)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个、2个、3个或4个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 47的氨基酸117-121(GVFTS)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换。

在另一个实施方案中，所述轻链包含：

· SEQ ID NO: 48的氨基酸43-58(RSSQSLVHRNGNTYFH)的CDR1序列，其中这些氨基酸中的1个、2个、3个或4个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 48的氨基酸74-80(KVSNRFS)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 48的氨基酸113-121(SQSTHVPYT)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换。

在另一个实施方案中，所述重链包含：

· SEQ ID NO: 39的氨基酸49-53(RYWMT)的CDR1序列，其中这些氨基酸之一可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 39的氨基酸68-84(EINPDSSTINYTPSLKD)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个、2个、3个或4个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 39的氨基酸117-121(GVFTS)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换。

在另一个实施方案中，所述轻链包含：

· SEQ ID NO: 40的氨基酸43-58(RSSQSLVHRNGNTYFH)的CDR1序列，其中这些氨基酸中的1个、2个、3个或4个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 40的氨基酸74-80(KVSNRFS)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 40的氨基酸113-121(SQSTHVPYT)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换。

在另一个实施方案中，所述(ii)的重链包含：

· SEQ ID NO: 56的氨基酸50-54(NYWLG)的CDR1序列，其中这些氨基酸之一可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 56的氨基酸69-85(DIYPGGGYNKYNENFKG)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个、2个、3个或4个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 56的氨基酸118-128(EYGNYDYAMDS)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换。

在另一个实施方案中，所述(ii)的轻链包含：

· SEQ ID NO: 57的氨基酸44-59(RSSRSLLHSNGNTYLC)的CDR1序列，其中这些氨基酸中的1个、2个、3个或4个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 57的氨基酸75-81(RMSNLAS)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 57的氨基酸114-122(MQHLEYPFT)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换。

因此，本发明的构建体是任意融合蛋白或嵌合体，其包含：(i)至少一种TF或其生物学功能变体或片段，和(ii)配体，所述配体能够结合(iii)受体和/或其片段，其中所述受体仅存在于(其含义是，非遍在的)活化的血小板的表面上。在一个优选的实施方案中，(iii)是TLT-1。优选地工程化本发明的融合蛋白(构建体)，使得它的组成部分可以彼此独立地起作用。例如，所述的本发明的“组织因子…”组分能够结合FVII和FVIIa，不会由于所述的本发明的“配体”组分的存在而空间受阻不能结合。同样地，所述的本发明“配体”组分优选地能够结合受体诸如TLT-1，不会受到所述的“组织因子…”组分的存在的阻碍。“TF多肽”组分的羧基端可以共价地连接到构建体的配体组分的氨基端上，或反之亦然。所述的构建体的配体组分优选地不结合任意其它TREM。本发明的构建体可以包含或不包含在所述TF和所述配体组分之间的连接物。所述任选的连接物可以是在表3中所述的连接物中的任一种，或可以是结合构建体的TF和配体组成部分的任意其它连接物，使得二者都是有功能的。

本发明的融合蛋白/构建体可以包含：(i)组织因子和(ii)任意配体，所述配体能够结合(iii) TLT-1。所述融合蛋白/构建体可以另外包含连接物，所述连接物可以是在表3中提供的连接物L1-L10中的任一种。

本发明的构建体可以包含：(i)组织因子和(ii)抗体，所述抗体能够结合(iii) TLT-1。所述抗体可以是单克隆抗体。所述构建体可以另外包含连接物。所述连接物可以是在表3中提供的连接物L1-L10中的任一种。

本发明的构建体可以包含：(i)组织因子和(ii) Fab片段，所述片段能够结合(iii) TLT-1。

所述构建体可以另外包含连接物，所述连接物可以是在表3中提供的连接物（L1-L10）中的任一种。

本发明的构建体可以包含：(i)组织因子和(ii) F(ab’)₂片段，所述片段能够结合(iii) TLT-1。所述构建体可以另外包含连接物，所述连接物可以是在表3中提供的连接物（L1-L10）中的任一种。

本发明的构建体可以包含：(i)组织因子和(ii) Fab’片段，所述片段能够结合(iii) TLT-1。所述构建体可以另外包含连接物，所述连接物可以是在表3中提供的连接物（L1-L10）中的任一种。

本发明的构建体可以包含：(i)组织因子和(ii) Fd片段，所述片段能够结合(iii) TLT-1。所述构建体可以另外包含连接物，所述连接物可以是在表3中提供的连接物（L1-L10）中的任一种。

本发明的构建体可以包含：(i)组织因子和(ii) Fv片段，所述片段能够结合(iii) TLT-1。所述构建体可以另外包含连接物，所述连接物可以是在表3中提供的连接物（L1-L10）中的任一种。

本发明的构建体可以包含：(i)组织因子和(ii) dAb片段，所述片段能够结合(iii) TLT-1。所述构建体可以另外包含连接物，所述连接物可以是在表3中提供的连接物（L1-L10）中的任一种。

本发明的构建体可以包含：(i)组织因子和(ii)分离的互补性决定区(CDR)，所述互补性决定区能够结合(iii) TLT-1。所述构建体可以另外包含连接物，所述连接物可以是在表3中提供的连接物（L1-L10）中的任一种。

本发明的构建体可以包含：(i)组织因子的任意生物学功能变体或片段，和(ii)任意配体，所述配体能够结合(iii) TLT-1。所述构建体可以另外包含连接物，所述连接物可以是在表3中提供的连接物（L1-L10）中的任一种。

本发明的构建体可以包含：(i)组织因子的任意生物学功能变体或片段，和(ii)抗体，所述抗体能够结合(iii) TLT-1。所述构建体可以另外包含连接物，所述连接物可以是在表3中提供的连接物（L1-L10）中的任一种。

本发明的构建体可以包含：(i)组织因子的任意生物学功能变体或片段，和(ii) Fab片段，所述片段能够结合(iii) TLT-1。所述构建体可以另外包含连接物，所述连接物可以是在表3中提供的连接物（L1-L10）中的任一种。

本发明的构建体可以包含：(i)组织因子的任意生物学功能变体或片段，和(ii) F(ab’)₂片段，所述片段能够结合(iii) TLT-1。所述构建体可以另外包含连接物，所述连接物可以是在表3中提供的连接物（L1-L10）中的任一种。

本发明的构建体可以包含：(i)组织因子的任意生物学功能变体或片段，和(ii) Fab’片段，所述片段能够结合(iii) TLT-1。所述构建体可以另外包含连接物，所述连接物可以是在表3中提供的连接物（L1-L10）中的任一种。

本发明的构建体可以包含：(i)组织因子的任意生物学功能变体或片段，和(ii) Fd片段，所述片段能够结合(iii) TLT-1。所述构建体可以另外包含连接物，所述连接物可以是在表3中提供的连接物（L1-L10）中的任一种。

本发明的构建体可以包含：(i)组织因子的任意生物学功能变体或片段，和(ii) Fv片段，所述片段能够结合(iii) TLT-1。所述构建体可以另外包含连接物，所述连接物可以是在表3中提供的连接物（L1-L10）中的任一种。

本发明的构建体可以包含：(i)组织因子的任意生物学功能变体或片段，和(ii) dAb片段，所述片段能够结合(iii) TLT-1。所述构建体可以另外包含连接物，所述连接物可以是在表3中提供的连接物（L1-L10）中的任一种。

本发明的构建体可以包含：(i)组织因子的任意生物学功能变体或片段，和(ii)分离的互补性决定区(CDR)，所述互补性决定区能够结合(iii) TLT-1。所述构建体可以另外包含连接物，所述连接物可以是在表3中提供的连接物（L1-L10）中的任一种。

本发明的构建体可以包含：(i)组织因子的胞外结构域，和(ii)任意配体，所述配体能够结合(iii) TLT-1。所述构建体可以另外包含连接物。所述连接物可以是在表3中提供的连接物L1-L10中的任一种。

本发明的构建体可以包含：(i)组织因子的胞外结构域，和(ii)抗体，所述抗体能够结合(iii) TLT-1。所述构建体可以另外包含连接物。所述连接物可以是在表3中提供的连接物L1-L10中的任一种。

本发明的构建体可以包含：(i)组织因子的胞外结构域，和(ii) Fab片段，所述片段能够结合(iii) TLT-1。所述构建体可以另外包含连接物。所述连接物可以是在表3中提供的连接物L1-L10中的任一种。

本发明的构建体可以包含：(i)组织因子的胞外结构域，和(ii) F(ab’)₂片段，所述片段能够结合(iii) TLT-1。所述构建体可以另外包含连接物。所述连接物可以是在表3中提供的连接物（L1-L10）中的任一种。

本发明的构建体可以包含：(i)组织因子的胞外结构域，和(ii) Fab’片段，所述片段能够结合(iii) TLT-1。所述构建体可以另外包含连接物。所述连接物可以是在表3中提供的连接物（L1-L10）中的任一种。

本发明的构建体可以包含：(i)组织因子的胞外结构域，和(ii) Fd片段，所述片段能够结合(iii) TLT-1。所述构建体可以另外包含连接物。所述连接物可以是在表3中提供的连接物（L1-L10）中的任一种。

本发明的构建体可以包含：(i)组织因子的胞外结构域，和(ii) Fv片段，所述片段能够结合(iii) TLT-1。所述构建体可以另外包含连接物。所述连接物可以是在表3中提供的连接物（L1-L10）中的任一种。

本发明的构建体可以包含：(i)组织因子的胞外结构域，和(ii) dAb片段，所述片段能够结合(iii) TLT-1。所述构建体可以另外包含连接物。所述连接物可以是在表3中提供的连接物（L1-L10）中的任一种。

本发明的构建体可以包含：(i)组织因子的胞外结构域，和(ii)分离的互补性决定区(CDR)，所述互补性决定区能够结合(iii) TLT-1。所述构建体可以另外包含连接物。所述连接物可以是在表3中提供的连接物（L1-L10）中的任一种。

本发明的构建体可以是一种融合蛋白，其包含：mAb 0012 (2F105) HC的可变结构域、人IgG4 CH1 恒定区、甘氨酸-丝氨酸连接物和人组织因子的胞外结构域(2F105HC-V-CH1-连接物-hTF ECD)。

本发明的构建体可以是一种融合蛋白，其由mAb 0012 (2F105) HC的可变结构域、人IgG4 CH1 恒定区、甘氨酸-丝氨酸连接物和人组织因子的胞外结构域组成(2F105HC-V-CH1-连接物-hTF ECD)。

如上所述，本发明的融合蛋白可以包含连接物。连接物氨基酸序列的非限制性实例如表3所示。因此，所述连接物可以是L1。所述连接物可以是L2。所述连接物可以是L3。所述连接物可以是L4。所述连接物可以是L5。所述连接物可以是L6。所述连接物可以是L7。所述连接物可以是L8。所述连接物可以是L9。所述连接物可以是L10。

表3: 任选的连接物的非限制性实例

如上所述，TLT-1的胞外部分由免疫球蛋白-样结构域和茎组成。本发明的融合蛋白可以能够结合它们中的任一个。当融合蛋白的部分(ii)能够结合免疫球蛋白-样结构域时，更长的连接物可能允许所述融合蛋白的部分(i)适应在活化的血小板的表面上的功能上有关的位置和朝向，从而促进它的功能。这是因为，部分(i)（即TF多肽）必须特别靠近FVII/FVIIa，并相对于FVII/FVIIa适当朝向：TF起FVII/FVIIa的辅因子的作用，其结合在活化的血小板的表面上的Ca2⁺和磷脂。

能够结合TLT-1的茎的融合蛋白邻近血小板膜。因此，能够结合所述茎的融合蛋白可以包含连接物；但是，连接物的包含不一定影响融合蛋白的TF部分的功能。

在表4中提供了合适的融合蛋白（其中(ii)是单克隆抗体）的实例。由于每个mAb具有2个相同的重链(HC)和2个相同的轻链(LC)，融合蛋白（其中部分(ii)是mAb）可以包含2个TF多肽(部分(i))。TF可以与mAb的HC融合；TF可以与mAb的LC融合。TF可以与配体融合，所述配体又与mAb的HC或mAb的LC融合。下面是如何解释在表4中提供的融合蛋白的名称的实例：

在融合蛋白“mAb 0012-(HC-L0-hTF.1-219)₂;LC₂ ”中：

· “mAb 0012”: 单克隆抗体0012。

· “(HC-L0-hTF.1-219)₂”: 一个hTF.1-219与每个HC融合；hTF.1-219的N-端与重链的C-端融合。

· “L0”: 不存在连接物。

· LC₂: 存在2个轻链，所述轻链未融合其它物质。

在融合蛋白“mAb 0023-(HC-L4a-hTF.1-219)₂;(LC-HPC4)₂”中：

· “mAb 0023”是单克隆抗体0023。

· “(HC-L4a-hTF.1-219)₂”指示，一个hTF.1-219通过连接物与每个HC融合；hTF.1-219的N-端与连接物L4a的C-端融合，它的N-端与mAb的重链的C-端融合。

· “(LC-HPC4)₂”指示，一个HPC4标签与每个LC的C-端融合。

在融合蛋白“mAb 0012-(LC-L5-hTF.1-219)₂;HC₂”中：

· (LC-L5-hTF.1-219)₂指示，hTF.1-219的N-端与连接物L5的C-端融合，它的N-端与轻链的C-端融合。

· HC₂指示，存在2个重链，所述轻链未融合其它物质。

在融合蛋白“mAb 0012-(hTF.1-219-L4b-LC)₂;HC₂”中：

· (hTF.1-219-L4b-LC)₂指示，hTF.1-219的C-端与连接物L4b融合，所述连接物L4b与轻链的N-端末端融合。

表4: mAb-TF融合蛋白的非限制性实例

在表5中提供了合适的融合蛋白（其中(ii)是Fab片段）的实例。TF可以与mAb的HC融合；TF可以与mAb的LC融合。TF可以与配体融合，所述配体又与mAb的HC或mAb的LC融合。下面是如何解释在表5中提供的融合蛋白的名称的实例：

在融合蛋白“Fab 0012-V_H-CH1-L0-hTF.1-219;LC-HPC4”中：

· ”Fab 0012”: mAb 0012的Fab片段。

· ”V_H-CH1-L0-hTF.1-219”: hTF.1-219的N-端与Fab片段的V_H-CH1 结构域的C-端直接融合。

· “HPC4”: 一个纯化标签位于轻链的N-端。

在融合蛋白“Fab 0012-hTF.1-219-L4b-V_H-CH1;LC-HPC4”中：

· ”hTF.1-219-L4b- V_H-CH1”：指示，组织因子的C-端与连接物4b的N-端融合，所述连接物4b与Fab片段的V_H-CH1结构域融合。

表5: Fab-TF融合蛋白的非限制性实例

如上所述，本发明的融合蛋白能够结合在经历活化的血小板上存在的受体，诸如TLT-1。术语“结合亲和力”意图表示融合蛋白或融合蛋白的抗体组分的结合或不结合它们的靶物的性质。通过测定抗体组分和它的靶物的结合常数(K_D)，可以量化结合亲和力。类似地，以与抗体和另一种非靶物分子的结合常数相比抗体对它的靶物的对比结合常数(K_D)的方式，可以定义抗体组分对它的靶物的结合特异性。

通常，抗体相对于靶物的K_D是相对于其它非靶物分子（诸如无关的物质或环境中的伴随的物质）的K_D的1/2、优选1/5、更优选1/10。更优选地，所述K_D是相对于其它非靶物分子的K_D的1/50、甚至更优选1/100、更优选1/200。

通过众所周知的方法，可以直接测定该结合常数的值，且通过诸如在例如Caceci等人(Byte 9:340-362, 1984)中所述的那些方法，甚至可以计算复杂混合物的值。例如，使用双滤器硝酸纤维素滤膜结合试验，诸如Wong & Lohman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5428-5432, 1993)公开的试验，可以建立K_D。用于评价配体（诸如抗体）对靶物的结合能力的其它标准试验是本领域已知的，包括例如，ELISA、蛋白印迹、RIA和流式细胞术分析。通过本领域已知的标准试验，诸如通过表面等离子体共振(SPR)分析，也可以评估抗体的结合动力学(例如，结合亲和力)。

可以进行竞争性结合试验，其中将抗体对靶物的结合与所述靶物的另一种已知配体（诸如另一种抗体）对所述靶物的结合相对比。

本发明的配体（诸如抗体或其片段）的K_D值也可以是至少1 x 10^-15M、诸如至少1 x 10^-14M，诸如至少1 x 10^-13M，诸如至少1 x 10^-12M，诸如至少1 x 10^-11M，诸如至少1 x 10^-10M，诸如大约3 x 10^-9M，诸如至少1 x 10^-9M或至少1 x 10^-8M。本发明的抗体对它的靶物的Kd (或Ki)可以是1 x 10^-7M或更小、1 x 10^-8M或更小或1 x 10^-9M或更小。

本发明的配体（诸如抗体或其片段）的优选的K_D值可以是1 x 10^-15M至1 x 10^-14M，诸如1 x 10^-14M至1 x 10^-13M、1 x 10^-13M至1 x 10^-12M，诸如1 x 10^-12M至1 x 10^-11M，诸如1 x 10^-11M至1 x 10^-10M，诸如1 x 10^-10M至1 x 10^-9M，诸如大约3 x 10^-9M，诸如1 x 10^-9M至2 x 10^-8M。

特异性地结合它的靶物的抗体可以以高亲和力（诸如上面讨论的K_D）结合它的靶物，且可以以更低的亲和力结合其它的非靶物分子。例如，所述抗体可以以1 x 10^-6M或更大、更优选1 x 10^-5 M或更大、更优选1 x 10^-4 M或更大、更优选1 x 10^-3 M或更大、甚至更优选1 x 10^-2 M或更大的K_D结合非靶物分子。本发明的抗体优选地能够以下述亲和力结合它的靶物：所述亲和力是它对另一种非靶物分子（诸如除了TLT-1以外的其它TREM）的结合亲和力的至少2倍、10倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍或10,000倍或更高。

如上所述，融合蛋白可以包含组织因子-样组分，所述组分与组织因子的胞外结构域或其变体具有至少90%同一性。如本领域已知的，术语“同一性”表示2个或更多个多肽的序列之间的关系，这通过对比所述序列测得。在本领域中，“同一性”也表示多肽之间的序列相关性程度，这通过2个或更多个氨基酸残基的串之间的匹配数目测得。“同一性”会度量2个或更多个序列中的更小者之间的相同匹配的百分比，其中通过特定数学模型或计算机程序(即，“算法”)实现缺口比对(如果有的话)。通过已知的方法，可以容易地计算相关多肽的同一性。这样的方法包括、但不限于在下述参考文献中描述的那些方法：Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., 编, Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., 编, Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, 第1部分, Griffin, A. M.,和Griffin, H. G., 编, Humana Press, New Jersey, 1994；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987；Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.和Devereux, J., 编, M. Stockton Press, New York, 1991；和Carillo等人, SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988)。

用于测定同一性的优选方法被设计成产生待测序列之间的最大匹配。测定同一性的方法被描述在公众可得到的计算机程序中。用于测定2个序列之间的同一性的优选计算机程序方法包括GCG程序包，包括GAP (Devereux等人, Nucl. Acid. Res. 12, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)、BLASTP、BLASTN和FASTA (Altschul等人, J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990))。BLASTX程序可从国家生物技术信息中心(NCBI)和其它来源(BLAST Manual, Altschul等人NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul等人, 同上)公开得到。众所周知的Smith Waterman算法也可以用于测定同一性。

例如，使用计算机算法GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)，可以关于它们的各个氨基酸的最佳匹配(通过所述算法测得的“匹配的跨度”)，比对要测定序列同一性百分比的2个多肽。与所述算法结合使用缺口空缺罚分(将其计算为3x所述对角线均值；“对角线均值”是使用的对比矩阵的对角线的均值；“对角线”是由特定对比矩阵分配给每个完美氨基酸匹配的评分或数字)和缺口延伸罚分(它通常是{分数(1/10)}x缺口空缺罚分)以及对比矩阵（诸如PAM 250或BLOSUM 62）。所述算法也使用标准的对比矩阵(关于PAM 250 对比矩阵，参见Dayhoff等人, Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp.3 (1978)；关于BLOSUM 62 对比矩阵，参见Henikoff等人, Proc. Natl. Acad. Sci USA 89, 10915-10919 (1992))。

用于肽序列对比的优选参数包括下述的：算法：Needleman等人, J. Mol. Biol. 48, 443-453 (1970)；对比矩阵：来自Henikoff等人, PNAS USA 89, 10915-10919 (1992)的BLOSUM 62；缺口罚分：12，缺口长度罚分：4，相似性的阈值：0。

GAP程序可以使用上述参数。前述参数是使用GAP算法进行肽对比的默认参数(与末端缺口没有罚分一起)。

借助于各种体外和体内实验，可以评估本发明的融合蛋白的功能效果。可以将体外实验设计成评估融合蛋白（作为整体以及作为它们的组分(i) TF和(ii)配体部分）的功能。在实施例中详细地描述了这样的实验。这些包括测试下述能力的方法：

· 融合蛋白结合FVII/FVIIa的能力；

· 融合蛋白的TF组分选择性地增强活化的血小板上的FVIIa-介导的FX活化的能力；

· 融合蛋白的TF组分增强富含TLT-1的磷脂囊泡上的FVIIa-介导的FX活化的能力；

· 融合蛋白的促进富含血友病-样血小板的血浆中的纤维蛋白凝块形成的能力；

· 融合蛋白的促进血友病-样全血中的纤维蛋白凝块形成的能力；

在体内，可以在输入了人血小板的血友病小鼠的尾出血模型中测试融合蛋白。此外，在体内，可以在插入了人TLT-1基因(“人源化的”TLT-1)的血友病小鼠的尾出血模型中测试融合蛋白。

本发明也涉及编码本发明的抗体的多核苷酸。因而，本发明的多核苷酸可以编码本文所述的任意抗体。术语“核酸分子”和“多核苷酸”在本文中互换使用，表示任意长度的聚合形式的核苷酸，无论是脱氧核糖核苷酸还是核糖核苷酸或它们的类似物。多核苷酸的非限制性实例包括基因、基因片段、信使RNA (mRNA)、cDNA、重组多核苷酸、质粒、载体、分离的任意序列的DNA、分离的任意序列的RNA、核酸探针和引物。本发明的多核苷酸可以以分离的或纯化的形式提供。

“编码”选择的多肽的核酸序列是这样的核酸分子：当置于适当调节序列控制下时，其在体内被转录(在DNA的情况下)和翻译(在mRNA的情况下)成多肽。编码序列的边界由在5' (氨基)末端处的起始密码子和在3' (羧基)末端处的翻译终止密码子决定。为了本发明的目的，这样的核酸序列可以包括、但不限于：来自病毒、原核或真核mRNA的cDNA，来自病毒或原核DNA或RNA的基因组序列，和甚至合成的DNA序列。转录终止序列可以位于编码序列的3'侧。

根据本领域众所周知的方法，例如如在Sambrook等人(1989, Molecular Cloning - a laboratory manual; Cold Spring Harbor Press)中所述，可以合成本发明的多核苷酸。

本发明的核酸分子可以以表达盒的形式提供，所述表达盒包括可操作地连接到插入的序列上的控制序列，因而允许在体内表达本发明的抗体。这些表达盒通常又提供在载体(例如，质粒或重组病毒载体)内。这样的表达盒可以直接地施用给宿主受试者。或者，可以将包含本发明的多核苷酸的载体施用给宿主受试者。优选地，使用遗传载体，制备和/或施用所述多核苷酸。合适的载体可以是能够携带足够量的遗传信息并允许表达本发明多肽的任意载体。

本发明因而包括包含这样的多核苷酸序列的表达载体。在分子生物学领域中，常规地构建这样的表达载体，且可以例如包括使用质粒DNA和适当的起始子、启动子、增强子和其它元件，例如可能必要的聚腺苷酸化信号，且它们以正确的朝向放置，以便允许表达本发明的肽。其它合适的载体是本领域技术人员显而易见的。作为这方面的其它实例，我们提及Sambrook等人。

本发明也包括分离的细胞，所述细胞已经被修饰成表达根据本发明的构建体。这样的细胞包括瞬时的、或优选地稳定的高等真核细胞系，诸如哺乳动物细胞或昆虫细胞；低等真核细胞，诸如酵母；或原核细胞诸如细菌细胞。可以通过插入编码本发明构建体的载体或表达盒而修饰的细胞的具体实例包括：哺乳动物HEK293T、CHO、HeLa和COS细胞。优选地，选择的细胞系是这样的：其不仅是稳定的，而且允许多肽的成熟糖基化和细胞表面表达。

使用常规方法，可以培养本发明的这样的细胞系，以生产根据本发明的融合蛋白、抗体或构建体。或者，可以将本发明多核苷酸、表达盒或载体离体地施用给来自受试者的细胞，然后将所述细胞返回受试者的体内。

在另一个方面，本发明提供了组合物和制剂，其包含本发明的分子，诸如本文所述的融合蛋白、多核苷酸、载体和细胞。例如，本发明提供了一种药物组合物，其包含与药学上可接受的载体一起配制的一种或多种本发明的融合蛋白。

因此，本发明的一个目的是，提供一种药学制剂，其包含以0.25 mg/ml-250 mg/ml的浓度存在的抗体，且其中所述制剂具有2.0-10.0的pH。所述制剂可以另外包含缓冲液系统、防腐剂、等渗剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂。防腐剂、等渗剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂在药物组合物中的应用是技术人员众所周知的。可以参考：Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995。

在一个实施方案中，所述药学制剂是水性制剂。这样的制剂通常是溶液或混悬液。术语“水性制剂”被定义为包含至少50%w/w水的制剂。同样地，术语“水性溶液”被定义为包含至少50%w/w水的溶液，术语“水性混悬液”被定义为包含至少50%w/w水的混悬液。

在另一个实施方案中，所述药学制剂是冷冻干燥的制剂，在使用之前，医师或患者向其中加入溶剂和/或稀释剂。

在另一个方面，所述药学制剂包含这样的抗体和缓冲剂的水性溶液，其中所述抗体以1 mg/ml或以上的浓度存在，且其中所述制剂具有约2.0至约10.0的pH。

本文使用的术语“治疗”表示有此需要的任意人或其它动物受试者的医学治疗。预期所述受试者已经经历[兽医]医学从业人员的体格检查，所述从业人员已经给出暂时的或最终的诊断，所述诊断指示：所述特定治疗的使用对所述人或其它动物受试者的健康有益。所述治疗的时机和目的可以随个体不同而异，取决于受试者的健康现状。因而，所述治疗可以是预防性的、治标的、针对症状的和/或治愈的。

关于本发明，预防性的、治标的、针对症状的和/或治愈的治疗可以代表本发明的单独方面。

正常凝血连锁的任意促凝血组分的任意定性或定量缺乏，或纤维蛋白溶解的任意上调，可以造成导致增加的出血倾向的凝血病。这样的凝血病可以是先天性的和/或获得性的和/或医源性的，且本领域技术人员会鉴别出。

先天性的低凝血病的非限制性实例是A型血友病、B型血友病、因子VII缺乏、因子X缺乏、因子XI缺乏、血管性血友病和血小板减少症，诸如Glanzmann氏血小板无力症和巨血小板综合征。

获得性凝血病的一个非限制性实例是由维生素K缺乏造成的丝氨酸蛋白酶缺乏；这样的维生素K-缺乏可以由维生素K拮抗剂（诸如华法林）的施用造成。获得性的凝血病也可以发生在大面积创伤以后。在该情况下，或者称作“出血性恶性循环”，其特征在于血稀释(稀释性血小板减少和凝血因子的稀释)、低体温、凝血因子的消耗和代谢紊乱(酸中毒)。输液疗法和增加的纤维蛋白溶解可能恶化该情形。所述出血可以来自身体的任意部分。

具有“抑制剂”(也就是说，针对因子VIII的同种异体抗体)的A型血友病和具有“抑制剂”(也就是说，针对因子IX的同种异体抗体)的B型血友病，是部分先天性的和部分获得性的凝血病的非限制性实例。

医源性凝血病的一个非限制性实例是，抗凝血药物（诸如肝素、阿司匹林、华法林和其它血小板聚集抑制剂）的超量给药，所述药物可以开处方用于治疗血栓栓塞性疾病。医源性凝血病的第二个非限制性实例是由过度的和/或不适当的输液疗法诱发的凝血病，诸如可以由输血诱发的凝血病。

在本发明的一个实施方案中，出血与A型或B型血友病有关。在另一个实施方案中，出血与具有获得性抑制剂的A型或B型血友病有关。在另一个实施方案中，出血与血管性血友病有关。在另一个实施方案中，出血与严重组织损伤有关。在另一个实施方案中，出血与严重创伤有关。在另一个实施方案中，出血与外科手术有关。在另一个实施方案中，出血与出血性胃炎和/或肠炎有关。在另一个实施方案中，所述出血是血崩，诸如在胎盘早剥中。在另一个实施方案中，出血发生在具有有限的机械止血可能性的器官中，诸如颅内地、耳内地或眼内地。在另一个实施方案中，出血与抗凝血药治疗有关。

在另一个实施方案中，出血可以与血小板减少症有关。在具有血小板减少症的个体中，本发明的构建体可以与血小板共同施用。

实施方案

下面是本发明实施方案的非限制性列表：

实施方案1: 一种融合蛋白，其包含：(i)至少一种组织因子多肽或其生物学功能变体或片段，和(ii)配体，所述配体能够结合(iii)受体和/或其片段或变体，其中所述受体仅存在于活化的血小板的表面上。

实施方案2: 根据实施方案1所述的融合蛋白，其中(iii)是TLT-1或其片段或变体。

实施方案3: 根据实施方案2所述的融合蛋白，其中(iii)是TLT-1 (16-162)。

实施方案4: 根据实施方案2所述的融合蛋白，其中(iii)是TLT-1 (20-125)。

实施方案5: 根据实施方案2所述的融合蛋白，其中(iii)是TLT-1 (126-162)。

实施方案6: 根据实施方案1-5中任一个所述的融合蛋白，其中(i)是单一组织因子多肽或其生物学功能变体或片段。

实施方案7: 根据实施方案1-5中任一个所述的融合蛋白，其中(i)是2种组织因子多肽或其生物学功能变体或片段。

实施方案8: 根据实施方案6-7中任一个所述的融合蛋白，其中(i)是TF (1-219)。

实施方案9: 根据实施方案6-7中任一个所述的融合蛋白，其中(i)是sTF(6-209)。

实施方案10: 根据实施方案6-7中任一个所述的融合蛋白，其中(i)是sTF(1-209)。

实施方案11: 根据实施方案6-7中任一个所述的融合蛋白，其中(i)是sTF (1-210)。

实施方案12: 根据实施方案6-7中任一个所述的融合蛋白，其中(i)是sTF (1-211)。

实施方案13: 根据实施方案6-7中任一个所述的融合蛋白，其中(i)是sTF (1-212)。

实施方案14: 根据实施方案6-7中任一个所述的融合蛋白，其中(i)是sTF (1-213)。

实施方案15: 根据实施方案6-7中任一个所述的融合蛋白，其中(i)是sTF (1-214)。

实施方案16: 根据实施方案6-7中任一个所述的融合蛋白，其中(i)是sTF (1-215)。

实施方案17: 根据实施方案6-7中任一个所述的融合蛋白，其中(i)是sTF (1-216)。

实施方案18: 根据实施方案6-7中任一个所述的融合蛋白，其中(i)是sTF (1-217)。

实施方案19: 根据实施方案6-7中任一个所述的融合蛋白，其中(i)是sTF (1-218)。

实施方案20: 根据实施方案6-7中任一个所述的融合蛋白，其中(i)是sTF (1-219)。

实施方案21: 根据实施方案1-20中任一个所述的融合蛋白，其中(ii)是单克隆抗体或其片段。

实施方案22: 根据实施方案21所述的融合蛋白，其中(ii)是Fab片段、F(ab')₂片段、Fab’片段、Fd片段、Fv片段、ScFv片段、dAb片段或分离的互补性决定区(CDR)。

实施方案23: 根据实施方案22所述的融合蛋白，其中(ii)是Fab片段。

实施方案24: 根据实施方案21-23中任一个所述的融合蛋白，其中(ii)的表位包含一个或多个选自下述的残基：SEQ ID NO: 5的V17、Q18、C19、H20、Y21、R22、L23、Q24、D25、V26、K27、A28、L63、G64、G65、G66、L67、L68、G89、A90、R91、G92、P93、Q94、I95和L96。

实施方案25: 根据实施方案21-23中任一个所述的融合蛋白，其中(ii)是能够结合与mAb 0023相同的表位的抗体或其片段。

实施方案26: 根据实施方案24-25中任一个所述的融合蛋白，其中所述(ii)的重链包含：

· SEQ ID NO: 41的氨基酸50-54(DYFMY)的CDR1序列，其中这些氨基酸之一可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 41的氨基酸69-85(YISNGGDSSSYPDTVKG)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个、2个、3个或4个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 41的氨基酸118-129(NKNWDDYYDMDY)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换。

实施方案27: 根据实施方案24-26中任一个所述的融合蛋白，其中所述(ii)的轻链包含：

· SEQ ID NO: 42的氨基酸44-60(KSSQSLLNSRTRKNYLA)的CDR1序列，其中这些氨基酸中的1个、2个、3个或4个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 42的氨基酸76-82(WASTRES)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 42的氨基酸115-122(KQSYNLLT)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换。

实施方案28: 根据实施方案24-25中任一个所述的融合蛋白，其中所述(ii)的重链包含：

· SEQ ID NO: 41的氨基酸50-54(DYFMY)的CDR1序列，其中这些氨基酸之一可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 41的氨基酸69-85(YISNGGDSSSYPDTVKG)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个、2个、3个或4个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 41的氨基酸118-129(NKNWDDYYDMDY)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换；

且其中所述(ii)的轻链包含：

· SEQ ID NO: 42的氨基酸44-60(KSSQSLLNSRTRKNYLA)的CDR1序列，其中这些氨基酸中的1个、2个、3个或4个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 42的氨基酸76-82(WASTRES)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 42的氨基酸115-122(KQSYNLLT)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换。

实施方案29: 根据实施方案28所述的融合蛋白，其中所述(ii)的重链包含：

· SEQ ID NO: 41的氨基酸50-54(DYFMY)的CDR1序列；和

· SEQ ID NO: 41的氨基酸69-85(YISNGGDSSSYPDTVKG)的CDR2序列；和

· SEQ ID NO: 41的氨基酸118-129(NKNWDDYYDMDY)的CDR3序列，

且其中所述(ii)的轻链包含：

· SEQ ID NO: 42的氨基酸44-60(KSSQSLLNSRTRKNYLA)的CDR1序列；和

· SEQ ID NO: 42的氨基酸76-82(WASTRES)的CDR2序列；和

· SEQ ID NO: 42的氨基酸115-122(KQSYNLLT)的CDR3序列。

实施方案30: 根据实施方案21-23中任一个所述的融合蛋白，其中(ii)的表位包含一个或多个选自下述的残基：SEQ ID NO: 5的L36、P37、E38、G39、C40、Q41、P42、L43、V44、S45、S46、A47、V73、T74、L75、Q76、E77、E78、D79、A80、G81、E82、Y83、G84、C85、M86、R91、G92、P93、Q94、I95、L96、H97、R98、V99、S110和L111。

实施方案31: 根据实施方案21-23中任一个所述的融合蛋白，其中(ii)是能够结合与mAb 0051相同的表位的抗体或其片段。

实施方案32: 根据实施方案30-31中任一个所述的融合蛋白，其中所述(ii)的重链包含：

· SEQ ID NO: 43的氨基酸50-54(DYSMH)的CDR1序列，其中这些氨基酸之一可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 43的氨基酸69-85(VISTYYGDVRYNQKFKG)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个、2个、3个或4个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 43的氨基酸118-129(APMITTGAWFAY)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换。

实施方案33: 根据实施方案30-32中任一个所述的融合蛋白，其中所述(ii)的轻链包含：

· SEQ ID NO: 44的氨基酸44-54(KASQSVSNDVA)的CDR1序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 44的氨基酸70-76(YASSRYT)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 44的氨基酸109-117(QQDYSSPYT)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换。

实施方案34: 根据实施方案30-31中任一个所述的融合蛋白，其中所述(ii)的重链包含：

· SEQ ID NO: 43的氨基酸50-54(DYSMH)的CDR1序列，其中这些氨基酸之一可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 43的氨基酸69-85(VISTYYGDVRYNQKFKG)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个、2个、3个或4个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 43的氨基酸118-129(APMITTGAWFAY)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换；

且其中所述(ii)的轻链包含：

· SEQ ID NO: 44的氨基酸44-54(KASQSVSNDVA)的CDR1序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 44的氨基酸70-76(YASSRYT)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 44的氨基酸109-117(QQDYSSPYT)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换。

实施方案35: 根据实施方案34所述的融合蛋白，其中所述(ii)的重链包含：

· SEQ ID NO: 43的氨基酸50-54(DYSMH)的CDR1序列；和

· SEQ ID NO: 43的氨基酸69-85(VISTYYGDVRYNQKFKG)的CDR2序列；和

· SEQ ID NO: 43的氨基酸118-129(APMITTGAWFAY)的CDR3序列；

且其中所述(ii)的轻链包含：

· SEQ ID NO: 44的氨基酸44-54(KASQSVSNDVA)的CDR1序列；和

· SEQ ID NO: 44的氨基酸70-76(YASSRYT)的CDR2序列；和

· SEQ ID NO: 44的氨基酸109-117(QQDYSSPYT)的CDR3序列。

实施方案36: 根据实施方案21-23中任一个所述的融合蛋白，其中(ii)的表位包含一个或多个选自下述的残基：SEQ ID NO: 5的V17、Q18、C19、H20、Y21、R22、L23、Q24、D25、V26、K27、A28、R91、G92、P93、Q94、I95、L96、H97、R98、V99、S100和L101。

实施方案37: 根据实施方案21-23中任一个所述的融合蛋白，其中(ii)是能够结合与mAb 0062相同的表位抗体或其片段。

实施方案38: 根据实施方案36-37中任一个所述的融合蛋白，其中所述(ii)的重链包含：

· SEQ ID NO: 49的氨基酸50-54(SHWIE)的CDR1序列，其中这些氨基酸之一可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 49的氨基酸69-85(EILPGSGNTNYNEKFKG)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个、2个、3个或4个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 49的氨基酸118-130(GYYGLNYDWYFDV)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换。

实施方案39: 根据实施方案36-38中任一个所述的融合蛋白，其中所述(ii)的轻链包含：

· SEQ ID NO: 46的氨基酸44-54(RASQDISNYLN)的CDR1序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 46的氨基酸70-76(YTSRLHS)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 46的氨基酸109-117(QQDTKLPYT)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换。

实施方案40: 根据实施方案36-39中任一个所述的融合蛋白，其中所述(ii)的重链包含：

· SEQ ID NO: 49的氨基酸50-54(SHWIE)的CDR1序列，其中这些氨基酸之一可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 49的氨基酸69-85(EILPGSGNTNYNEKFKG)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个、2个、3个或4个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 49的氨基酸118-130(GYYGLNYDWYFDV)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换；

且其中所述(ii)的轻链包含：

· SEQ ID NO: 46的氨基酸44-54(RASQDISNYLN)的CDR1序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 46的氨基酸70-76(YTSRLHS)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 46的氨基酸109-117(QQDTKLPYT)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换。

实施方案41: 根据实施方案40所述的融合蛋白，其中所述(ii)的重链包含：

· SEQ ID NO: 49的氨基酸50-54(SHWIE)的CDR1序列；和

· SEQ ID NO: 49的氨基酸69-85(EILPGSGNTNYNEKFKG)的CDR2序列；和

· SEQ ID NO: 49的氨基酸118-130(GYYGLNYDWYFDV)的CDR3序列；

且其中所述(ii)的轻链包含：

· SEQ ID NO: 46的氨基酸44-54(RASQDISNYLN)的CDR1序列；和

· SEQ ID NO: 46的氨基酸70-76(YTSRLHS)的CDR2序列；和

· SEQ ID NO: 46的氨基酸109-117(QQDTKLPYT)的CDR3序列。

实施方案42: 根据实施方案21-23中任一个所述的融合蛋白，其中(ii)的表位包含一个或多个选自下述的残基：SEQ ID NO: 7的E5、T6、H7、K8、I9、G10、S11、L12、A13、E14、N15、A16、F17、S18、D19、P20和A21。

实施方案43: 根据实施方案42 所述的融合蛋白，其中所述残基是K8、I9、G10、S11、L12、A13、N15、A16、F17、S18、D19、P20和A21。

实施方案44: 根据实施方案21-23中任一个所述的融合蛋白，其中(ii)的表位包含一个或多个选自下述的残基：SEQ ID NO: 6的K118、I119、G120、S121、L122、A123、E124、N125、A126、F127。

实施方案45: 根据实施方案21-23中任一个所述的融合蛋白，其中(ii)是能够结合与mAb 0061或mAb 0082相同的表位抗体或其片段。

实施方案46: 根据实施方案42-45中任一个所述的融合蛋白，其中所述(ii)的重链包含：

· SEQ ID NO: 47的氨基酸49-53(RYWMT)的CDR1序列，其中这些氨基酸之一可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 47的氨基酸68-84(EINPDSSTINYNPSLKD)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个、2个、3个或4个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 47的氨基酸117-121(GVFTS)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换。

实施方案47: 根据实施方案42-46中任一个所述的融合蛋白，其中所述(ii)的轻链包含：

· SEQ ID NO: 48的氨基酸43-58(RSSQSLVHRNGNTYFH)的CDR1序列，其中这些氨基酸中的1个、2个、3个或4个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 48的氨基酸74-80(KVSNRFS)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 48的氨基酸113-121(SQSTHVPYT)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换。

实施方案48: 根据实施方案42-47中任一个所述的融合蛋白，其中所述(ii)的重链包含：

· SEQ ID NO: 47的氨基酸49-53(RYWMT)的CDR1序列，其中这些氨基酸之一可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 47的氨基酸68-84(EINPDSSTINYNPSLKD)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个、2个、3个或4个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 47的氨基酸117-121(GVFTS)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换；

且其中所述(ii)的轻链包含：

· SEQ ID NO: 48的氨基酸43-58(RSSQSLVHRNGNTYFH)的CDR1序列，其中这些氨基酸中的1个、2个、3个或4个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 48的氨基酸74-80(KVSNRFS)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 48的氨基酸113-121(SQSTHVPYT)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换。

实施方案49: 根据实施方案48所述的融合蛋白，其中所述(ii)的重链包含：

· SEQ ID NO: 47的氨基酸49-53(RYWMT)的CDR1序列；和

· SEQ ID NO: 47的氨基酸68-84(EINPDSSTINYNPSLKD)的CDR2序列；和

· SEQ ID NO: 47的氨基酸117-121(GVFTS)的CDR3序列；

且其中所述(ii)的轻链包含：

· SEQ ID NO: 48的氨基酸43-58(RSSQSLVHRNGNTYFH)的CDR1序列；和

· SEQ ID NO: 48的氨基酸74-80(KVSNRFS)的CDR2序列；和

· SEQ ID NO: 48的氨基酸113-121(SQSTHVPYT)的CDR3序列。

实施方案50: 根据实施方案42-45中任一个所述的融合蛋白，其中所述(ii)的重链包含：

· SEQ ID NO: 50的氨基酸49-53(RYWMT)的CDR1序列，其中这些氨基酸之一可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 50的氨基酸68-84(EINPDSSTINYAPSLKD)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个、2个、3个或4个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 50的氨基酸117-121(GVFTS)的CDR3序列，其中这些氨基酸之一可以被不同的氨基酸置换；

且其中所述(ii)的轻链包含：

· SEQ ID NO: 48的氨基酸43-58(RSSQSLVHRNGNTYFH)的CDR1序列，其中这些氨基酸中的1个、2个、3个或4个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 48的氨基酸74-80(KVSNRFS)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 48的氨基酸113-121(SQSTHVPYT)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换。

实施方案51: 根据实施方案50所述的融合蛋白，其中所述(ii)的重链包含：

· SEQ ID NO: 50的氨基酸49-53(RYWMT)的CDR1序列；和

· SEQ ID NO: 50的氨基酸68-84(EINPDSSTINYAPSLKD)的CDR2序列；和

· SEQ ID NO: 50的氨基酸117-121(GVFTS)的CDR3序列；

且其中所述(ii)的轻链包含：

· SEQ ID NO: 48的氨基酸43-58(RSSQSLVHRNGNTYFH)的CDR1序列；和

· SEQ ID NO: 48的氨基酸74-80(KVSNRFS)的CDR2序列；和

· SEQ ID NO: 48的氨基酸113-121(SQSTHVPYT)的CDR3序列。

实施方案52: 根据实施方案21-23中任一个所述的融合蛋白，且其中(ii)的互补位包含一个或多个选自下述的残基：抗-TLT-1轻(L)链(SEQ ID NO: 40)的H50、N52、Y56、H58、Y73、F79、S115、T116、V118和Y120，和抗-TLT-1重(H)链(SEQ ID NO: 39)的残基V20、F45、R49、Y50、W51、E68、T75、N77、S116、G117、V118和T120。

实施方案53: 根据实施方案21-23和52中任一个所述的融合蛋白，其中(ii)的表位包含一个或多个选自下述的残基：SEQ ID NO: 4的K133、I134、G135、S136、L137、A138、N140、A141、F142、S143、D144、P145和A146。

实施方案54: 根据实施方案21-23中任一个所述的融合蛋白，其中(ii)是能够结合与mAb 0012相同的表位的抗体或其片段。

实施方案55: 根据实施方案52-54中任一个所述的融合蛋白，其中所述(ii)的重链包含：

· SEQ ID NO: 39的氨基酸49-53(RYWMT)的CDR1序列，其中这些氨基酸之一可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 39的氨基酸68-84(EINPDSSTINYTPSLKD)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个、2个、3个或4个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 39的氨基酸117-121(GVFTS)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换。

实施方案56: 根据实施方案52-55中任一个所述的融合蛋白，其中所述(ii)的轻链包含：

· SEQ ID NO: 40的氨基酸43-58(RSSQSLVHRNGNTYFH)的CDR1序列，其中这些氨基酸中的1个、2个、3个或4个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 40的氨基酸74-80(KVSNRFS)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 40的氨基酸113-121(SQSTHVPYT)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换。

实施方案57: 根据实施方案52-56中任一个所述的融合蛋白，其中所述(ii)的重链包含：

· SEQ ID NO: 39的氨基酸49-53(RYWMT)的CDR1序列，其中这些氨基酸之一可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 39的氨基酸68-84(EINPDSSTINYTPSLKD)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个、2个、3个或4个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 39的氨基酸117-121(GVFTS)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换；

且其中所述(ii)的轻链包含：

· SEQ ID NO: 40的氨基酸43-58(RSSQSLVHRNGNTYFH)的CDR1序列，其中这些氨基酸中的1个、2个、3个或4个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 40的氨基酸74-80(KVSNRFS)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 40的氨基酸113-121(SQSTHVPYT)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换。

实施方案58: 根据实施方案57所述的融合蛋白，其中所述(ii)的重链包含：

· SEQ ID NO: 39的氨基酸49-53(RYWMT)的CDR1序列；和

· SEQ ID NO: 39的氨基酸68-84(EINPDSSTINYTPSLKD)的CDR2序列；和

· SEQ ID NO: 39的氨基酸117-121(GVFTS)的CDR3序列；

且其中所述(ii)的轻链包含：

· SEQ ID NO: 40的氨基酸43-58(RSSQSLVHRNGNTYFH)的CDR1序列；和

· SEQ ID NO: 40的氨基酸74-80(KVSNRFS)的CDR2序列；和

· SEQ ID NO: 40的氨基酸113-121(SQSTHVPYT)的CDR3序列。

实施方案59: 根据实施方案21-23中任一个所述的融合蛋白，其中所述(ii)的重链包含：

· SEQ ID NO: 56的氨基酸50-54(NYWLG)的CDR1序列，其中这些氨基酸之一可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 56的氨基酸69-85(DIYPGGGYNKYNENFKG)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个、2个、3个或4个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 56的氨基酸118-128(EYGNYDYAMDS)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换。

实施方案60: 根据实施方案21-23和59中任一个所述的融合蛋白，其中所述(ii)的轻链包含：

· SEQ ID NO: 57的氨基酸44-59(RSSRSLLHSNGNTYLC)的CDR1序列，其中这些氨基酸中的1个、2个、3个或4个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 57的氨基酸75-81(RMSNLAS)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 57的氨基酸114-122(MQHLEYPFT)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换。

实施方案61: 根据实施方案21-25、30-31、36-37、42-45和52-54中任一个所述的融合蛋白，其中(ii)是人单克隆抗体或其片段。

实施方案62: 根据实施方案1-60中任一个所述的融合蛋白，其中(ii)是嵌合的抗体或其片段。

实施方案63: 根据实施方案1-60中任一个所述的融合蛋白，其中(ii)是人源化的抗体或其片段。

实施方案64: 根据实施方案1-63中任一个所述的融合蛋白，其中(ii)的同种型是IgG。

实施方案65: 根据实施方案64所述的融合蛋白，其中所述同种型是IgG1、IgG2或IgG4。

实施方案66: 根据实施方案65所述的融合蛋白，其中所述同种型是IgG4。

实施方案67: 根据实施方案1-66中任一个所述的融合蛋白，其另外包含在(i)和(ii)之间的连接物。

实施方案68: 根据实施方案1-67中任一个所述的融合蛋白，其中(ii)具有小于100 nM、诸如小于10 nM的K_D。

实施方案69: 根据实施方案1-68中任一个所述的融合蛋白，其刺激FVIIa-介导的FX活化至少10%。

实施方案70: 一种使组织因子或其功能片段靶向活化的血小板的表面的方法，所述方法包括：使活化的血小板接触根据实施方案1-69中任一个所述的融合蛋白。

实施方案71: 用作药物的根据实施方案1-67中任一个所述的融合蛋白。

实施方案72: 用作促凝血剂的如实施方案71所述的融合蛋白。

实施方案73: 一种药学制剂，其包含根据实施方案1-69中任一个所述的融合蛋白。

实施方案74: 用于治疗凝血病的根据实施方案1-69中任一个所述的融合蛋白或根据实施方案73所述的药学制剂。

实施方案75: 根据实施方案72所述的融合蛋白，其中所述凝血病是具有或没有抑制剂的A型血友病和具有或没有抑制剂的B型血友病。

实施方案76: 一种治疗凝血病的方法，所述方法包括：给有此需要的个体施用有效量的根据实施方案1-67 中任一个所述的融合蛋白。

实施方案77: 根据实施方案76所述的方法，其中所述凝血病是具有或没有抑制剂的A型血友病和具有或没有抑制剂的B型血友病。

实施方案78: 一种多核苷酸，其编码根据实施方案1-69中任一个的融合蛋白。

实施方案79: 一种分离的细胞，其包含根据实施方案1-67中任一个所述的融合蛋白和/或根据实施方案78所述的多核苷酸。

实施方案80: 一种能够结合TLT-1或其片段的单克隆抗体或其片段，其中(ii)的互补位包含一个或多个选自下述的残基：抗-TLT-1轻(L)链(SEQ ID NO: 40)的H50、N52、Y56、H58、Y73、F79、S115、T116、V118和Y120，和抗-TLT-1重(H)链(SEQ ID NO: 39)的残基V20、F45、R49、Y50、W51、E68、T75、N77、S116、G117、V118和T120。

实施方案81: 一种能够结合TLT-1或其片段的单克隆抗体或其片段，其中(ii)的表位包含一个或多个选自下述的残基：SEQ ID NO: 4的K133、I134、G135、S136、L137、A138、N140、A141、F142、S143、D144、P145和A146。

实施方案82: 一种能够结合TLT-1或其片段的单克隆抗体或其片段，其中所述单克隆抗体的表位包含一个或多个选自下述的残基：SEQ ID NO: 5的V17、Q18、C19、H20、Y21、R22、L23、Q24、D25、V26、K27、A28、L63、G64、G65、G66、L67、L68、G89、A90、R91、G92、P93、Q94、I95和L96。

实施方案83: 一种能够结合TLT-1或其片段的单克隆抗体或其片段，其中所述单克隆抗体的表位包含一个或多个选自下述的残基：SEQ ID NO: 5的L36、P37、E38、G39、C40、Q41、P42、L43、V44、S45、S46、A47、V73、T74、L75、Q76、E77、E78、D79、A80、G81、E82、Y83、G84、C85、M86、R91、G92、P93、Q94、I95、L96、H97、R98、V99、S110和L111。

实施方案84: 一种融合蛋白，其包含能够结合TLT-1或其片段或变体的单克隆抗体或其片段，其中所述单克隆抗体的表位包含一个或多个选自下述的残基：SEQ ID NO: 5的V17、Q18、C19、H20、Y21、R22、L23、Q24、D25、V26、K27、A28、R91、G92、P93、Q94、I95、L96、H97、R98、V99、S100和L101。

实施方案85: 一种能够结合TLT-1或其片段的单克隆抗体或其片段或变体，其中所述抗体的表位包含一个或多个选自下述的残基：SEQ ID NO: 7的E5、T6、H7、K8、I9、G10、S11、L12、A13、E14、N15、A16、F17、S18、D19、P20和A21。

实施方案86: 一种能够结合TLT-1或其片段的单克隆抗体或其片段或变体，其中所述残基是SEQ ID NO: 7的K133、I134、G135、S136、L137、A138、N140、A141、F142、S143、D144、P145和A146。

实施方案87: 一种能够结合TLT-1或其片段的单克隆抗体或其片段或变体，其中所述抗体的互补位包含一个或多个选自下述的残基：抗-TLT-1轻(L)链(SEQ ID NO: 40)的H50、N52、Y56、H58、Y73、F79、S115、T116、V118和Y120，和抗-TLT-1重(H)链(SEQ ID NO: 39)的残基V20、F45、R49、Y50、W51、E68、T75、N77、S116、G117、V118和T120。

实施方案88: 一种能够结合TLT-1或其片段的单克隆抗体或其片段或变体，其中所述表位包含一个或多个选自下述的残基：SEQ ID NO: 4的K133、I134、G135、S136、L137、A138、N140、A141、F142、S143、D144、P145和A146。

下面的实施例进一步例证了本发明，所述实施例不应当解释为进一步限制。在本申请中引用的所有附图和所有参考文献的内容特别地通过引用并入本文。

实施例

实施例1

hTLT-1 ECD-His抗原的克隆和表达。使用含有HindIII识别位点以及kozak序列的正向引物和含有终止密码子和EcoRI识别位点的反向引物(图2)，PCR扩增编码人TLT-1 (hTLT-1)的胞外结构域的核苷酸序列(图1)以及C-端His-6标签。将HindIII-和EcoRI消化的PCR片段插入基于pTT的表达载体的HindIII-和EcoRI位点中。pTT载体基本上如Durocher, Y. 等人, (2002) Nucleic Acid Res, 30: E9所述。得到的表达质粒被命名为pTT-hTLT-1 ECD-His。将pTT-hTLT-1 ECD-His转染进HEK293-6E悬浮细胞中，以便短暂表达hTLT-1 ECD-His。在补充了1%P/S (GIBCO目录号15140-122)、0.1%pluronic (GIBCO，目录号24040-032)和25 ug/mL遗传霉素(GIBCO，目录号10131-019 )的Freestyle HEK293培养基(GIBCO，目录号12338-018)中培养HEK293-6E细胞，使用293fectin (Invitrogen，目录号12347-019)，以1 mill/mL的细胞密度转染细胞。对于每升HEK293-6E细胞，如下进行转染：将1 mg pTT-hTLT-1 ECD-His DNA稀释进30 mL Optimem (稀释液A)中，并将1 mL 293fectin稀释进30 mL Optimem (GIBCO，目录号51985-026, 稀释液B)中。混合稀释液A和B，并在室温温育30分钟。此后，将所述转染混合物加给HEK293-6E细胞，并在控湿培养箱中在定轨旋转(125 rpm)下在37℃温育细胞。转染后7天，通过离心去除细胞，并无菌过滤得到的含有hTLT-1 ECD-His的上清液，然后纯化。

实施例2 

hTLT1 ECD-His蛋白的纯化和表征。按照2步法纯化hTLT1 ECD-His蛋白：1)使用钴装载的树脂TALON (Clontech，目录号635506)的His-亲和色谱法，和2)使用细颗粒树脂Source 15Q (GE Healthcare，目录号17-0947)的阴离子交换色谱法。使用?ktaExplorer色谱系统(GE Healthcare，目录号18-1112-41)进行纯化。用于第一个纯化步骤的缓冲液系统是：由20 mM Hepes（pH 7.0）、150 mM NaCl组成的平衡缓冲液，由20 mM Hepes（pH 7.0）、0.5 M NaCl组成的洗涤缓冲液，和由20 mM Hepes（pH 7.0）、150 mM咪唑组成的洗脱缓冲液。不经任何调节，将细胞上清液直接上预平衡的TALON柱。用20柱体积的平衡缓冲液、20柱体积的洗涤缓冲液和最后的20柱体积的平衡缓冲液，洗涤所述柱。在约5柱体积的洗脱缓冲液中，等度洗脱所述蛋白。使用SDS-PAGE/考马斯NuPage 4-12%Bis-Tris凝胶(Invitrogen，目录号NP0321BOX)和安置在Micro-flex系统(Bruker Daltonics)上的基质辅助的激光解吸/电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF MS)，分析洗脱的蛋白的分子质量。在这里，观察到几乎等量的约16.7和33.4 kDa的2种不同的蛋白质量。观察到的质量对应着hTLT1 ECD-His的单体和二聚体形式。还原蛋白导致33.4 kDa蛋白的完全消除，同时增强了16.7 kDa蛋白，这从SDS-PAGE/考马斯分析判断出。因而，hTLT-1 ECD-His蛋白含有互连的C-C二聚体。为了使单体与二聚体分离，采用第二个纯化步骤。用于该纯化步骤的缓冲液系统是：由50 mM Hepes（pH 8.0）组成的平衡缓冲液，由50 mM Hepes（pH 8.0）、1 M NaCl组成的洗脱缓冲液。使用1 M NaOH，将样品调节至pH8.0，然后稀释至约10 mS/cm的电导率。将所述蛋白上预平衡的Source 15Q柱，用5柱体积的平衡缓冲液洗涤，使用0 - 100%洗脱缓冲液经20柱体积洗脱。基于UV280监测，观察到2个峰，几乎基线分离。使用SDS-PAGE/考马斯、MALDI-TOF MS和使用Dynapro仪器(Wyatt Technology)的动态光散射(DLS)，分析2个峰的级分，证实单体hTLT-1 ECD-His蛋白存在于首先洗脱的峰中，Cys-Cys二聚体存在于第二个洗脱的峰中。制备仅含有单体hTLT-1 ECD-His蛋白的集合。基于安置在Agilent LC 1100/1200 系统上的尺寸排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC)方法，并使用BIOSep-SEC-S3000 300x7.8mm柱(Phenomenex，目录号00H-2146-K0)和由200 mM磷酸钠pH 6.9、300 mM NaCl和10%异丙醇组成的电泳缓冲液，分析最终的蛋白完整性。所述蛋白洗脱为单个对称峰，保留时间为约9.9 min，流速为1 ml/min。

为生产单克隆抗-TLT1抗体的免疫研究制备一批hTLT-1 ECD-His。因而，使用Slide-A-Lyzer透析盒10kDa MWCO (Pierce，目录号66453)，将所述蛋白透析进等渗PBS缓冲液中。为了测量最终的蛋白浓度，使用NanoDrop分光光度计(Thermo Scientific)，消光系数为0.55。

实施例3

单克隆TLT-1抗体的制备。通过注射50 μg hTLT-1 ECD-His来免疫RBF小鼠。皮下FCA以后，在FIA中注射20μg hTLT-1 ECD-His 2次。用25μg hTLT-1 ECD-His静脉内地强化高应答小鼠，在3天以后收获脾。将脾细胞与骨髓瘤Fox细胞系融合。在特异性ELISA中和在FACS试验（分别使用hTLT-1-或假转染的CHO细胞作为阳性和阴性靶细胞）中，筛选上清液中的hTLT-1特异性抗体生产。在人、食蟹猴、狗、兔或小鼠起源的静止的和双激动的活化的血小板上进行第二个筛选。

实施例4

来自杂交瘤的抗TLT-1 mAb LC和HC cDNA的克隆和测序。从4个如下命名的表达不同抗-TLT-1 mAb的杂交瘤提取总RNA：0012Hyb (a.k.a. 2F105/2F105A3)、0023Hyb、0051Hyb和0052Hyb。使用RNeasy微型试剂盒(Qiagen，目录号74106)，从杂交瘤细胞提取RNA，将得到的RNA的等分试样用作第一链cDNA合成的模板，其中按照生产商的5’RACE说明书使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech，目录号634914)，并使用5’RACE CDS引物A以及SMART II A RNA寡核苷酸。此后，使用UPM正向引物混合物，以及小鼠LCκ特异性的反向引物(反向引物编号339、348或610)或识别小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG3序列的反向引物(反向引物编号341、347、613、614、615或616，在序列编号70-155中显示的引物序列)，PCR扩增来自4个抗TLT-1 杂交瘤中的每一个的轻链(LC)和重链(HC)编码区cDNA。使用phusion PCR混合物(FinnZymes，目录号: F-531L)，进行PCR反应。使用用于测序的Zero blunt Topo PCR克隆试剂盒(Invitrogen，目录号K287540)，克隆得到的PCR片段，并测序。0012LC和HC的可变结构域序列如图3所示。

实施例5

pTT-0012HC、pTT-0023HC、pTT-0051HC和pTT-0052HC表达构建体的开发。使用为了克隆目的含有HinDIII限制性酶位点的正向引物和含有NheI限制性酶位点的反向引物，PCR扩增从4个不同的抗TLT-1 杂交瘤中的每一个分离出的编码HC可变结构域(V_H)的DNA序列。使用phusion PCR混合物(FinnZymes，目录号F-531L)，分别使用下面的引物编号对，PCR扩增0012V_H、0023V_H、0051V_H和0052V_H DNA序列：490 (正向) + 491 (反向)、546 (正向) + 547 (反向)、627 (正向) + 628 (反向)和617 (正向) + 618 (反向，在序列编号70-155中所示的引物序列)，并插入命名为pTT-hIgG4的基于pTT的载体(图22+23)的HinDIII和NheI限制性酶位点，所述pTT-hIgG4含有人IgG4 HC的恒定区编码序列(即CH1-铰链-CH2-CH3)。所述pTT载体基本上如Durocher, Y. 等人, (2002) Nucleic Acid Res, 30: E9 (图22)所述。得到的载体被命名为pTT-0012HC (图5)、pTT-0023HC、pTT-0051HC和pTT-0052HC。显示了由表达载体编码的抗TLT-1 HC氨基酸序列(Seq. ID no.: 0012HC: 39、0023HC: 41、0051HC: 43、0052HC: 45)。

实施例6

pTT-0012LC、pTT-0023LC、pTT-0051LC和pTT-0052LC表达构建体的开发。使用为了克隆目的含有HinDIII限制性酶位点的正向引物和含有BsiWI限制性酶位点的反向引物，PCR扩增从4个不同的抗TLT-1 杂交瘤中的每一个分离出的编码LC可变结构域(V_L)的DNA序列。分别使用下面的引物编号对，PCR扩增0012V_L、0023V_L、0051V_L和0052V_L DNA序列：493 (正向) + 495 (反向)、548 (正向) + 549 (反向)、492 (正向) + 494 (反向)和619 (正向) + 620 (反向，在序列编号70-155中所示的引物序列)，并插入命名为pTT-hLCκ的基于pTT的载体的HinDIII和BsiWI限制性酶位点，所述pTT-hLCκ含有人LCκ的恒定区编码序列(图24)。得到的载体被命名为pTT-0012LC、pTT-0023LC、pTT-0051LC和pTT-0052LC。显示了由表达载体编码的抗TLT-1 LC氨基酸序列(Seq. ID no.: 0012LC: 40、0023LC: 42、0051LC: 44、0052LC: 46)。

实施例7

pTT-0012HC.T60N、pTT-0012HC.T60A、pTT-0012LC.C36A和pTT-0052HC.C91Y的开发。0012V_H氨基酸序列含有潜在的N-连接的糖基化位点(T60，Kabat编号)，且0012V_L和0052V_H氨基酸序列各自含有未成对的Cys (分别是C36和C91，Kabat编号)。按照生产商的说明书，使用定点诱变(Quickchange II, Stratagene，目录号20523-5)，开发了编码0012HC.T60N或0012HC.T60A或0012LC.C36A或0052HC.C91Y的表达载体。如下进行定点诱变反应：a)对于pTT-0012HC.T60N，使用pTT-0012HC DNA作为模板，并使用引物编号682 (正向) + 683 (反向)，b)对于pTT-0012HC.T60A，使用pTT-0012HC DNA作为模板，并使用引物编号688 (正向) + 689 (反向)，c)对于pTT-0012LC.C36A，使用pTT-0012LC DNA作为模板，并使用引物编号598 (正向) + 599 (反向)，d)对于pTT-0052HC.C91Y，使用pTT-0052HC DNA作为模板，并使用下述引物编号684 (正向) + 685 (反向，在序列编号70-155中所示的引物序列)。将得到的表达载体测序，以便验证DNA序列。显示了由pTT-0012HC.T60N、pTT-0012HC.T60A和pTT-0012LC.C36A表达载体编码的抗TLT-1 HC和LC氨基酸序列(Seq. ID no.: 0012HC.T60N: 47、0012HC.T60A: 50、0012LC.C36A: 48)。

实施例8

pTT-0012LC-HPC4、pTT-0012LC.C36A-HPC4、pTT-0023LC-HPC4、pTT-0051LC-HPC4和pTT-0052LC-HPC4 表达构建体的开发。使用为了克隆目的含有HinDIII限制性酶位点的正向引物和含有BsiWI限制性酶位点的反向引物，PCR扩增从4个不同的抗TLT-1 杂交瘤中的每一个分离出的编码V_L的DNA序列。使用phusion PCR混合物(FinnZymes，目录号F-531L)，分别使用下面的引物编号对，PCR扩增0012V_L、0012V_L.C36A、0023V_L、0051V_L和0052V_L DNA序列：493 (正向) + 495 (反向)、548 (正向) + 549 (反向)、492 (正向) + 494 (反向)和619 (正向) + 620 (反向，在Seq. ID no. 70-155中所示的引物序列)。使用正向引物编号486和反向引物编号485，PCR扩增人C_Lκ编码序列。正向引物编号486含有BsiWI限制性酶位点，反向引物485编码HPC4标签(Seq. ID no.: 69)、继之以终止密码子，并含有用于克隆目的的3’侧接EcoRI位点。使用phusion PCR混合物(FinnZymes，目录号F-531L)，进行所述PCR反应。将HindIII+BsiWI消化的0012V_L PCR片段与BsiWI+EcoRI消化的人C_L,κ-HPC4 PCR片段混合，并插入基于pTT的表达载体的HinDIII + EcoRI位点，产生pTT-0012LC-HPC4 (图4)。为了开发编码剩余的3种抗TLT-1 LC序列的LC-HPC4形式的对应表达载体，用HinDIII+ BsiWI切离pTT-0012LC-HPC4中的0012V_L序列，并用HinDIII+BsiWI消化的0023V_L、0051V_L、0052V_L和0012V_L.C36A PCR片段替换。得到的4种表达载体被命名为：pTT-0023LC-HPC4、pTT-0051LC-HPC4、pTT-0052LC-HPC4和pTT-0012LC.C36A.HPC4。

实施例9

pTT-0012V_H-CH1、pTT-0012V_H-CH1-HPC4、pTT-0023V_H-CH1、pTT-0023V_H-CH1-HPC4、pTT-0051V_H-CH1、pTT-0051V_H-CH1-HPC4、pTT-0052V_H-CH1和pTT-0052V_H-CH1-HPC4 表达构建体的开发。使用phusion PCR混合物(FinnZymes，目录号F-531L)，分别使用下述引物编号，PCR扩增从0012Hyb、0023Hyb、0051Hyb、0052Hyb分离出的0012V_H、0023V_H、0051V_H和0052V_H序列：490 (正向) + 491 (反向)、546 (正向) + 547 (反向)、627 (正向) +628 (反向)、617 (正向) + 618 (反向，在序列编号70-155中所示的引物序列)。为了克隆目的，所有正向引物(490、546、627和617)含有HinDIII位点，且所有反向引物(491、547、628和618)含有NheI位点。使用引物编号489 (正向) + 488 (反向)或引物编号489 (正向) + 487 (反向)，PCR扩增人IgG₄ CH1区域。正向引物编号489含有NheI位点，反向引物编号488 含有终止密码子和EcoRI位点，反向引物编号487 含有HPC4标签编码序列、终止密码子和随后的用于克隆目的的EcoRI位点。将HinDIII+NheI消化的0012V_H PCR片段与NheI+EcoRI消化的人IgG₄ CH1 PCR片段混合，或与NheI+EcoRI消化的人IgG₄ CH1-HPC4 PCR片段混合，并克隆进基于pTT的载体的HindIII+EcoRI位点。得到的载体分别被命名为pTT-0012V_H-CH1和pTT-0012V_H-CH1-HPC4。随后，通过HindIII+NheI消化，切离pTT-0012V_H-CH1和pTT-0012V_H-CH1-HPC4的V_H结构域，并插入HinDIII+NheI消化的0197-0000-0023V_H、0197-0000-0051V_H和0197-0000-0052V_H PCR片段。得到的表达载体被命名为：pTT-0023V_H-CH1、pTT-0023V_H-CH1-HPC4、pTT-0051V_H-CH1、pTT-0051V_H-CH1-HPC4、pTT-0052V_H-CH1和pTT-0052V_H-CH1-HPC4。

实施例10

pTT-0012V_H.T60N-CH1和pTT-0012V_H.T60N-CH1-HPC4 表达构建体的开发。使用phusion PCR混合物(FinnZymes，目录号F-531L)，并使用为了克隆目的含有HinDIII限制性酶位点的正向引物编号572和含有EcoRI位点的反向引物编号488或含有HPC4标签编码序列以及用于克隆目的的EcoRI位点的反向引物487 (在序列编号70-155中所示的引物序列)，从pTT-0012HC.T60N PCR扩增0012V_H.T60N-CH1序列(包括信号肽编码序列)。用HinDIII + EcoRI消化得到的PCR片段，并插入基于pTT的载体的HinDIII + EcoRI位点。得到的表达载体被命名为pTT-0012V_H.T60N-CH1和pTT-0012V_H.T60N-CH1-HPC4。

实施例11

pTT-L4a-hTF.1-219和pTT-hTF.1-219-L4b表达构建体的开发。制备表达构建体，其编码N-端17 氨基酸Gly-Ser连接物(L4a: GSGGGGSGGGGS GGGGS, Seq. ID no. 61)和不包括信号肽编码序列的人组织因子的胞外结构域(hTF.1-219, Seq. ID no. 14)。首先，使用phusion PCR混合物(FinnZymes，目录号F-531L)，并使用含有编码L4a的DNA序列的引物编号466 (正向)和反向引物449 (在序列编号70-155中所示的引物序列)，PCR扩增hTF.1-219 cDNA序列，得到L4a-hTF.1-219 PCR片段。使用第一个PCR片段作为模板，使用引物编号483 (正向)和449 (反向)进行第二个PCR扩增步骤。进行第二个PCR步骤，以便将HinDIII和EcoRI位点掺入用于克隆目的的PCR片段中。得到的PCR片段编码L4a-hTF.1-219，且含有BamHI位点作为Gly-Ser连接物的一部分(L4a中标有下划线的序列)，用于将来的克隆目的。将所述DNA片段插入基于pTT的载体的HinDIII和EcoRI位点，得到的载体被命名为pTT-L4a-hTF. 1-219 (图25)。

制备表达构建体，其编码包括信号肽编码序列的人组织因子的胞外结构域和C-端17 氨基酸Gly-Ser连接物(L4b: GGGGSGGGGSGGGGS GS, Seq. ID no. 62)。首先，使用phusion PCR混合物(FinnZymes，目录号F-531L)，并使用引物编号448 (正向)和467 (反向，在seq. ID no 70-155中所示的引物序列)，PCR扩增hTF.1-219，得到编码hTF.1-219-L4b的DNA片段(Seq. ID no. 16(氨基酸1-251) + 62)。使用第一个PCR片段作为模板，使用引物编号448 (正向)和484 (反向)，进行第二个PCR扩增步骤。进行所述的第二个PCR步骤，以便将HinDIII和EcoRI位点掺入用于克隆目的的PCR片段。得到的编码hTF.1-219-L4b的PCR片段含有BamHI位点作为Gly-Ser连接物的一部分(L4b中标有下划线的序列)，用于将来的克隆目的。将所述DNA片段插入基于pTT的载体的HinDIII和EcoRI位点，得到的载体被命名为pTT-hTF.1-219- L4b (图26)。

实施例12

pTT-0012LC-L4a-hTF.1-219、pTT-hTF.1-219-L4b-0012LC表达和pTT-0012LC.C36A-L4a-hTF.1-219 构建体的开发。使用phusion PCR混合物(FinnZymes，目录号F-531L)，并使用正向引物编号493和反向引物编号552，从pTT-0012LC PCR扩增0012LC cDNA (包括信号肽编码序列)。为了克隆目的，将正向引物493插入5’末端HinDIII限制性酶位点，将反向引物552插入3’末端BamHI限制性酶位点(在序列编号70-155中所示的引物序列)。将得到的0012LC PCR片段插入pTT-L4a-hTF.1-219的HinDIII + BamHI位点，得到编码0012LC-L4a-hTF.1-219的表达载体，命名为pTT-0012LC-L4a-hTF.1-219。

使用phusion PCR混合物(FinnZymes，目录号F-531L)，并使用正向引物编号551和反向引物编号98，从pTT-0012LC PCR扩增0012LC cDNA (不包括信号肽编码序列)。为了克隆目的，将正向引物551 插入5’末端BamHI限制性酶位点，将反向引物98插入3’末端EcoRI限制性酶位点(在序列编号70-155中所示的引物序列)。将得到的0012LC PCR片段插入pTT-hTF.1-219-L4b的BamHI + EcoRI位点，得到编码hTF.1-219-L4b-0012LC的表达载体，命名为pTT-hTF.1-219-L4b-0012LC。

使用HinDIII和BsiWI限制性酶，从pTT-0012LC.C36A切离0012V_L.C36A cDNA序列，将得到的DNA片段插入pTT-0012LC-L4a-hTF.1-219 质粒的HinDIII+BsiWI限制性酶位点，即替换0012V_L序列。得到的表达质粒被命名为pTT-0012LC.C36A-L4a-hTF.1-219 (也命名为0061LC-L4a-hTF.1-219)。

实施例13

pTT-0012HC-L4a-hTF.1-219和pTT-hTF.1-219-L4b-0012HC表达构建体的开发。

使用phusion PCR混合物(FinnZymes，目录号F-531L)，并使用正向引物编号490和反向引物编号513，从pTT-0012HC PCR扩增0012HC序列(包括信号肽编码序列)。为了克隆目的，将正向引物490插入5’末端HinDIII限制性酶位点，将反向引物513插入3’末端BamHI限制性酶位点。将0012HC PCR片段插入pTT-L4a-hTF.1-219的HinDIII + BamHI位点，得到0012HC-L4a-hTF.1-219 表达构建体，命名为pTT-0012HC-L4a-hTF.1-219。

使用phusion PCR混合物(FinnZymes，目录号F-531L)，并使用正向引物编号512和反向引物编号100，从pTT-0012HC PCR扩增0012HC序列(不包括信号肽编码序列)。为了克隆目的，将正向引物512插入5’末端BamHI限制性酶位点，将反向引物100插入3’末端EcoRI限制性酶位点(在序列编号70-155中所示的引物序列)。将0012HC PCR片段插入pTT-hTF.1-219-L4b的BamHI + EcoRI位点，得到hTF.1-219-L4b-0012HC表达构建体，命名为pTT-hTF.1-219-L4b-0012HC。

实施例14

pTT-0012V_H-CH1-L4a-hTF.1-219和pTT-hTF.1-219-L4b-0012V_H-CH1 构建体的开发。使用phusion PCR混合物(FinnZymes，目录号F-531L)，并使用正向引物编号490和反向引物编号514 (在Seq. ID no 70-155中所示的引物序列)，从pTT-0012HC PCR扩增编码0012V_H-CH1的DNA序列(包括信号肽编码序列)。为了克隆目的，将正向引物490 插入5’末端HinDIII限制性酶位点，将反向引物514插入3’末端BamHI限制性酶位点。将0012V_H-CH1 PCR片段插入pTT-L4a-hTF.1-219的HinDIII + BamHI位点，得到0012V_H-CH1-L4a-hTF.1-219 表达构建体，命名为pTT-0012V_H-CH1-L4a-hTF.1-219 (图6)。

使用正向引物编号512和反向引物编号488，从pTT-0012HC PCR扩增编码0012V_H-CH1的DNA序列(不包括信号肽编码序列)。为了克隆目的，将正向引物512插入5’末端BamHI限制性酶位点，将反向引物488 插入终止密码子和3’末端EcoRI限制性酶位点(在序列编号70-155中所示的引物序列)。将0012V_H-CH1 PCR片段插入pTT-hTF.1-219-L4b的BamHI + EcoRI位点，得到hTF.1-219-L4b-0012V_H-CH1 表达构建体，命名为pTT-hTF.1-219-L4b-0012V_H-CH1。

实施例15

具有不同连接物长度的pTT-0012LC-TF的开发: L0 (没有连接物)、L1 (2GS)、L2 (7GS)、L3 (12GS)、L5 (22GS)、L6 (27GS)、L7 (32GS)、L8 (37GS)、L9 (42GS)。使用phusion PCR混合物(FinnZymes，目录号F-531L)，并使用含有5’末端HinDIII位点的正向引物编号574 和反向引物，PCR扩增0012LC cDNA序列(包括信号肽编码序列)，所述反向引物含有：编码5 GS的GS连接物长度的3’末端序列+ BamHI位点(反向引物编号590)、10GS+ BamHI位点(反向引物编号585)、15GS (反向引物编号583) + BamHI位点、20GS + BamHI位点(反向引物编号584)、25GS + BamHI位点(反向引物编号591，在序列编号70-155中所示的引物序列)。用HinDIII+BamHI消化得到的0012LC PCR片段，并插入pTT-L4a-hTF.1-219，得到表达载体，命名为pTT-0012LC-L5-hTF.1-219 (22GS连接物)、pTT-0012LC-L6-hTF.1-219 (27GS连接物)、pTT-0012LC-L7-hTF.1-219 (32GS连接物)、pTT-0012LC-L8-hTF.1-219 (37GS连接物)和pTT-0012LC-L9-hTF.1-219 (42GS连接物)。

使用phusion PCR混合物(FinnZymes，目录号F-531L)，并使用含有BamHI位点(2GS连接物)和随后的10GS连接物编码序列的正向引物编号586，或含有BamHI位点(2GS连接物)和随后的5GS连接物编码序列的正向引物编号699，或含有BamHI位点(2GS连接物)的正向引物编号700，以及含有用于克隆目的的EcoRI限制性酶位点的反向引物编号449 (在序列编号70-155中所示的引物序列)，PCR扩增hTF.1-219 cDNA序列(不包括信号肽编码序列)。用BamHI+EcoRI消化得到的PCR片段，并插入pTT-0012LC-L4a-hTF.1-219 的BamHI+EcoRI位点，即替换L4a-hTF.1-219序列。得到的表达载体被命名为：pTT-0012LC-L3-hTF.1-219 (12GS连接物)、pTT-0012LC-L2-hTF.1-219 (7GS连接物)或pTT-0012LC-L1-hTF.1-219 (2GS连接物)。

使用phusion PCR混合物(FinnZymes，目录号F-531L)，并使用含有5’末端HinDIII位点的正向引物编号574，和含有来自hTF.1-219的5’末端的序列的反向引物编号704，PCR扩增0012LC cDNA序列(包括信号肽编码序列)。使用phusion PCR混合物(FinnZymes，目录号F-531L)，并使用含有来自0012LC的3’末端的序列的正向引物编号703和含有3’末端EcoRI位点的反向引物编号449，PCR扩增hTF.1-219 cDNA序列(不包括信号肽编码序列)。混合0012LC和hTF.1-219 PCR片段，使用正向引物编号574和反向引物编号449 (在序列编号70-155中所示的引物序列)，进行第二个PCR步骤(重叠PCR)。将得到的PCR片段插入基于pTT的表达载体的HinDIII+EcoRI位点，得到pTT-0012LC-L0-hTF.1-219，其编码没有任何连接物序列的0012LC-hTF.1-219 融合蛋白。

实施例16

具有不同连接物长度的pTT-0023LC-TF的开发：L3 (12GS)、L4a (17GS)、L5 (22GS)、L6 (27GS)、L7 (32GS)、L8 (37GS)、L9 (42GS)。使用HinDIII+BsiWI限制性酶，从pTT-0023LC切离0023V_L cDNA序列(包括信号肽编码序列)，并插入下述载体的HinDIII+BsiWI限制性酶位点：pTT-0012LC-L3-hTF.1-219 (12GS连接物)、pTT-0012LC-L4a-hTF.1-219 (17GS连接物)、pTT-0012LC-L5-hTF.1-219 (22GS连接物)、pTT-0012LC-L6-hTF.1-219 (27GS连接物)、pTT-0012LC-L7-hTF.1-219 (32GS连接物)、pTT-0012LC-L8-hTF.1-219 (37GS连接物)和pTT-0012LC-L9-hTF.1-219 (42GS连接物)，即用0023V_L替换0012V_L cDNA序列。得到的表达载体被命名为：pTT-0023LC-L3-hTF.1-219 (12GS连接物)、pTT-0023LC-L4a-hTF.1-219 (17GS连接物)、pTT-0023LC-L5-hTF.1-219 (22GS连接物)、pTT-0023LC-L6-hTF.1-219 (27GS连接物)、pTT-0023LC-L7-hTF.1-219 (32GS连接物)、pTT-0023LC-L8-hTF.1-219 (37GS连接物)和pTT-0023LC-L9-hTF.1-219 (42GS连接物)。

实施例17

具有不同连接物长度的pTT-0023HC-TF的开发：L1 (2GS)、L2 (7GS)、L3 (12GS)、L4a (17GS)、L5 (22GS)、L6 (27GS)、L7 (32GS)、L8 (37GS)、L9 (42GS)。如下PCR扩增0023HC cDNA序列(包括信号肽编码序列)：使用phusion PCR混合物(FinnZymes，目录号F-531L)，并使用含有5’-末端HindIII限制性酶位点的正向引物编号546 和1)含有5GS编码序列以及BamHI位点的反向引物编号592，或2)含有10GS编码序列以及BamHI位点的反向引物编号589，或3)含有15GS编码序列以及BamHI位点的反向引物编号587，或4)含有20GS编码序列以及BamHI位点的反向引物编号588，或5)含有25GS编码序列以及BamHI位点的反向引物编号593 (在序列编号70-155中所示的引物序列)。用HinDIII+BamHI消化得到的PCR片段，并插入pTT-0012LC-L4a-hTF.1-219的HinDIII+BamHI限制性酶位点，即替换0012LC编码序列。得到的表达载体被命名为：pTT-0023HC-L5-hTF.1-219 (22GS连接物)、pTT-0023HC-L6-hTF.1-219 (27GS连接物)、pTT-0023HC-L7-hTF.1-219 (32GS连接物)、pTT-0023HC-L8-hTF.1-219 (37GS连接物)、pTT-0023HC-L9-hTF.1-219 (42GS连接物)。

如下PCR扩增hTF.1-219 cDNA序列(不包括hTF信号肽序列)：使用phusion PCR混合物(FinnZymes，目录号F-531L)，并使用a)含有BamHI限制性酶位点和10GS编码序列的正向引物编号586，或b)含有BamHI限制性酶位点和5GS编码序列的正向引物编号699 或含有BamHI限制性酶位点的正向引物编号700以及含有用于克隆目的的EcoRI限制性酶位点的反向引物编号449 (在序列编号70-155中所示的引物序列)。用BamHI+EcoRI消化得到的PCR片段，并插入pTT-0023HC-L4a-hTF.1-219的BamHI+EcoRI位点，即用L3-hTF.1-219或L2-hTF.1-219或L1-hTF.1-219 cDNA序列替换L4a-hTF.1-219序列。得到的表达载体分别被命名为pTT-0023HC-L3-hTF.1-219 (12GS连接物)、pTT-0023HC-L2-hTF.1-219 (7GS连接物)和pTT-0023HC-L1-hTF.1-219 (2GS连接物)。

使用HinDIII + NheI，从pTT-0023HC切离0023V_H DNA序列，并插入pTT-0012HC-L4a-hTF.1-219的HinDIII + NheI位点，即替换0012V_H DNA序列。得到的表达载体被命名为pTT-0023HC-L4a-hTF.1-219。

实施例18

具有不同连接物长度的pTT-0012HC-TF的开发：L0 (没有连接物)、L1 (2GS)、L2 (7GS)、L3 (12GS)、L5 (22GS)、L6 (27GS)、L7 (32GS)、L8 (37GS)、L9 (42GS)。使用HinDIII+NheI，从pTT-0012HC切离编码0012V_H的cDNA序列，将得到的cDNA片段插入：pTT-0023HC-L1-hTF.1-219、pTT-0023HC-L2-hTF.1-219、pTT-0023HC-L3-hTF.1-219、pTT-0023HC-L5-hTF.1-219、pTT-0023HC-L6-hTF.1-219、pTT-0023HC-L7-hTF.1-219、pTT-0023HC-L8-hTF.1-219或pTT-0023HC-L9-hTF.1-219，即替换0023V_H。得到的表达载体被命名为：pTT-0012HC-L1-hTF.1-219、pTT-0012HC-L2-hTF.1-219、pTT-0012HC-L3-hTF.1-219、pTT-0012HC-L5-hTF.1-219、pTT-0012HC-L6-hTF.1-219、pTT-0012HC-L7-hTF.1-219、pTT-0012HC-L8-hTF.1-219或pTT-0012HC-L9-hTF.1-219。

使用phusion PCR混合物(FinnZymes，目录号F-531L)，并使用含有5’末端HinDIII限制性酶位点的正向引物编号490 和含有编码hTF.1-219的5’末端cDNA序列的一部分的反向引物编号801，PCR扩增编码0012HC的cDNA (包括信号肽序列)。使用含有编码0012HC cDNA的3’末端部分的5’末端序列的使用正向引物编号800和含有用于克隆目的的EcoRI位点的反向引物编号449 (在序列编号70-155中所示的引物序列)，PCR扩增hTF.1-219 cDNA序列(不包括信号肽编码序列)。混合得到的2个PCR片段，并在第二个PCR步骤(重叠PCR)中用作模板，其中使用正向引物编号490和反向引物编号449。用HinDIII+EcoRI消化得到的PCR片段，并插入基于pTT的表达载体。得到的表达载体被命名为pTT-0012-L0-hTF.1-219，并编码没有连接物序列的0012HC-TF融合蛋白。

实施例19

pTT-0012V_H-CH1-L10-hTF.1-219、pTT-0012V_H.T60N-CH1-L10-hTF.1-219和pTT-0012V_H.T60A-CH1-L10-hTF.1-219的开发。使用phusion PCR混合物(FinnZymes，目录号F-531L)，并使用含有5’-末端HindIII限制性酶位点的正向引物编号572 和含有hTF.1-219 5’末端序列的一部分的反向引物编号686，从pTT-0012HC质粒PCR扩增0012V_H-CH1-铰链cDNA序列(包括信号肽编码序列)。使反向引物686与pTT-0012HC质粒的hIgG4 铰链区对合，并掺入2个点突变C239S和C242S (Kabat编号)，以便去除2个自由半胱氨酸。使用含有来自0012V_H-CH1-铰链cDNA的3’末端的序列的正向引物编号687和含有用于克隆目的的EcoRI限制性酶位点的反向引物编号449(在序列编号70-155中所示的引物序列)，PCR扩增人TF.1-219 cDNA序列。混合得到的0012V_H-CH1-铰链cDNA和hTF.1-219 PCR片段，并在第二个PCR反应(重叠PCR)中用作模板，其中使用正向引物编号572和反向引物编号449。用HindIII+EcoRI消化得到的编码0012V_H-CH1-铰链-hTF.1-219的PCR片段，并插入基于pTT的表达载体中，得到表达载体，命名为pTT-0012V_H-CH1-L10-hTF.1-219。

使用HinDIII和NheI限制性酶，分别从pTT-0012HC.T60N或从pTT-0012HC.T60A切离0012V_H.T60N和0012V_H.T60A cDNA (包括信号肽编码序列)。将得到的可变结构域插入pTT-0012V_H-CH1-L10-hTF.1-219的HinDIII + NheI位点，即替换0012V_H序列。得到的表达载体分别被命名为：pTT-0012V_H.T60N-CH1-L10-hTF.1-219 (也称作pTT-0061V_H-CH1-L10-hTF.1-219)和pTT-0012V_H.T60A-CH1-L10-hTF.1-219 (也称作pTT-0082V_H-CH1-L10-hTF.1-219)。

实施例20

pTT-0012V_H-CH1-L0-hTF.1-219的开发。使用phusion PCR混合物(FinnZymes，目录号F-531L)，并使用含有HinDIII的正向引物编号572和含有与hTF.1-219 cDNA序列的5’末端重叠的DNA序列的反向引物编号702，从pTT-0012HC质粒PCR扩增编码0012V_H-CH1的DNA序列。使用含有与0012V_H-CH1的3’末端cDNA序列重叠的cDNA序列的正向引物编号701和含有用于克隆目的的EcoRI限制性酶位点的反向引物编号449，PCR扩增hTF.1-219 cDNA序列。混合得到的PCR片段，并用于第二个PCR反应(重叠PCR)中，其中使用正向引物编号572和反向引物编号449。用HinDIII+EcoRI消化得到的PCR片段，并插入基于pTT的表达载体的HinDIII+EcoRI限制位点，得到表达载体，命名为pTT-0012 V_H-CH1-无连接物-hTF.1-219。

实施例21

pTT-023V_H-CH1-L4a-hTF.1-219、pTT-0051HC-L4a-hTF.1-219、pTT-0051V_H-CH1-L4a-hTF.1-219、pTT-0052HC-L4a-hTF.1-219和pTT-0052V_H-CH1-L4a-hTF.1-219的开发。使用HinDIII+NheI限制性酶，从pTT-023HC、pTT-0051HC或pTT-0052HC切离0023V_H、0051VH和0052V_H cDNA序列。将得到的DNA片段插入pTT-0012HC-L4a-hTF.1-219或TT-0012V_H-CH1-L4a-hTF.1-219的HinDIII+NheI限制性酶位点，即替换0012V_H DNA序列。得到的表达载体被命名为pTT-0023V_H-CH1-L4a-hTF.1-219、pTT-0051HC-L4a-hTF.1-219、pTT-0051V_H-CH1-L4a-hTF.1-219、pTT-0052HC-L4a-hTF.1-219和pTT-0052V_H-CH1-L4a-hTF.1-219。

实施例22

pTT-0051LC-L4a-hTF.1-219和pTT-0052LC-L4a-hTF.1-219的开发。使用HinDIII + BsiWI限制性酶，从pTT-0051LC或pTT-0052LC切离0051V_L和0052V_L cDNA序列。将得到的DNA片段插入pTT-0012LC-L4a-hTF.1-219的HinDIII+BsiWI限制性酶位点，即替换0012V_L DNA序列。得到的表达载体被命名为pTT-0051LC-L4a-hTF.1-219或pTT-0052LC-L4a-hTF.1-219。

实施例23

pTT-同种型对照LC-L4a-hTF.1-219、pTT-同种型对照LC-HPC4、pTT-同种型对照HC-L4a-hTF.1-219、pTT-同种型对照HC、pTT-同种型对照V_H-CH1-HPC4和pTT-同种型对照V_H-CH1-L4a-TF的开发。为了表达基于同种型对照Fab或mAb序列的hTF.1-219 融合蛋白，基于抗-三硝基苯基(ATNP) CDR序列，恢复V_H和V_L cDNA序列。将ATNP V_L序列插入下述质粒的HinDIII+BsiWI限制性酶位点：pTT-0012LC、pTT-0012LC-HPC4和pTT-0012LC-L4a-hTF.1-219，即替换0012V_L序列，并得到下面的表达质粒：pTT-同种型对照-LC、pTT-同种型对照-LC-HPC4和pTT-同种型对照-LC-L4a-hTF.1-219。

将ATNP V_H序列插入下述质粒的HinDIII+NheI限制性酶位点：pTT-0012HC、pTT-0012V_H-CH1-HPC4、pTT-0012V_H-CH1-L4a-hTF.1-219和pTT-0012HC-L4a-hTF.1-219，即替换0012V_H序列，并得到下面的表达质粒：pTT-同种型对照-HC、pTT-同种型对照-V_H-CH1-HPC4、pTT-同种型对照-V_H-CH1-L4a-hTF.1-219和pTT-同种型对照-HC-L4a-hTF.1-219。

实施例24

pTT-AP-3LC-17GS-TF.1-219、pTT-AP-3LC.C34S-17GS-TF.1-219和pTT-AP-3V_H-CH1-HPC4的开发。从ATCC (ATCC号：HB-242)购得表达抗GPIIbIIIa mAb的AP-3 杂交瘤，测定来自AP3 LC和HC的可变结构域编码序列。使用RNeasy微型试剂盒(Qiagen，目录号74106)，从AP-3 杂交瘤细胞分离出总RNA，使用SMART RACE (clontech，目录号PT3269-1), Primescript逆聚合酶(Takara Bio Inc, 代号2680A)，并采用5-CDS引物和SMART IIA寡核苷酸(二者都包括在SMART RACE试剂盒中)，制备第一链cDNA。使用UPM引物混合物(包括在SMART RACE试剂盒中)以及引物编号69（对于LC）和UPM引物混合物以及引物编号312（对于HC）(在序列编号70-155中所示的引物序列)，PCR扩增LC和HC可变结构域序列。按照生产商的说明书，使用用于测序的Zeroblunt Topo PCR克隆试剂盒(Invitrogen，目录号K287520)，将所述PCR片段克隆进测序载体中。

在V_L cDNA序列中鉴别出在位置34 (根据Kabat编号系统)处的潜在自由的Cys。通过采用定点诱变，使用QuikChange定点诱变试剂盒(目录号200518, Stratagene)和引物编号50和51 (在序列编号70-155中所示的引物序列)，将所述Cys残基突变成Ser。将得到的V_L cDNA序列测序，以便证实突变的cDNA序列。

PCR扩增测序的AP-3V_H、AP-3V_L和AP-3V_L.C34S cDNA，以便制备编码AP-3V_H-CH1-HPC4、AP-3LC-L4a-hTF.1-219和AP-3LC.C34S-L4a-hTF.1-219的表达载体。使用phusion PCR混合物(FinnZymes，目录号F-531L)，并使用含有HinDIII限制性酶位点的正向引物编号842和含有用于克隆目的的NheI限制性酶位点的反向引物编号843，PCR扩增AP-3V_H。如下PCR扩增测序的AP-3V_L和AP-3V_L.C34S cDNA：使用phusion PCR混合物(FinnZymes，目录号F-531L)，并使用含有HinDIII限制性酶位点的正向引物编号844 和含有用于克隆目的的BsiWI限制性酶位点的反向引物编号845 (在序列编号70-155中所示的引物序列)。将HinDIII + NheI消化的AP-3V_H PCR片段插入pTT-0012V_H-CH1-HPC4的HinDIII和NheI限制性酶位点，即替换0012V_H DNA序列，得到表达载体，命名为pTT-AP3V_H-CH1-HPC4。将HinDIII + BsiWI消化的AP-3V_L和AP-3V_L.C34S PCR片段插入pTT-0012LC-L4a-hTF.1-219的HinDIII和BsiWI限制性酶位点，即替换0012V_L DNA序列，并得到表达载体，命名为pTT-AP-3LC-L4a-hTF.1-219和pTT-AP-3LC.C34S-L4a-hTF.1-219。

实施例25

pTT-0012HC.T60N-His6、pTT-hIgG4-铰链-CH2-CH3-His6和pTT-hIgG4-铰链-CH2-CH3-L4a-hTF.1-219的开发。为了开发编码具有C-端His-6标签的0012HC.T60N的表达载体，使用Quickchange lightning试剂盒(GenStar Biosolutions，目录号T113-01)，进行定点诱变。简而言之，使用pTT-0012HC.T60N作为模板，使用正向引物编号1000和反向引物编号1001 (在序列编号70-155中所示的引物序列)，进行定点诱变反应。引物编号1000 + 1001与0012HC.T60N cDNA序列的3’末端对合，并含有His-6标签编码序列和随后的终止密码子。得到的质粒被命名为pTT-0012HC.T60N-His6。

为了开发编码hIgG4-铰链-CH2-CH3-L4a-hTF.1-219的表达载体，使用Quickchange lightning试剂盒(GenStar Biosolutions，目录号T113-01)，并使用pTT-0012HC-L4a-hTF.1-219作为模板，使用正向引物编号1002和反向引物编号1003 (在序列编号70-155中所示的引物序列)，进行定点诱变。引物编号1002+1003与0012HC信号肽部分和hIgG4铰链区部分对合，并缺失来自pTT-0012HC-L4a-hTF.1-219 质粒的0012V_H-CH1 DNA序列。得到的表达载体被命名为pTT-hIgG4-铰链-CH2-CH3-L4a-hTF.1-219。为了开发编码hIgG4-铰链-CH2-CH3-His6的表达载体，使用Quichange Lightning试剂盒(Stratagene，目录号200518)，并使用pTT-hIgG4-铰链-CH2-CH3-L4a-hTF.1-219作为模板，使用正向引物编号1000和反向引物编号1001，进行定点诱变。引物编号1000+1001含有编码His-6的DNA序列和随后的终止密码子，且它们与hIgG4 CH3 DNA序列的3’-末端对合。得到的表达载体被命名为pTT-hIgG4-铰链-CH2-CH3-His6。

实施例26

HEK293-6E细胞的瞬时转染。通过将表达质粒瞬时转染进细胞中，在HEK293-6E悬浮细胞中表达所有mAb、Fab和hTF.1-219 融合蛋白。在表6中显示了作为得到的具体蛋白化合物的基础的单个质粒组合。在补充了1%P/S (GIBCO，目录号15140-122)、0.1%pluronic (GIBCO，目录号24040-032)和25 ug/mL遗传霉素(GIBCO，目录号10131-019 )的Freestyle HEK293培养基(GIBCO，目录号12338-018)中培养HEK293-6E细胞，根据生产商的说明书，使用293fectin (Invitrogen，目录号12347-019 )，以大约1 mill/mL的细胞密度，转染细胞。简而言之，对于每升HEK293-6E细胞，通过将共1 mg DNA稀释进30 mL Optimem (稀释液A)中，并将1 mL 293fectin稀释进30 mL Optimem (GIBCO，目录号51985-026, 稀释液B)中，进行转染。混合稀释液A和B，并在室温温育30分钟。此后，将所述转染混合物加给HEK293-6E细胞，并在控湿培养箱中在定轨旋转(125 rpm)下在37℃温育细胞。转染后5-7天，通过离心去除细胞，并无菌过滤得到的细胞培养物上清液，然后纯化。对于使用2个表达质粒的共转染的所有瞬时转染实验，为每升要转染的HEK293-6E细胞使用1mg DNA总量，以1:1 (ug:ug)质粒比共转染质粒。对于蛋白0120和0121的表达(表6)，将3个表达质粒以1:1:1 (ug:ug:ug)质粒比共转染进HEK293-6E细胞中。

实施例27

pcDNA3.1(+)-hTLT-1 ECD-HPC4 ala突变型质粒。根据表7，设计了40个hTLT-1 ECD-HPC4 Ala突变型表达构建体。由外部承包商GENEART AG (Im Gewerbepark B35, 93059 Regensburg, 德国)开发出所述表达构建体，且基于命名为pcDNA3.1(+)的表达载体，制备所有40个表达构建体。将40个hTLT-1 ECD-HPC4 pcDNA3.1(+)表达构建体中的每一个的DNA的等分试样转染进HEK293-6E悬浮细胞中，以便短暂表达每种hTLT-1 ECD-HPC4 Ala突变蛋白(表7)。如在实施例Z中所述，进行HEK293-6E细胞的瞬时转染和培养。

表7

实施例28

单克隆抗-TLT-1抗体的纯化和表征。通过由亲和色谱法（使用蛋白A MabSelect SuRe树脂(GE Healthcare，目录号17-5438-01)）和凝胶过滤色谱法（使用26/60 Superdex 200 PrepGrade柱(GE Healthcare，目录号17-1071-01)）组成的2步法，纯化在表1中所述的7种重组表达的单克隆抗-TLT-1抗体。使用?ktaExplorer色谱系统(GE Healthcare，目录号18-1112-41)，进行纯化。用于亲和纯化步骤的缓冲液系统是：由20 mM磷酸钠pH 7.2、150 mM NaCl组成的平衡缓冲液，由10 mM甲酸pH 3.5组成的洗脱缓冲液，和由0.5 M磷酸钠pH 9.0组成的pH-调节缓冲液。将细胞上清液不经任何调节地直接上预平衡的MabSelect SuRe柱。用15柱体积的平衡缓冲液洗涤所述柱，并用约2-5柱体积的洗脱缓冲液等度洗脱单克隆抗体。在洗脱后，立即使用所述的pH-调节缓冲液，将合并的级分调节至中性pH。使用所述凝胶过滤柱，进一步纯化所述蛋白，并进行缓冲液更换。用于尺寸排阻色谱法的电泳缓冲液是25 mM His pH 6.5、135 mM NaCl。使用的流速是2.5 ml/min，单克隆抗-TLT1抗体在约0.4柱体积时作为单个峰洗脱。基于使用以前所述的SEC-HPLC方法(如在实施例2中所述)对整个峰的级分的分析，制备这样的集合：其含有在约8.5 min作为对称峰洗脱的纯抗体蛋白和小量早期洗脱的高分子量蛋白。

使用以前所述的SDS-PAGE/考马斯(如在实施例2中所述)和SEC-HPLC方法，表征纯化的抗体，证实生产的所有抗体蛋白制品是高度同质的。当在运行SDS-PAGE/考马斯分析之前使用还原条件时，所有抗体表现出预期的约50 kDa的重链组分和约25 kDa的轻链组分。使用液相色谱法电喷雾电离飞行时间质谱法（安装在Agilent 6210仪器上）和脱盐柱MassPREP (Waters，目录号USRM10008656)，进行完整分子质量测定。使用的缓冲液系统是：由在LC-MS级-H₂O中的0.1%甲酸组成的平衡缓冲液，和由在LC-MS级-ACN中的0.1%甲酸组成的洗脱缓冲液。所有抗体表现出147.2 - 148.6 kDa的完整分子质量，这比每种抗体的氨基酸序列的理论质量高约2.7 - 3.1 kDa。因而，所有重组表达的抗-TLT-1抗体表现出与预期的HC N-糖基化相对应的翻译后修饰。6种抗体得到最终的95 - 99%纯度。为了验证克隆的和纯化的抗-TLT-1抗体的N-端序列，使用自动化的序列分析仪系统(Applied Biosystems 494蛋白测序仪)，进行EDMAN降解。对于每种抗体，进行10-20个降解循环。在这里，证实了6种克隆的抗-TLT-1抗体的预期的轻链和重链序列。为了测量最终的蛋白浓度，使用NanoDrop分光光度计(Thermo Scientific)，6种抗体中的每一种的比消光系数是在1.34-1.51范围内。

实施例29

重组表达的Fab-hTF.1-219蛋白的纯化和表征。使用由亲和色谱法（使用抗-HPC4树脂(Roche，目录号11815024001)）和最终的缓冲液替换组成的2步法，纯化在表6中所述的Fab-hTF.1-219 融合蛋白。使用?ktaExplorer色谱系统(GE Healthcare，目录号18-1112-41)，进行纯化。用于纯化步骤的缓冲液系统是：由20 mM Hepes（pH 7.5）、1.0 mM CaCl₂、100 mM NaCl和0.005%(v/v)吐温-80组成的平衡缓冲液，由20 mM Hepes（pH 7.5）、1.0 mM CaCl₂、1.0 M NaCl和0.005%(v/v)吐温-80组成的洗涤缓冲液，由20 mM Hepes（pH 7.5）、5.0 mM EDTA和100 mM NaCl组成的洗脱缓冲液。将细胞上清液调至1 mM CaCl₂ 终浓度和pH7.5，并上预平衡的抗-HPC4柱。用5柱体积的平衡缓冲液、5柱体积的洗涤缓冲液、最后用5柱体积的平衡缓冲液洗涤所述柱。用约4柱体积的洗脱缓冲液等度洗脱Fab-hTF1-219蛋白。使用以前所述的SDS-PAGE/考马斯、SEC-HPLC和MALDI-TOF MS分析(如在实施例1和28中所述)，分析Fab-hTF1-219蛋白，表明得到分子质量为78-86 kDa的纯的且同质的蛋白。由于Fab-hTF1-219 构建体的氨基酸序列的理论质量是73-77 kDa，所有表达的蛋白含有翻译后修饰。使用Slide-A-Lyzer透析盒10kDa MWCO (Pierce，目录号66453)或使用装填在适当柱中的脱盐树脂Sephadex G-25 (GE，目录号17-0033)，通过在PBS缓冲液中或在由25 mM His、135 mM NaCl组成的缓冲液（pH 6.5）中透析，将所述蛋白准备用于测定分析。为了测量最终的蛋白浓度，使用NanoDrop分光光度计(Thermo Scientific)，消光系数为1.31-1.47。

实施例30

重组表达的mAb-hTF.1-219蛋白的纯化和表征。使用由亲和色谱法（基于蛋白A MabSelect SuRe树脂(GE Healthcare，目录号17-5438-01)或抗-HPC4树脂(Roche，目录号11815024001)）组成的2步法，纯化在表6中所述的mAb-hTF.1-219 融合蛋白。使用抗-HPC4树脂纯化mAb-hTF.1-219 构建体，其中hTF.1-219与重链的C-端融合。这些包括化合物0197-0000-0013、0197-0000-0018、0197-0000-0086、0197-0000-0087、0197-0000-0088、0197-0000-0089、0197-0000-0090、0197-0000-0091、0197-0000-0092、0197-0000-0093、0197-0000-0034、0197-0000-0056、0197-0000-0060、0197-0000-0096和0197-0000-0116。使用蛋白A MabSelect SuRe树脂，纯化表6中的其它mAb-hTF.1-219 融合蛋白。使用凝胶过滤色谱法作为最终的抛光纯化。在这里，使用26/60 Superdex 200 PrepGrade柱(GE Healthcare，目录号17-1071-01)。所有纯化使用?ktaExplorer色谱系统(GE Healthcare，目录号18-1112-41)来进行，并基本上基于使用前面所述的色谱法操作。mAb-hTF.1-219蛋白在约0.4柱体积时作为单个峰洗脱。基于使用以前所述的分析SEC-HPLC方法对整个峰的级分的分析，制备这样的集合：其含有在约9 min作为对称峰洗脱的纯蛋白和小量早期洗脱的高分子量蛋白。

使用以前所述的SDS-PAGE/考马斯和SEC-HPLC方法(如在实施例2中所述)，表征纯化的mAb-hTF.1-219蛋白，证实所有mAb-hTF.1-219蛋白是高纯的，即超过90%的非产物相关杂质。使用以前所述的MALDI-TOF MS方法(如在实施例28中所述)，进行完整分子质量测定。所有mAb-hTF.1-219蛋白表现出200-206 kDa的完整分子质量，这比每种抗体的氨基酸序列的理论质量高约8-12 kDa。因而，所有mAb-hTF.1-219蛋白表现出翻译后修饰。为了测量最终的蛋白浓度，使用NanoDrop分光光度计(Thermo Scientific)，6种抗体中的每一种的比消光系数是在1.34-1.51范围内。

实施例31

命名为0120的异源二聚体蛋白的纯化和表征。通过下述4步法纯化在表6中命名为编号0120的异源二聚体蛋白：1)使用Ni-NTA树脂(QIAGEN，目录号30430)的His-亲和色谱法，2)使用HiPrep 26/10 脱盐柱(GE Healthcare，目录号17-5087-01)的缓冲液更换，3)使用Q琼脂糖_HP (GE Healthcare，目录号17-1014-03)的阴离子交换色谱法，和4)使用HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE Healthcare，目录号17-1069-01)的尺寸排阻色谱法。使用?ktaExplorer色谱系统(GE Healthcare，目录号18-1112-41)，进行纯化。用于第一个纯化步骤的缓冲液系统是：由50mM Tris（pH7.5）、300mM NaCl、10mM咪唑组成的平衡缓冲液，和由50mM Tris（pH7.5）、300mM NaCl、500mM咪唑组成的洗脱缓冲液。将细胞上清液调节至10mM咪唑终浓度和pH7.5，并上预平衡的Ni-NTA柱。用4柱体积的2%洗脱缓冲液洗涤所述柱。用约4柱体积的60%洗脱缓冲液等度洗脱所述蛋白。基于UV280监测，收集和合并主峰。在第二步中，通过使用脱盐柱转移进50mM Tris（pH7.5）缓冲液中，将蛋白准备应用于阴离子交换色谱法。用于第三个纯化步骤的缓冲液系统是：由50mM Tris（pH7.5）组成的平衡缓冲液，和由50mM Tris（pH7.5）、1M NaCl组成的洗脱缓冲液。将来自第二步的集合直接上预平衡的Q琼脂糖HP柱，用2柱体积的平衡缓冲液洗涤，并在0-100%洗脱缓冲液梯度洗脱10柱体积，随后洗脱3柱体积的100%洗脱缓冲液。收集并合并主峰。在第四步中使用的缓冲液是PBS。将来自第三步的蛋白集合直接上HiLoad 16/60 Superdex 200柱。收集主峰，并在-80℃保藏。SDS-PAGE/考马斯8-15%分析、SEC-HPLC和LC-MS表明，得到纯蛋白。从SDS-PAGE/考马斯分析，观察到一个致密的蛋白带，其与所述异源二聚体蛋白复合物相对应。还原蛋白会导致蛋白复合物带的完全消除，同时出现3个带，它们指示蛋白复合物的3个亚基。基于SEC-HPLC方法（安装在Waters LC 2795/2996 系统上），并使用BIOSep-SEC-S3000 300x7.8mm柱(Phenomenex，目录号00H-2146-K0)和由PBS组成的电泳缓冲液，分析最终的蛋白完整性。所述蛋白在约8.2 min的保留时间作为单个对称峰洗脱，流速为1 ml/min。为了测量最终的蛋白浓度，使用NanoDrop分光光度计(Thermo Scientific)，消光系数为1.34。通过LC-MS，测定每个亚基的分子量。LC亚基的质量解卷积指示与预期值相等的质量。HC-His亚基的质量解卷积指示与G0F、G1F和G2F N-聚糖的预期值相等的质量。由于组织因子的重度糖基化，Fc-sTF的质谱信号太低难以解卷积。

实施例32

命名为0121的异源二聚体蛋白的纯化和表征。基本上与关于异源二聚体编号120所述相同，纯化命名为编号121的异源二聚体蛋白。在这里，用3柱体积的平衡缓冲液洗涤蛋白，并用0-40%洗脱缓冲液洗脱8柱体积，随后洗脱3柱体积的100%洗脱缓冲液。该梯度洗脱确保所述异源二聚体与Fc-His同源二聚体完全分离。SDS-PAGE/考马斯8-15%、SEC-HPLC和LC-MS表明，得到纯蛋白。在SDS-PAGE/考马斯上观察到一个致密的蛋白带，其与所述异源二聚体蛋白复合物相对应。还原蛋白会导致蛋白复合物带的完全消除，同时出现3个带，它们指示蛋白复合物的3个亚基。基于SEC-HPLC方法（安装在Waters LC 2795/2996 系统上），并使用并使用BIOSep-SEC-S3000 300x7.8mm柱(Phenomenex，目录号00H-2146-K0)和由PBS组成的电泳缓冲液，分析最终的蛋白完整性。所述蛋白在约8.2 min的保留时间作为单个对称峰洗脱，流速为1 ml/min。为了测量最终的蛋白浓度，使用NanoDrop分光光度计(Thermo Scientific)，消光系数为1.34。通过LC-MS，测定每个亚基的分子量。FC-His亚基的质量解卷积指示与G0F、G1F和G2F N-聚糖的预期值相等的质量。HC亚基的质量解卷积指示，观察到的质量与G0F、G1F和G2F N-聚糖相关，但是具有在C-端的Lys截短。由于组织因子的重度糖基化，LC-sTF的质谱信号太低难以解卷积。

实施例33

TF-融合蛋白与FVIIa的结合。使用酰胺分解试验，通过它的刺激FVIIa活性的能力，测试TF-融合蛋白与FVIIa的结合。将所述效应与由可溶性的TF (sTF)诱导的刺激相对比，与hTF.1-219相等。TF与FVIIa的结合会导致FVIIa催化活性的显著增加；并使用生色底物S2288 (Ile-Pro-Arg-pNA)，通过FVIIa的酰胺分解活性，方便地测量sTF和TF-构建体的结合。hTF.1-219与FVIIa的结合会增加FVIIa催化活性。将TF-融合蛋白设计成将FVII/FVIIa定位于活化的血小板的表面。蛋白与TF的融合因此不会显著影响它与FVIIa的结合，且可以预期，TF-融合蛋白在最佳条件下诱导的FVIIa活性的浓度-依赖性的刺激与用未融合的TF (hTF.1-219)得到的刺激相等。在图7中，在使用50 nM FVIIa、50 mM Hepes、0.1 M NaCl、5 mM CaCl₂、1 mg/ml BSA pH 7.4和不同浓度(0 - 100 nM)的sTF (空心正方形)或Fab-TF-融合蛋白(空心符号)或mAb-TF-融合蛋白(实心符号)的试验中，测试了TF-融合蛋白。使用1 mM生色底物S2288，测量了FVIIa酰胺分解活性。通过在405 nm在室温的吸光度增加，测量FVIIa活性，通过加入1 mM S2288，开始反应。Fab- hTF.1-219-融合蛋白会以浓度依赖性的方式刺激FVIIa酰胺分解活性，其与hTF.1-219诱导的活性不可区分，表明这些构建体以1:1 化学计量学和与hTF.1-219类似的亲和力结合FVIIa。mAb- hTF.1-219-融合蛋白同样以与hTF.1-219相同的浓度依赖性的方式刺激FVIIa活性。但是，在该情况下，化学计量学指示，这些构建体结合2个FVIIa/mAb，如对mAb-TF-融合蛋白上的2个TF部分的自由接近所预见到的。

实施例34

不同mAB与TLT-1结合的mAb结合和竞争。

材料：

表8: 试剂

方法：

将目标mAb直接地固定化在CM5芯片上，或通过固定化在CM5芯片上的人Fc捕获mAb进行捕获。使用的试剂如表8所示。

直接捕获：使用供应商推荐的标准规程，将TLT-1 mAb以约500-1000 RU的水平固定化在CM5芯片上(50 μg/ml，在醋酸钠中稀释，pH 4.0)。测试了TLT1的2倍稀释液（从200 nM至0.2 nM）对mAB的结合。运行和稀释缓冲液：10 mM HEPES，150 mM，0.005% p20，pH 7.4。通过10 mM甘氨酸pH 1.7，实现再生。

通过人Fc mAb进行捕获：以约10.000 RU固定化人Fc mAb。加入目标mAb (约100 nM)。测试了TLT1的2倍稀释液（从200 nM至0.2 nM）。运行和稀释缓冲液：10 mM HEPES，150 mM，0.005% p20，pH 7.4。在3 M MgCl₂中实现再生。

使用Biacore T100评价软件，假定TLT1和纤维蛋白原的1:1 相互作用，测定动力学常数和结合常数(k_on、k_off、K_D)。

竞争：通过在Biacore T-100中的表面等离子体共振，进行竞争性结合相互作用分析，其分析不同的TLT1 mAb与TLT1的结合，所述TLT1结合在固定化的mAb0012 (或替代mAb)上。在10 mM醋酸钠pH 4.5-5.0中，以5000-10000 RU的水平，将所述mAb直接固定化在CM5芯片上。随后，结合50 nM TLT1，并在解离2 min以后，结合3种要测试的其它mAb的竞争。运行和稀释缓冲液：10 mM HEPES，150 mM，0.005% p20，pH 7.4。通过10 mM甘氨酸pH 1.7，实现再生。

结果：

表9

TLT1结合ka (1/M)kd (1/s)K_D>Biacore技术mAb 00619.32E+050.0034993.75E-09捕获mAb 00232.87E+050.001254.36E-09直接mAb 00512.45E+050.004721.93E-08直接mAb 00623.26E+050.001344.12E-09直接

表10: SPR分析。结合TLT1的结合常数。与mAB0012的竞争

mAb ID与mAB 0012的竞争与0023的竞争与0051的竞争与0062的竞争mAb 0061是否否否mAb 0023 是否是mAb 0051  是否mAb 0062   是

结论：

通过Biacore分析，估测mAb 0061、0023、0051和0062的结合常数(参见表9)。

mAb 0061和mAB 0051不与任意其它mAb竞争结合(参见表10)。mAb 0023和mAb 0062 确实相互竞争(参见表10)。

实施例35

通过FACS分析与活化的血小板的结合。通过FACS分析与活化的血小板的结合，证实结合TLT-1转染的细胞和特异性地活化的血小板，如下所述。

使用流式细胞术，如下用2F105FabHC-TF融合蛋白染色血小板：将血小板制品(静止的和活化的血小板)加入96 孔板中，并加入50 μl稀释的2F105FabHC-TF (0011 Fab hTF.1-219)融合蛋白或同种型对照2F105Fab (0010 Fab)进行滴定，产生5 μl /ml至0,001 μl /ml的终浓度。然后在4℃温育细胞制品1小时。温育和洗涤(含有5%胎牛血清的PBS缓冲液，在200g离心5分钟)以后，加入第二种RPE-标记的抗-人L+H链特异性的抗体(在PBS缓冲液中稀释，1:100)或HPC4特异性的抗体(对2F105Fab HC-TF上的标签是特异性的)，并在4℃温育另外1小时。最后，洗涤细胞，并用1%w/v低聚甲醛固定，在36小时内用流式细胞计进行分析。

通过制备标准的血小板富集的血浆(PRP)，生产血小板制品。简而言之，没有制动地离心(200 g，15分钟)抗凝结的全血。收获含有血小板的上层(血小板富集的血浆)，加入前列腺素(终浓度5 μl /ml)以抑制血小板活化。洗涤血小板，并用于如上所述的染色。为了生产活化的血小板，使用(62.5 μg/ml Par 1和Convulxin 100 ng/ml)，进行双激动的活化10分钟。每个孔使用50-100.000个细胞。

图8用2个染色操作表明，同种型Fab和2F105FabHC-TF (0011 Fab hTF.1-219)融合蛋白都以高亲和力特异性地结合活化的血小板，但是不结合静止血小板。

实施例36

通过TF-融合蛋白与TLT-1受体的结合而将FVIIa/TF复合物定位在预活化的血小板的表面上，从而增强FVIIa-介导的FX活化。在图9A的2步试验中，测试了TF-融合蛋白的特异性地刺激FVIIa-介导的对活化的血小板的活化的能力。在图9B中测试了TF-融合蛋白还介导FVII活化成FVIIa的能力。为此目的，我们使用了来自Biopal (REF 50710，批号R088001)的低压冻干的(活化的)血小板。在没有或有血小板存在下，在67.000 血小板/μl的终浓度，在2步试验中测量了FX活化。在50 mM Hepes、0.1 M NaCl、5 mM CaCl₂、1 mg/ml BSA pH 7.4中，在室温，混合100 pM rFVIIa (LASa 15860-008)与175 nM FX (Enzyme Research, 人因子X, HFX 3170 PAL)。在10 min以后，停止FX活化，此时从每个孔中取出等分试样，并加入等体积的冰冷的终止缓冲液(50 mM Hepes、0.1 M NaCl、20 mM EDTA、1 mg/ml BSA pH 7.5)。然后如下在生色试验中测定样品中产生的FXa的量：将50 μl混合物转移至微孔滴定板孔，加入25 μl Chromozyme X (最终0.42 mg/ml)到孔中。在微量培养板读数器(Molecular Devices)中，连续测量在405 nm的吸光度。图9A显示了下述物质在没有或有血小板存在下对FVIIa-介导的FX活化的影响：i) 0.03 nM Innovin^?，ii) 10 nM hTF.1-219，iii) 10 nM 0011 Fab-hTF.1-219，iv) 10 nM 0010 Fab抗体，或v) 0012 mAB抗体。图9B显示了在试验中用酶原rFVII替代rFVIIa的影响。

如下在对照实验中阻断FX活化(> 95%)：在加入FVIIa之前，用山羊多克隆抗-人TF抗体(0.5 mg/ml)预温育15 min。

图9A中的数据表明，TF与针对TLT-1的抗体的Fab片段的融合，会提供这样的构建体：其仅在有活化的血小板存在下，刺激FVIIa-催化的FX活化。在有血小板存在下，0011 TF-融合蛋白对FX活化的刺激明显强于hTF.1-219的刺激。对活化的血小板的特异性是TF-融合蛋白的优选性质，这在使用脂质化的TF (Innovin^?)时没有得到，所述脂质化的TF (Innovin^?)也在没有活化的血小板存在下刺激FVIIa介导的FX活化。

图9B显示了在试验中用酶原rFVII替代rFVIIa的影响。众所周知，Innovin^?会刺激FVIIa-介导的FX活化(图9A)；并且，如图9B中的数据所指出的，Innovin^?能够刺激FVII的有效反馈活化。该反应基本上独立于血小板的存在。TF构建体0011 Fab-hTF.1-219同样刺激FVIIa-介导的FX活化，且能够介导血小板-依赖性的FVII反馈活化(图9B)，但是，是以显著的血小板依赖性的方式，且明显强于hTF.1-219。没有观察到0010 Fab抗体或0012 mAb抗体本身对FX活化的显著刺激。

实施例37

通过结合TLT-1受体而将FVIIa/TF复合物定位在活化的血小板的表面上，从而增强FVIIa-介导的FX活化。在图10A中，在2步试验(参见实施例36)中，在有不同浓度的静止的或活化的血小板存在下，测试了0011 hTF.1-219-融合蛋白和hTF.1-219。活化的(但是非静止的)血小板在它们的表面上暴露TLT-1受体。认为TF融合蛋白向所述TLT-1受体的靶向会导致TF/FVIIa复合物的装配，所述装配是在有利于刺激活化的血小板的磷脂表面上的FX活化的位置。图10B显示了当用0.1 nM AV-hTF.1-219-融合蛋白替代0011 hTF.1-219-融合蛋白（其中用膜联蛋白V (AV)替代TLT-1抗体）时的结果。

从柠檬酸盐稳定化的全血（其在200 X g离心10 min），制备新鲜纯化的、洗过的静止血小板。将血小板富集的血浆转移至15 ml试管，并补充1/10体积的2.5%柠檬酸三钠、1.5%柠檬酸、2% D-葡萄糖。在500 x g离心15 min，制动5。抛弃上清液，将血小板沉淀物溶解于10 ml Hepes/Tyrodes缓冲液(100 mM Hepes, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.7 mM MgCl₂, 5.0 mM D-葡萄糖, 0.4 mM NaH₂PO₄ pH=6,5) + 5 μl 10 mg/ml前列腺素E1。使用塑料吸液管，小心地悬浮血小板，并在500 x g离心15 min，制动5。抛弃上清液，将沉淀物重新溶解于10 ml Hepes/Tyrodes缓冲液+ 5 μl 10 mg/ml前列腺素E1。用Medonic测定血小板数目。将血小板在室温静置30 min或以上，然后使用。通过用5 nM凝血酶和100 ng/ml Convulxin处理，活化血小板。

在有不同浓度(0-100,000 血小板/μl)的静止的或活化的血小板存在下，在50 mM Hepes、0.1 M NaCl、5 mM CaCl₂、1 mg/ml BSA pH 7.4中，在室温，混合100 pM rFVIIa与10 nM hTF.1-219或10 nM 0011 Fab-hTF.1-219 融合蛋白或0.1 nM AV-hTF.1-219-融合蛋白以及175 nM FX (Enzyme Research, 人因子X, HFX 3170 PAL)。在10 min以后，停止FX活化，此时从每个孔中取出等分试样，并加入等体积的冰冷的终止缓冲液(50 mM Hepes、0.1 M NaCl、20 mM EDTA、1 mg/ml BSA pH 7.5)。然后如下在生色试验中测定样品中产生的FXa的量：将50 μl混合物转移至微孔滴定板孔，加入25 μl Chromozyme X (最终0.42 mg/ml)到孔中。在微量培养板读数器(Molecular Devices)中，连续测量在405 nm的吸光度。

图10A中的数据表明，0011 Fab-hTF.1-219 融合蛋白与TLT-1受体的结合特异性地刺激FVIIa-介导的活化的血小板上的FX活化，但是不刺激静止血小板。刺激随着血小板数目而增加，且是可饱和的，EC₅₀为约12,000活化的血小板/μl。通过例如hTF.1-219与结合TLT-1的Fab片段的融合所实现的靶向血小板表面，会导致FX活化的显著刺激，而使用未融合的hTF.1-219仅观察到微小刺激。

图10B显示了当用0.1 nM AV-hTF.1-219-融合蛋白替换10 nM 0011 Fab-hTF.1-219 融合蛋白时得到的结果。对于FVIIa-介导的血小板上的FX活化而言，AV-hTF.1-219-融合蛋白是比0011 Fab-hTF.1-219更有效的刺激物。但是，经证实，AV-hTF.1-219-融合蛋白对活化的血小板的特异性低于0011 Fab-hTF.1-219，且AV-hTF.1-219-融合蛋白会诱导静止血小板的大量刺激。在更高的血小板数目，对静止血小板的刺激甚至超过用等量的活化的血小板所得到的刺激。

实施例38

靶向FVII/FVIIa和TF的构建体浓度对活化的血小板上的FX活化刺激的影响。血友病患者中具有假定的促凝血作用的靶向TLT-1的TF-融合蛋白应当能够在主流生理条件下起作用，并依赖于血液中的FVII/FVIIa组合物。使用在实施例36中所述的试验，可能在不同FVII/FVIIa浓度下(图11)和在不同TF-融合蛋白浓度下(图12)，检查TF-融合蛋白对FVIIa-介导的活化的血小板上的FX活化的刺激作用。在有附图中指出的添加的rFVIIa或rFVII存在下，实现了刺激。

图11的结果表明，在固定的TF-融合蛋白浓度下的FX活化依赖于FVII/FVIIa，且以浓度依赖性的方式进行刺激，在生理相关范围(FVII ~ 10 nM)内具有最大刺激。所述结果也证实，使用TF-融合蛋白得到的显著刺激需要血小板活化，FVII和FVIIa都会诱导刺激。此外，所述结果通过证实hTF.1-219与抗TLT-1 Fab片段的融合产生显著刺激，但是当TF与等效的非靶向Fab片段融合时却不然，从而证实了对靶向的需求。

在固定的FVII/FVIIa浓度(10 nM)，图12检查了使用0070 Fab-hTF.1-219 融合蛋白得到的刺激，所述刺激随着它的浓度而变化。此外，图12对比了该效应和用不同浓度的hTF.1-219或对照0094同种型Fab-hTF.1-219 融合蛋白诱导的刺激。数据表明，在0070 Fab hTF.1-219 融合蛋白的宽浓度范围内，得到了显著的刺激，另外证实了靶向TF-融合蛋白相对于非靶向hTF.1-219和对照0094同种型Fab-hTF.1-219 融合蛋白的优越性。0070 Fab hTF.1-219 融合蛋白会在大浓度范围内诱导促凝血刺激，且在高浓度时没有抗凝性。这不同于AV-TF融合蛋白，后者在高浓度时具有抗凝性(Huang X等人2006. Blood 107, 980-986.)。

实施例39

20:80 PS:PC囊泡的制备，和TLT-1的克隆、表达、重新折叠和重新脂质化。如在Smith和Morrissey (2005) J. Thromb. Haemost., 2, 1155-1162中所述，但是使用TLT-1替代TF，使用Triton X-100 作为去污剂，制备在20:80 PS:PC囊泡中的重新脂质化的TLT-1。

材料

LB培养基来自Sub. Lab. Ba. 卡那霉素(50 mg/ml)。卡那霉素Sigma K-0254

1000 mM IPTG (IPTG Sigma I-6758)

裂解缓冲液：在50mM Tris-HCl、100mM NaCl、2mM EDTA、pH 8.0中的1x Bugbuster (Novagen)。加入0.5mg/ml溶菌酶+ DNAseI。加入1x完全抑制剂混合液(Roche)

IB-洗涤缓冲液1：在IB-缓冲液中的1:10 bugbuster。加入50μg/ml溶菌酶+ 0.5x完全抑制剂混合液(Roche)

IB-洗涤缓冲液2：在IB-缓冲液中的1:10 Bugbuster

IB-缓冲液：50mM Tris-HCl，100mM NaCl，2mM EDTA，pH 8.0

GdnHCl缓冲液：6M盐酸胍，50mM Tris-HCl，50 mM NaCl，0.1%Triton X-100 red.，pH 8.0

重新折叠缓冲液：50mM Tris-HCl，800mM精氨酸，0.1%Triton X-100 red.，5mM还原的谷胱甘肽，0.5mM氧化的谷胱甘肽pH 8.5

透析缓冲液：20mM Tris-HCl，0.1%Triton X-100 red.，pH 8.0

DTT：还原的谷胱甘肽(Sigma G4251)，氧化的谷胱甘肽Sigma G4376

PC：在氯仿中的10mg/ml L-α-磷脂酰胆碱(鸡蛋)(Avanti Polar Lipids Inc.)，目录号840051C。分子量760.09

PS：在氯仿中的10mg/ml L-α-磷脂酰丝氨酸钠盐(猪脑) (Avanti Polar Lipids Inc.)，目录号840032C。分子量812.05

Triton X-100：10%Triton X-100，氢化的蛋白级去污剂，无菌过滤。Calbiochem. 目录号648464，浓度159 mM (分子量628)

HBS缓冲液：50mM HEPES，100mM NaCl，pH 7.4

Bio-Beads：Bio-Beads SM2吸附剂，20-50目BioRad Laboratories，目录号152-3920。

方法

表达：使用引物1004 (SEQ ID No 183)和1005 (SEQ ID No 184)，并使用pTT-hTLT-1作为模板，将包括胞外结构域、连接物和跨膜结构域的TLT-1 (TLT-1 18-188; SEQ ID NO 182)克隆进pET24a中。采用用于DNA制备的标准技术。

转化进BL21 (DE3)中。过夜培养：1 x 50 ml LB培养基在250 ml烧瓶(塑料)中，混合50 μl 50 mg/ml卡那霉素+ 来自BL21平板的1个菌落(转化)。在37℃、220 rpm温育培养物过夜。起始物培养：2 x 500 ml LB培养基在2L烧瓶(塑料)中，加入了300 μl 50 mg/ml卡那霉素。向10 ml过夜培养物中加入在BL21 (DE3)中的TLT-1 lip/pET24a，并监测OD600。在37℃、220 rpm温育。

诱导：2 x 500 ml在LB中的TLT-1 lip/pET24a ~ BL21 (DE3)。25℃，当OD₆₀₀达到0.6 - 0.8之间时，加入约0.2 mM IPTG(100 μl，1M)到细胞培养物中。将其在25℃、220 rpm温育3h。3h以后，收获培养物，并在4600 rpm离心30 min。抛弃上清液。在-20℃保存沉淀物。

包涵体的裂解：以5ml裂解缓冲液/g沉淀物，重新悬浮大肠杆菌沉淀物。加入MgSO₄至5mM，以支持DNAseI活性。在室温在摇动平台上温育细胞悬浮液20 min。通过在4℃、20000g (8500 rpm)离心20 min，澄清裂解物。将沉淀物重新悬浮于100 ml IB-洗涤缓冲液中。通过轻轻涡旋，混合悬浮液，并在室温温育5 min。在4℃、20000g离心悬浮液20 min，以收集包涵体。将包涵体重新悬浮于100 ml IB-洗涤缓冲液2中。在4℃、20000g离心样品20 min，以收集包涵体。将沉淀物重新悬浮于100 ml水中，并在4℃、20000g离心20 min，以收集包涵体。

重新折叠：将沉淀物重新溶解于x ml GdnHCl缓冲液(20 ml)中。TLT-1的终浓度(测量A280 )是1-2 mg/ml。加入DTT (400 μl)至20 mM终浓度。通过在室温磁力搅拌约1-2.5小时(1.5 h)，确保完全溶解。通过在20000g离心20 min，去除不溶物。缓慢地(过夜)使用蠕动泵，将GdnHCl/蛋白溶液(20 ml)转移至>20x 4℃的重新折叠缓冲液(400 ml)。快速搅拌所述重新折叠缓冲液，以确保快速稀释。在流速1x、速度2.5、4℃，运行泵，并在4℃放置过夜。通过在50 ml试管中在20000g (8500 rpm)离心30 min，去除沉淀的蛋白。在Amico-过滤器（76mm直径, 10.000 MWCO）中，在4.5 巴，将TLT1 lip从400 ml浓缩至120 ml。通过乙醇沉淀法，在SDS-Page上检查蛋白（因为样品中存在GdnHCl）。使用10.000 MWCO，在0.5 ml试管中浓缩2x 500 μl和2x 25 μl。混合50 μl样品+ 9体积的冰冷的99%EtOH (450 μl)，并在-20℃放置10 min。在全速13.000 rpm离心样品5 min。抛弃上清液。用450 μl冰冷的96%EtOH + 50 μl MQ洗涤沉淀物。再次离心。进行干燥(在SDS-PAGE以前，必须完全去除EtOH)。将100 μl重新悬浮于1x样品缓冲液中。

PS:PC制备和重新脂质化：完全按照在Smith SA & Morrissey JH (2004)“Rapid and efficient incorporation of tissue factor into liposomes”. J. Thromb. Haemost. 2:1155-1162中所述的方案，重新脂质化TLT-1。

实施例40

基于TLT-1富集的磷脂囊泡，建立FX活化筛选试验。在实施例37 中所述的新鲜纯化的血小板的应用，非常适合证实原理证据。但是，使用来自单个供体的活化的血小板来筛选和排序靶向TLT-1的TF-融合蛋白的更大集合，不是最佳的。每个血小板制品允许进行有限数目的试验，且也存在供体之间的变化。使用TLT-1富集的磷脂囊泡替代活化的纯化的血小板，建立了一个替代性的FX活化筛选试验。组成囊泡的表面，以模仿活化的血小板的磷脂组成。

如在图13中所示，测试了FX活化试验用于测量靶向TLT-1的TF-融合蛋白的刺激的可行性，并提供了用于筛选构建体的条件的基础。在有1:2,000稀释的TLT-1富集的磷脂囊泡制品存在下，在室温，在50 mM Hepes、0.1 M NaCl、5 mM CaCl₂、1 mg/ml BSA pH 7.4中，混合100 pM rFVIIa/rFVII与不同浓度(0 - 200 nM)的hTF.1-219或0070 Fab-hTF.1-219 融合蛋白或对照0094同种型Fab-hTF.1-219 融合蛋白以及175 nM FX (Enzyme Research, 人因子X, HFX 3170 PAL)。在10 min以后，停止FX活化，此时从每个孔中取出等分试样，并加入等体积的冰冷的终止缓冲液(50 mM Hepes、0.1 M NaCl、20 mM EDTA、1 mg/ml BSA pH 7.5)。然后如下在生色试验中测定样品中产生的FXa的量：将50 μl混合物转移至微孔滴定板孔，加入25 μl Chromozyme X (最终0.42 mg/ml)到孔中。在微量培养板读数器(Molecular Devices)中，连续测量在405 nm的吸光度。

图13中的数据显示了用活化的血小板得到的模式的基本模仿，我们在高FVII/FVIIa浓度下使用mAb hTF.1-219 融合蛋白仅观察到TLT-1非特异性的FX活化(数据未显示)。因此，在筛选试验中，应用0.1 nM的FVII/FVIIa和10 nM Fab TF.1-219-融合蛋白，以及0.1 nM FVII/FVIIa和1.0 nM mAb TF.1-219-融合蛋白。

实施例41

用于测定与抗TLT-1-mAb或其部分的融合的最佳条件的TF-融合蛋白筛选可用于选择药物候选物。使用TLT-1富集的磷脂囊泡的试验允许综合筛选大量TF-融合蛋白。通过对比在实施例41中使用的FX活化方法所得到的数据，也测试了通过该筛选得到的数据的可靠性。使用活化的血小板的每种制品，将得到的刺激与用0020 Fab-hTF.1-219 融合蛋白得到的刺激（设定为100%）相对比。将相同的相对量级用于使用TLT-1富集的磷脂囊泡的试验。在图27A (mAB融合蛋白)和27B (Fab融合蛋白)中对比了这样的筛选的结果。

数据表明，使用多种hTF.1-219 融合蛋白，得到了FVII/FVIIa-介导的在活化的血小板上的蛋白的活化刺激。

使用TF-融合蛋白（其中不同的mAb或Fab片段与相同的连接物-hTF.1-219 部分融合），测试了在TLT-1上的4种不同表位介导TF靶向的相对效能。mAb/Fab 0012、0023、0051和0052 融合蛋白的对比显示出下述的促凝血能力排序：0012 > 0051 > 0052 = 0023。

另外，图27A/B允许排序与完整mAb或与该mAb的不同部分或组合物融合的TF（同时仍然保留它对完整TLT-1 表位的亲和力）的促凝血能力。与mAb或Fab片段融合的相同连接物-hTF.1-219 构建体的对比表明，Fab-连接物-hTF.1-219-融合蛋白优于mAb-连接物-hTF.1-219-融合蛋白。同样地，Fab-hTF.1-219-融合蛋白也优于下述的异源二聚体：其中通过hTF.1-219与mAb的2个HC之一的C-端的融合，或与mAb的2个LC之一的C-端的融合，得到hTF.1-219-融合蛋白。

还通过对比在其它方面等效的TF-融合蛋白，测试了Fusion of hTF.1-219与抗体重链或轻链的N-端或C-端的融合。数据提示，C-端融合优于N-端融合。

等效的TF-融合蛋白（其中仅改变TF和mAb/Fab片段之间的连接物）的对比，也提供了可用于药物候选物选择的连接物的排序。

也可以用TF-融合蛋白靶向除了TLT-1以外的血小板受体，以实现FVII/FVIIa-介导的活化的血小板上的FX活化。这使用TF-融合蛋白0128和0129（通过TF与AP3 Fab片段的融合生成）来证实。所述AP3-Fab针对在活化的和静止血小板的表面上都存在的GPIIbIIIa受体(Phillips, D. R.,和Agin, P. P. (1977) J. Biol. Chem. 252, 2121-226)。0128 Fab-hTF.1-219和0129 Fab-hTF.1-219 TF-融合蛋白强烈地刺激活化的血小板上的应答。但是，静止血小板的应答是活化的血小板的应答的约20%，与此相比，在靶向TLT-1的0020 Fab-hTF.1-219 TF-融合蛋白诱导应答的相同条件下，静止血小板的应答是活化的血小板的应答的8%。可以认为，用TF-融合蛋白得到的刺激模式是3个主要因素的结果：i)在静止的和活化的血小板上的血小板受体密度和相对表面暴露，ii)酸性磷脂的表面暴露，和iii)在制备洗过的静止血小板的过程中，小量自发的血小板活化。GPIIbIIIa受体在静止血小板表面上的存在，可能导致AP3 TF-融合蛋白对静止血小板的相对高活性。基于抗体与对于止血而言特别重要的血小板受体（如GPIIbIIIa）的融合蛋白，也可能具有拮抗性质，并在高浓度用作抗凝血药。

实施例42

TF-融合蛋白会促进血友病-样全血中的纤维蛋白凝块形成。通过在室温用10 μg/ml抗-FVIII抗体(绵羊抗-人因子VIII; Hematologic Technologies Inc)温育正常的柠檬酸盐稳定的人全血(HWB) 30 min，得到血友病样条件。抗-FVIII抗体的存在，强烈地抑制了在再钙化柠檬酸盐化的HWB以后的自发凝血。将TF-融合蛋白加入HWB中，以证实这些蛋白的恢复血友病样条件（通过将抗-FVIII抗体加入HWB中来诱导）的能力。

通过血栓弹力描记术(5000系列TEG分析仪, Haemoscope Corporation, Niles, IL, USA)，测量血块形成。将不同浓度(0; 0.02; 0.1; 0.2; 1.0; 10 nM)的0070 TF-融合蛋白、0094 TF-融合蛋白或hTF.1-219加入血友病-样柠檬酸盐化的HWB中。当将340 μl正常的或预混合的HWB转移至装有20 μl 0.2 M CaCl₂的血栓弹性描记器杯中时，开始凝血。连续跟踪TEG迹线多达120 min。记录下述TEG变量：R时间(凝血时间，即从开始凝血直到得到2 mm振幅的时间)、α-角(测量为R值和TEG迹线的拐点之间的角的凝块发展)、K (达到特定水平的血块强度的凝血动力学速度，振幅= 20 mm)和MA (TEG迹线的最大振幅，其反映了血块的最大机械强度)。在图14A中，先死回流使用正常的HWB (NWB)、“血友病”血液和补充了(0; 0.02; 0.1; 0.2; 1.0; 10 nM)的0070 Fab-hTF.1-219-融合蛋白的“血友病”血液得到的TEG迹线。在图14B中，显示了用所述的TEG迹线得到的R-时间值。除了0070 Fab-hTF.1-219-融合蛋白的R-时间值以外，图14B也包括相同浓度的hTF.1-219和非靶向0094 Fab同种型hTF.1-219-融合体对照蛋白的R-时间值。从一个代表性的供体得到所有数据。

观察到0070 Fab-hTF.1-219-融合蛋白有效地标准化血友病-样HWB的凝固。通过对比用0094 Fab同种型hTF.1-219 融合蛋白（其中TF与非结合对照Fab的融合）得到的效应，用0070 Fab-hTF.1-219-融合蛋白证实了TF靶向TLT-1对血友病-样HWB的促凝血作用。

实施例43

TLT1-Fab0043-TF减少输入了人血小板的FVIII-KO小鼠的尾出血。在输入了人血小板的血友病小鼠(FVIII-KO小鼠)的尾出血模型中，测试了TLT-1-Fab0043-TF构建体的作用。

将人静脉血抽入柠檬酸葡萄糖(ACD; 1.7 ml/10 ml)中。用50 ng/ml PGE₁在室温(RT)温育血液10 min，随后离心(200g; 10 min)。收集血小板富集的血浆(PRP)，并用50 ng/ml PGE₁ 在室温温育10 min，随后在室温在450g离心10 min。去除血浆，将血小板沉淀物重新悬浮于血浆中，至1.1-2.8x10⁹ 血小板/ml的浓度。

用戊巴比妥麻醉小鼠，并插入导管。穿过导管，用1 nmol/kg TLT1-Fab0043-TF (5 ml/kg；n=7)或ATNP-FAb-TF (对照；无关的FAb-TF0095-构建体；n=8)预处理小鼠。3分钟以后，将人血小板(作为PRP)输入小鼠(1.1-2.8 x 10⁸ 血小板/小鼠; 5 ml/kg)中，在另外2分钟以后，诱导尾出血，随后是30分钟观察期。将血液损失测量为损失的血红蛋白的量。在血小板输入后1分钟，分别在对照组和TLT1-FAb-TF治疗组中，总血小板群体中的6.5和7.5%是人的。

TLT1-FAb-TF使血液损失从3956±447nmol血红蛋白显著减少至1180±489 nmol血红蛋白(p<0.01)。

实施例44

分析纤维蛋白原与TLT1的结合以及TLT1 mAb和纤维蛋白原之间的结合竞争。通过SPR分析，测试了TLT-1与纤维蛋白原的结合。此外，通过Biacore T100仪器中的SPR分析，测试了纤维蛋白原和4种mAb中的每一种的同时结合：mAb 0012、mAb 0023、mAb 0051和mAb 0062。

使用的材料如表11所示。

表11

方法：

使用供应商推荐的标准规程，以约1000 RU的水平，将人TLT1固定化在CM5芯片(50 μg/ml，在醋酸钠中稀释，pH 4.0)上。测试了人纤维蛋白原的4倍稀释液（从200 nM至0.2 nM）与固定化的TLT1的结合。运行和稀释缓冲液：10 mM HEPES，150 mM，0.005% p20，pH 7.4。通过10 mM甘氨酸pH 1.7，实现再生。使用Biacore T100评价软件，假定TLT1和纤维蛋白原的1:1 相互作用，测定动力学常数和结合常数(k_on、k_off、K_D)。

同时如下测试不同mAb与TLT1和纤维蛋白原的结合的竞争：以大约10000-15000 RU，将每种mAb固定化在CM5芯片上，随后结合50 nM TLT1，在解离2-3 min以后，测试不同浓度的mAb的竞争。通过10 mM甘氨酸pH 1.7，实现芯片的再生。

结果：

表12. TLT1与纤维蛋白原的结合

 ka (1/M)kd (1/s)K_D>TLT1-纤维蛋白原结合41713.92 X 10^-49.40E-08

表13. 与纤维蛋白原竞争。将目标mAb固定化在芯片上。加入TLT1以后，加入纤维蛋白原(夹心法)。  

mAb ID与纤维蛋白原竞争mAb0012否mAb0023是mAb0051否mAb0062是

结论：

纤维蛋白原(HCI-0150R)结合纤维蛋白原。mAb 0023和mAb 0062与该结合位点竞争。mAb 0012和mAb 0051不竞争。

实施例45

通过氢交换质谱法(HX-MS)进行表位作图。HX-MS技术已经被用于鉴别4种单克隆抗体mAb 0023、mAb 0051、mAb 0062和mAb 0061所覆盖的TLT-1结合表位。

对于作图实验，使用分别与SEQ ID NO 5、6和7相对应的hTLT-1.20-125、hTLT-1.16-162和hTLT-1.126-162。在实验之前，将所有蛋白缓冲液更换进PBS pH 7.4中。

方法：HX-MS实验。

仪器使用和数据记录

由LeapShell软件(Leap Technologies Inc.)操纵的Leap机器人(H/D-x PAL; Leap Technologies Inc.)，使HX实验自动化，其执行氘交换反应的开始、反应时间控制、猝灭反应、注射到UPLC系统上和消化时间控制。所述Leap机器人配有2个温度控制堆，对于缓冲液储存和HX反应，其维持在20 ℃，对于蛋白和猝灭溶液的储存，其维持在2 ℃。所述Leap机器人另外含有冷却的Trio VS单元(Leap Technologies Inc.)，其容纳胃蛋白酶柱、前置柱和分析柱、以及LC管道阀和切换阀（在1 ℃）。所述切换阀已经从HPLC升级至Microbore UHPLC切换阀(Cheminert, VICI AG)。对于线内胃蛋白酶消化，使用200 μL/min的等度流速(0.1%甲酸:CH₃CN 95:5)，装载100 μL含有200 pmol TLT-1的猝灭的样品，并穿过Poroszyme?固定化的胃蛋白酶筒(2.1 ×30 mm (Applied Biosystems))。捕获得到的肽，并在VanGuard前置柱BEH C18 1.7 μm (2.1 ×5 mm (Waters Inc.))上脱盐。随后，切换阀门，将前置柱放置成与分析柱UPLC-BEH C18 1.7 μm (2.1 ×100 mm (Waters Inc.))在线内，并使用从AQUITY UPLC系统(Waters Inc.)以150 μL/min递送的15?40% B梯度分离肽9 min。流动相由2个组分组成：A: 0.1%甲酸，和B: 在CH₃CN中的0.1%甲酸。使用Q-Tof Premier MS (Waters Inc.)，以阳离子模式，获得ESI MS数据和单独的数据依赖性的MS/MS获取(CID)和高能(MS^E)实验。亮氨酸-脑啡呔用作锁质量([M+H]⁺离子，在m/z 556.2771)，并以连续谱模式收集数据。

数据分析

使用标准的CID MS/MS或MS^E方法(Waters Inc.)，在单独的实验中，鉴别胃酶解肽。使用BiopharmaLynx 1.2 (017版)，处理MS^E数据。使用MassLynx软件和内部的MASCOT数据库，分析CID数据-依赖性的MS/MS获取。

对HX-MS原始数据文件进行连续的锁质量校正。使用HX-Express ((Version Beta); Weis等人, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17, 1700 (2006))，进行数据分析（即，氘化肽的形心测定和交换曲线绘图）。

mAb 0023的表位作图：

在有或没有mAb 0023存在下，通过在对应的氘化缓冲液(即在D₂O中制备的PBS，96%D₂O终浓度，pH 7.4 (未校正值))中30倍稀释hTLT-1.20-125，开始酰胺氢/氘交换(HX)。所有HX反应在20?C进行，并含有4 μM hTLT-1.20-125（有或没有2.4 μM mAb 0023存在），从而产生1.2倍摩尔过量的mAb结合位点。在从10秒至8小时的适当时间间隔，用等体积的冰冷的猝灭缓冲液(1.35M TCEP)猝灭HX反应的等分试样，产生2.6 的最终pH(未校正值)。

mAb 0051和0062的表位作图：

使用hTLT-1.20-125，在单独的实验中进行mAb 0051和mAb 0062的表位作图，并与上述的mAb 0023作图类似地进行。

mAb 0061的表位作图：

使用hTLT-1.16-162蛋白或hTLT-1.126-162 肽，在2个单独的实验中，进行mAb 0061的表位作图。

与上述的mAb 0023类似地进行实验。但是，使用hTLT-1.126-162，将胃蛋白酶柱放置在室温进行实验。这导致增加的胃蛋白酶消化效能，具有微小的额外交换损失。

结果

mAb 0023的表位作图

在有和没有mAb 0023存在下，监测20种肽（覆盖100%的TLT-1基本序列）的HX时程10秒至8小时。

在有或没有mAb 0023存在下观察到的交换模式可以分成2个不同的组：一组TLT-1 肽表现出不受mAb 0023的结合影响的交换模式，另一组TLT-1 肽表现出在mAb 0023结合以后被免于交换的保护。表现出在mAb 0023结合以后的保护的区域包括覆盖TLT-1残基36-51、79-91和105-120的肽。通过对比在每种肽内的交换保护的相对量，可以将mAb 0023的表位缩窄至：残基36-47，VQCHYRLQDVKA (50%)；残基82-87，LGGGLL (30%)；残基108-115，GARGPQIL (20%)，每个区段的相对交换保护注在括号内。在图16中，显示了0023 表位的肽图谱的概要。

mAb 0051的表位作图

在有和没有mAb 0051存在下，监测22种肽（覆盖100%的TLT-1基本序列）的HX时程10秒至1000秒。

在有或没有mAb 0051存在下观察到的交换模式可以分成2个不同的组：一组TLT-1 肽表现出不受mAb 0051的结合影响的交换模式，另一组受影响。表现出在mAb 0051结合以后的保护的区域包括覆盖残基52-66、92-120的肽。通过对比在每种肽内的交换保护的相对量，可以将mAb 0051的表位缩窄至：残基55-66，LPEGCQPLVSSA (75%)；残基110-120，RGPQILHRVSL (25%)；以及在残基92-105段内的弱相互作用。在图17中，显示了0051表位的肽图谱的概要。

mAb 0062的表位作图

在有和没有mAb 0062存在下，监测22种肽（覆盖100%的TLT-1基本序列）的HX时程10秒至1000秒。

在有或没有mAb 0062存在下观察到的交换模式可以分成2个不同的组：一组TLT-1 肽表现出不受mAb 0062的结合影响的交换模式，另一组TLT-1 肽表现出保护。表现出在mAb 0062结合以后的保护的区域包括覆盖残基36-51和105-120的肽。通过对比在每种肽内的交换保护的相对量，可以将mAb 0062的表位缩窄至：残基36-47，VQCHYRLQDVKA (60%)；残基110-120，RGPQILHRVSL (40%)。在图18中，显示了0062表位的肽图谱的概要。

mAb 0061的表位作图

使用hTLT-1.16-162蛋白或hTLT-1.126-162，在2个单独实验中，绘制mAb 0061的表位的图谱。

对于hTLT-1.16-162，在有和没有mAb 0061存在下，监测19种肽（覆盖85%的TLT-1基本序列）的HX时程10秒至8小时。由于在残基S148处的O-糖基化，没有记录下在残基141以外的信息。

在有或没有mAb 0061存在下观察到的交换模式可以分成2个不同的组：一组TLT-1 肽表现出不受mAb 0061的结合影响的交换模式，另一组TLT-1 肽表现出在mAb 0061结合以后免于交换的保护。表现出在mAb 0061结合以后的保护的区域包括覆盖残基121-141的肽。但是，重要的是，发现在该实验中没有给出残基142和以后的信息。通过对比在每种肽内的交换保护的相对量，可以将mAb 0061的表位缩窄至在残基130处开始。

为了获得关于mAb 0061 表位的充分信息，使用肽hTLT-1.126-162，重复作图实验。该肽以高亲和力结合mAb 0061，且它未被糖基化修饰。因而，能够得到关于整个区域的HX-MS信息。

在有和没有mAb 0061存在下，监测12种肽（覆盖整个126-162 TLT-1区域）的HX时程10秒至3000秒。

在该126-162区域中的所有肽表现出在mAb 0061结合以后免于交换的保护。通过对比在每种肽内的交换保护的相对量，可以将mAb 0061的表位缩窄至在残基130-145（ETHKIGSLAENA）内。在图19中，显示了0061表位的肽图谱的概要。

实施例46

hTLT1 ECD-HPC4 Ala突变体的保护、表征和结合分析。根据表7，设计了hTLT-1 ECD-HPC4 丙氨酸突变型构建体。由外部承包商GENEART AG (Im Gewerbepark B35, 93059 Regensburg, 德国)开发出所述表达构建体，且基于命名为pcDNA3.1(+)的表达载体，制备所有表达构建体。将40个hTLT-1 ECD-HPC4 pcDNA3.1(+)表达构建体中的每一个的DNA的等分试样转染进HEK293-6E悬浮细胞中，以便短暂表达每种hTLT-1 ECD-HPC4 Ala突变蛋白(表7)。如在实施例A中所述，进行HEK293 6e细胞的瞬时转染和培养。

转染后7天，通过离心去除细胞，无菌过滤得到的含有hTLT-1 ECD-HPC4 Ala突变蛋白的上清液，然后分析。使用RP-HPLC和SDS-PAGE/考马斯分析组合，测定表达的hTLT-1 ECD-HPC4 Ala突变蛋白在澄清的细胞上清液中的浓度。它们在4 - 40 μg/mL范围内，包含不同程度的二聚体形式。如以前关于用于免疫实验的hTLT蛋白的生产所述，对于所有hTLT ECD-HPC4 Ala突变型构建体，观察到表达的蛋白的单体/二聚体形式。通过SDS-PAGE/考马斯，估测单体/二聚体hTLT1 ECD-HPC4蛋白的相对浓度，并计算每种突变型制品的平均分子量。

所有结合研究在25 ℃进行，在ProteOn分析仪(BioRad)上的样品隔室中在15 ℃保存样品，所述ProteOn分析仪通过表面等离子体共振实时测量分子相互作用。ProteOn报告信号(RU，应答单位)，所述信号与在单个传感器芯片表面斑点上的质量直接相关联。

使用0.4 M EDAC [1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐]和0.1 M硫代-NHS [N-羟基硫代琥珀酰亚胺]的1:1 混合物，将抗-hFc多克隆抗体固定化在GLM传感器芯片的单个流动池上。在10 mM醋酸钠pH 5.0中稀释每种抗体至50 μg/ml的浓度，并以30 μl/min固定化在单个流动池上240s。将抗体固定化在流动池A1-A6 (水平方向)上。在固定化以后，用1 M乙醇胺封闭流动池上的活性部位。在一个实验中，捕获抗体的最终固定化水平通常在大约9,000至10,000 RU范围内。如下捕获抗-TLT1抗体0197-0000-0023、0197-0000-0051、0197-0000-0061和0197-0000-0062：在HBS-EP缓冲液(10 mM HEPES、150 mM NaCl、3mM EDTA、0.05%表面活性剂P20、pH 7.4)中稀释至0.5 μg/ml，在垂直方向以30 μl/min注射60s，建立仅含有抗-人Fc抗体的斑点间参照点。在一个实验中，实验抗体的最终捕获水平通常在大约200至300 RU范围内。如下结合野生型或Ala突变型hTLT-1 ECD-HPC4蛋白：在水平方向注射经过平行的流动池，以允许对比分析与不同的捕获的抗-TLT1抗体的结合（相对于与斑点间参照的结合）。基于计算的平均分子量，在HBS-EP缓冲液中将每种hTLT-1 ECD-HPC4蛋白稀释至100 nM，并以30 μl/min注射240s。在分析物的每个注射周期以后，如下再生GLM芯片：以100 μl/min，注射1 M甲酸18s，随后注射50 mM NaOH 18s。该再生步骤会从固定化的捕获抗体表面去除抗-TLT1抗体和任意结合的TLT1，并允许下一个实验样品对的随后结合。再生操作不会从芯片表面去除直接固定化的抗-人-Fc捕获抗体。

使用ProteOn ManagerTM软件，进行数据分析。没有观察到与斑点间对照表面的显著非特异性结合。通过双参照(减去斑点间对照表面信号以及经过捕获的抗-TLT1抗体的空白缓冲液注射)，处理结合曲线。这允许校正样品注射过程中的仪器噪音、体积迁移和漂移。将在停止分析物注射以后10s的结合信号标准化为捕获的抗-TLT1抗体的水平，并呈现为相对于野生型hTLT-1 ECD-HPC4蛋白的结合。

下述的Ala突变显示出与野生型hTLT-1 ECD-HPC4蛋白相比与各种抗-TLT1的结合的显著降低。0197-0000-0051: F54A < 0.4野生型；M91A < 0.2野生型；R117A < 0.2野生型；S119A < 0.6野生型；0197-0000-0062: R41A < 0.2野生型；L42A < 0.6野生型；Q43A < 0.4野生型；F54A < 0.6野生型；M91A < 0.4野生型；R110A < 0.2野生型；H116A < 0.6野生型；0197-0000-0023: L42A < 0.2野生型；Q43A < 0.2野生型；K46A < 0.2野生型；M91A < 0.4野生型；R110A < 0.2野生型。由于可以观察到hTLT1 ECD-HPC4突变型M91A对所有4种抗-TLT1抗体的降低的结合，残余物可能对蛋白稳定性具有重要影响，而不是实际表位的一部分。0197-0000-0061没有表现出与测试的任意突变型TLT-1 变体的降低的结合，这指示，所述表位未被在结合研究中导入的突变体覆盖。

实施例47

抗-TLT-1 Fab和TLT-1 茎肽之间的复合物的晶体结构。

用于结晶的0100抗-TLT-1 Fab的表达：根据一般规程，在HEK293细胞中瞬时表达抗-TLT-1 Fab片段Fab0100，其包含与SEQ ID NO 162相对应的重链和与SEQ ID NO 163相对应的轻链。

用于结晶的0100抗-TLT-1 Fab的纯化：通过由亲和色谱法（使用kappaSelect树脂(GE Healthcare，目录号17-5458-01)）的和尺寸排阻色谱法组成的2步法，纯化所述Fab。使用?ktaExplorer色谱系统(GE Healthcare，目录号18-1112-41)，进行所述纯化。用于纯化步骤的缓冲液系统是：由10 mM磷酸钠pH 7.5和150 mM NaCl组成的平衡缓冲液，和由20 mM甲酸pH 3.0组成的洗脱缓冲液。用1 M NaOH将所述上清液调节至pH7.5，并上预平衡的kappaSelect柱。用5柱体积的平衡缓冲液洗涤所述柱，并使用大约5柱体积的洗脱缓冲液，等度洗脱Fab蛋白。使用SDS-PAGE/考马斯和LC-MS分析，分析所述Fab蛋白，表明得到的纯的且同质的蛋白，预期分子量为46.9 kDa。为了测量蛋白浓度，使用NanoDrop分光光度计(Thermo Scientific)，消光系数为1.31。使用尺寸排阻柱(Superdex200)，进行Fab蛋白的最终抛光。

用于结晶的肽的制备：通过固相肽合成，制备TLT-1-茎肽hTLT-1.126-162 (SEQ ID NO 7)。同样地，制备了与SEQ ID NO 8相对应的茎肽的更短形式hTLT-1.129-142。

Fab0100:TLT-1 复合物的制备、结晶和结构测定。Fab0100:hTLT-1.126-162的制备：如下制备Fab0100和hTLT-1.126-162之间的复合物：将2倍摩尔过量的hTLT-1.126-162加入抗-TLT-1 Fab的溶液中，随后通过使用制备型尺寸排阻色谱法分离过量的hTLT-1.126-162，从而分离复合物。因而，通过混合Fab (1100 μl, 98 μM)和hTLT-1.126-162 (155 μl, 1391 μM)（二者都在PBS缓冲液(pH 7.4)中），制备Fab0100: hTLT-1.126-162 复合物。使用Superdex 200 HighLoad 26/60 (GE Healthcare)柱，对复合物进行凝胶过滤，用PBS-缓冲液(pH 7.4)洗脱，流速为1 ml/min。收集与3 ml体积相对应的级分。合并含有希望的Fab0100: hTLT-1.126-162 复合物的级分，然后使用离心过滤器装置(Amicon, 10 kDa截止)浓缩至8.6 mg/ml的蛋白浓度。将该制品用于Fab0100:hTLT-1.126-162 复合物的结晶。

Fab0100:hTLT-1.129-142的制备：类似地制备抗-TLT-1 Fab和更短的茎肽(hTLT-1.129-142)之间的复合物，例外是，hTLT-1.129-142和Fab之间的摩尔比为1.5:1，并省略凝胶过滤柱，这是由于与更长的茎肽( hTLT-1.126-162)相比，hTLT-1.129-142的结合更弱。

Fab0100:hTLT-1.129-142和Fab0100:hTLT-1.126-162 复合物的结晶和数据收集：通过坐滴（sitting drop）方法，在室温结晶Fab0100:hTLT-1.129-142和Fab0100:hTLT-1.126-162 复合物。通过以1:2 体积比(沉淀剂:蛋白)向蛋白溶液中加入含有0.04 M磷酸二氢钾、16%w/v PEG 8,000和20%甘油的沉淀溶液，结晶Fab0100:hTLT-1.129-142；同时通过以1:1 体积比(沉淀剂:蛋白)向蛋白溶液中加入含有20%w/v PEG 10,000和0.10 M Hepes（pH 7.5）的沉淀溶液，结晶Fab0100:hTLT-1.126-162 复合物。在液氮中快速冷冻Fab0100:hTLT-1.129-142 复合物的晶体，并在数据收集期间，通过低温N₂ 气流保持在100 K。随后使用Rigaku MicroMax-007 HF旋转阳极和marCCD 165 X-射线检测器，收集结晶学数据至2.14 ?分辨率。通过XDS软件包(Kabsch,W. (1993) J. Appl. Crystallogr. 26, 795-800)，进行空间群测定、数据的积分和标定。晶体的晶胞参数分别被测定为82.10、64.99、107.73 ?、90°、95.12°和90°（对于a、b、c、α、β和γ），空间群被测定为C2。数据集的强度的R_sym被计算为6.5%。使用来自PDB-沉积的(Berman,H.M. 等人(2000) Nucleic Acids Res. 28, 235-242) 1NGZ结构(Yin,J. 等人PNAS us 100, 856-861)的Fab模型的坐标，用于抗-TLT-1 Fab分子的结构测定。所述1NGZ Fab模型被分成2个结构域：可变结构域和恒定结构域，然后在CCP4套件(Bailey,S. (1994) Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 50, 760-763)的phaser软件程序(Mccoy,A.J. 等人Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography 61, 458-464; Mccoy,A.J. 等人J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674)的分子置换运行中将它们用作独立检索模型。ARP-wARP软件包(Evrard,G.X. 等人Acta Crystallographica Section D 63, 108-117)随后用于自动化建模和定相。使用refmac5 软件程序(Murshudov,G.N. 等人Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 53, 240-255)进行额外的晶体学精修，随后使用Coot软件程序(Emsley,P. 等人Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 60, 2126-2132)，进行电子密度图谱的计算机图形学检查、模型校正和建模。循环所述操作，直到对模型不再做出其它重要改进。在3个人工干预周期和随后的精致以后，最终计算的R-和R-free分别是0.185和0.245，所述模型表现出的离理想键长度的均方根偏差(RMSD)为0.022 ?。

将Fab0100:hTLT-1.126-162 复合物的晶体转移至含有75%沉淀剂溶液和25%甘油的低温溶液。允许所述晶体浸泡约15 秒，然后在液氮中快速冷冻，并在数据收集期间，通过低温N₂ 气流保持在100 K。随后在束线BL911-3（MAX-lab, Lund, Sweden）上，收集结晶学数据至1.85 ?分辨率(Ursby,T. 等人(2004) AIP Conference Proceedings 705, 1241-1246)。通过XDS软件包，进行空间群测定、数据的积分和标定。同步加速器数据的晶胞参数分别被测定为82.54、65.32、108.05 ?、90°、95.15°和90°（对于a、b、c、α、β和γ），空间群被测定为C2。数据集的强度的R_sym被计算为6.7%。所述晶体与Fab0100:hTLT-1.129-142晶体同形，因此Fab0100:hTLT-1.129-142 复合物的刚体精化被用于Fab0100:hTLT-1.126-162的起始相，随后使用ARP-wARP软件包进行自动化的建模和定相。使用REFMAC5 软件程序进行额外的晶体学精修，随后使用Coot软件程序，进行电子密度图谱的计算机图形学检查、模型校正和建模。循环所述操作，直到对模型不再做出其它重要改进。在13个人工干预周期和随后的精致以后，最终计算的R-和R-free分别是0.171和0.223，所述模型表现出的离理想键长度的均方根偏差RMSD为0.027 ?(表13)。

结果

如表14和15所示，抗TLT-1有效地结合TLT-1的茎。使用CCP4程序套件的软件程序AREAIMOL，计算出在抗-TLT-1和TLT-1 之间的配对相互作用中排除的平均面积是764 ?²。为Fab0100:hTLT-1.126-162 复合物给出的在抗-TLT-1和TLT-1 之间的配对相互作用中排除的平均面积分别是656和871 ?²。

在TLT-1 肽(hTLT-1.126-162)中与Fab0100: hTLT-1.126-162 复合物中的抗-TLT-1 Fab直接接触的残基被定义为表位，且在抗-TLT-1 Fab中与Fab0100: hTLT-1.126-162 复合物中的hTLT-1.126-162 直接接触的残基被定义为互补位。通过运行CCP4程序套件的contacts软件，使用抗-TLT-1 Fab和TLT-1分子之间的4.0 ?截止距离，鉴别出表位和互补位残基。在表14和15中，显示了Fab0100:hTLT-1.126-162 复合物晶体结构的接触计算结果。发现抗-TLT-1的得到的TLT-1 表位包含SEQ ID NO 7的下述残基：Lys 8 (133)、Ile 9 (134)、Gly 10 (135)、Ser 11 (136)、Leu 12 (137)、Ala 13 (138)、Asn 15 (140)、Ala 16 (141)、Phe 17 (142)、Ser 18 (143)、Asp 19 (144)、Pro 20 (145)、Ala 21 (142)，其中在括号中的数字表示在SEQ ID NO 2 中的对应残基(表14和15)。

得到的互补位包括：与SEQ ID NO 163 (表14)相对应的Fab0100 轻链的残基His 31、Asn 33、Tyr 37、His 39、Tyr 54、Phe 60、Ser 96、Thr 97、Val 99和Tyr 101，和与SEQ ID NO 162 (表15)相对应的Fab0100 重链的残基Val 2、Phe 27、Arg 31、Tyr 32、Trp 33、Glu 50、Thr 57、Asn 59、Ser 98、Gly 99、Val 100和Thr 102。在表14和15中也指出了参与氢结合的TLT-1 表位残基。

表13: 通过软件程序refmac5对观察到的Fab0100:hTLT-1.126-162 复合物数据进行X-射线模型精化的结果。

注释3  精化.

注释3  程序: REFMAC 5.5.0109

注释3  作者: MURSHUDOV,VAGIN,DODSON

注释3

注释3  精化目标: 最大可能性

注释3

注释3  在精化中使用的数据.

注释3  分辨率范围高(埃)：1.85

注释3  分辨率范围低(埃)：34.18

注释3  数据截止(SIGMA(F)): 无

注释3  范围的完全性(%)：99.89

注释3  反射数目：46512

注释3

注释3  拟合在精化中使用的数据.

注释3  交叉确认方法：到处

注释3  自由R值检验设定选择：随机

注释3  R值(工作集+试验集): 0.17330

注释3  R值(工作集)：0.17070

注释3  自由R值：0.22260

注释3  自由R值试验集大小(%)：5.0

注释3  自由R值试验集计数：2463

注释3

注释3  装配进最高分辨率BIN.

注释3  使用的BIN的总数：20

注释3  BIN分辨率范围高：1.850

注释3  BIN分辨率范围低：1.898

注释3  在BIN中的反射工作集)：3409

注释3  BIN完全性(工作集+试验集) (%)：99.81

注释3  BIN R值(工作集)：0.266

注释3  BIN自由R值设定计数：195

注释3  BIN自由R值：0.309

注释3

注释3  在精化中使用的非氢原子的数目.

注释3  所有原子：3993

注释3

注释3  B值.

注释3  来自WILSON图(A**2): 空

注释3  平均B值(全部, A**2)：14.967

注释3  全部非均质B值.

注释3  B11 (A**2)：-0.06

注释3  B22 (A**2)：0.23

注释3  B33 (A**2)：-0.24

注释3  B12 (A**2)：0.00

注释3  B13 (A**2)：-0.36

注释3  B23 (A**2)：0.00

注释3

注释3  估测的全部坐标误差.

注释3  基于R值的ESU(A)：0.116

注释3  基于自由R值的ESU (A)：0.123

注释3  基于最大可能性的ESU(A)：0.084

注释3  基于最大可能性的B值的ESU (A**2)：6.165

注释3

注释3  相关系数.

注释3  相关系数FO-FC：0.963

注释3  相关系数FO-FC FREE：0.939

注释3

注释3  离理想值计数RMS加权的RMS偏差

注释3  键长度精化的原子(A)：3538; 0.027; 0.022

注释3  键角精化的原子(DEGREES)：4833; 2.132; 1.958

注释3  扭转角，时期1 (度)：473; 6.972; 5.000

注释3  扭转角，时期2 (度)：137;35.607;24.453

注释3  扭转角，时期3 (度)：583;14.216;15.000

注释3  扭转角，时期4 (度)：14;23.096;15.000

注释3  手性中心遏制(A**3)：552; 0.180; 0.200

注释3  一般平面精化的原子(A)：2664; 0.013; 0.021

注释3

注释3  均质的热因子遏制. 计数RMS加权

注释3  主链键精化的原子(A**2)：2262; 1.399; 1.500

注释3  主链角精化的原子(A**2)：3679; 2.333; 2.000

注释3  侧链键精化的原子(A**2)：1276; 3.462; 3.000

注释3  侧链角精化的原子(A**2)：1139; 5.231; 4.500

注释3

注释3  NCS遏制统计学

注释3  NCS组的数目: 空

注释3

注释3  双晶细节

注释3  双晶结构域的数目：空

注释3

注释3

注释3  TLS细节

注释3  TLS组的数目：2

注释3  原子记录仅含有残余的B因子

注释3

注释3  TLS组：1

注释3  组分组的数目：3

注释3  组分C SSSEQI至C SSSEQI

注释3  残基范围：L 1 L 109

注释3  残基范围：H 1 H 113

注释3  残基范围：P 7 P 21

注释3  组的起点(A)：-4.1790   48.4400        34.3450

注释3  T张量

注释3  T11：0.1731       T22：0.1937

注释3  T33：0.1093       T12：-0.0155

注释3  T13：-0.0164      T23：-0.0192

注释3  L张量

注释3  L11：1.9367       L22：0.4840

注释3  L33：3.8383       L12：-0.1522

注释3  L13：-1.2215      L23：-0.1172

注释3  S张量

注释3  S11：0.0447 S12：-0.2657 S13：0.0758

注释3  S21：0.0958 S22：-0.0414 S23：-0.0674

注释3  S31：0.0036 S32：0.0098 S33：-0.0032

注释3

注释3  TLS组：2

注释3  组分组的数目：2

注释3  组分C SSSEQI至C SSSEQI

注释3  残基范围：L 114    L 219

注释3  残基范围：H 116    H 215

注释3  ORIGIN FOR THE组(A): -24.4360      51.7710     5.9920

注释3  T张量

注释3  T11：0.0252       T22：0.0170

注释3  T33：0.0735       T12：0.0161

注释3  T13：0.0018       T23：0.0048

注释3  L张量

注释3  L11：2.0324       L22：1.6905

注释3  L33：0.8461       L12：0.7328

注释3  L13：0.0695       L23：0.3337

注释3  S张量

注释3  S11：-0.0068 S12：0.0156 S13：0.0515

注释3  S21：-0.0127 S22：-0.0101 S23：0.1316

注释3  S31：-0.0077 S32：-0.0763 S33：0.0168

注释3

注释3

注释3  体积溶剂建模.

注释3  使用的方法：MASK

注释3  用于MASK计算的参数

注释3  VDW探测半径：1.40

注释3  离子探测半径：0.80

注释3  皱缩半径：0.80

注释3

注释3  其它精化注释：

注释3  氢已经添加在骑位

注释3  U值：仅残余

注释3

LINKR      SG  CYS L 139     SG ACYS L 199      SS

LINKR      SG  CYS H  22    SG ACYS H  96      SS

LINKR      SG ACYS H 141     SG ACYS H 197      SS

CISPEP   1 THR L    7    PRO L    8      0.00

CISPEP   2 VAL L   99    PRO L  100      0.00

CISPEP   3 TYR L  145    PRO L  146      0.00

CISPEP   4 PHE H  147    PRO H  148      0.00

CISPEP   5 GLU H  149    PRO H  150      0.00

表14

hTLT-1.126-162 “P”(SEQ ID NO 7)与Fab0100 轻链(SEQ ID NO 163)相互作用。使用4.0 ?的截止值。通过CCP4套件的CONTACT计算机程序，鉴别所述接触。在最后一列中，“***”指示，通过CONTACT计算出在该接触处(距离< 3.3 ?)的氢键高可能性，“*”指示低可能性(距离> 3.3 ?)。空白指示，该程序认为那里没有氢键的可能性。供体和受体之间的氢键是特异性的，通常是强的，且可容易地鉴别。

表15

hTLT-1.126-162 “P”(SEQ ID NO 7)与Fab0100 重链(SEQ ID NO 162)相互作用。使用4.0 ?的截止值。通过CCP4套件的CONTACT计算机程序，鉴别所述接触。在最后一列中，“***”指示，通过CONTACT计算出在该接触处(距离< 3.3 ?)的氢键高可能性，“*”指示低可能性(距离> 3.3 ?)。空白指示，该程序认为那里没有氢键的可能性。供体和受体之间的氢键是特异性的，通常是强的，且可容易地鉴别。

实施例48

通过肽行走（peptide walk）进行表位作图。肽行走ELISA会定义肽的最小结合区。这如下建立：在抗生蛋白链菌素平板中，用茎区中的1个残基移码包被生物素化的肽，随后结合目标抗体(mAb 0061)。加入用于检测的第二抗体，并在450 nm测量结合。阳性对照：结合生物素化的TLT-1。

材料

10X PBS: 10X GPBS 14200 Gibco

吐温20: Aldrich目录号27,434-8, 批号S30950-315

平板：96-孔抗生蛋白链菌素包被的平板Nunc#466014

BSA：A7030-100g，批号057K0737

封闭/稀释缓冲液：1X PBS pH=7.4

2%BSA

0.5%吐温20

洗涤缓冲液: 1xPBS + 0.5%吐温20

标准品: 生物素化的TLT-1 04/09-08 1 mg/ml

mAb：0197-0000-0061-4A - 0.55 mg/ml

检测Ab：山羊抗-人IgG HRP-标记的1mg/ml，产品号NEF802001EA

TMB底物：准备好使用，目录号4390L，批号70904

终止溶液: 2M H₃PO₄

生物素化的TLT-1的稀释：

1mg/ml -> 6.3ng/ml (158500x稀释)

在孔中的浓度：0.63 ng

生物素化的肽的稀释：

大约浓度2-5 mg/ml (2.5 mg/ml)

2.5mg/ml -> 10000x稀释液(25ng/孔): 在每个孔中100μl每种肽

mAb 0061的稀释

0.55mg/ml ->100ng/ml (5500x稀释)

在孔中的浓度：10 ng

mAb山羊抗-人IgG HRP的稀释：

1mg/ml -> 0.2μg/ml (5000x稀释)

以96孔形式合成生物素化的肽

使用标准的固相肽合成，合成生物素化的肽。使用二异丙基碳二亚胺(DIC)，偶联0.3M Fmoc-保护的氨基酸在0.3 M 1-羟基苯并三唑(HOBt)（在N-甲基吡咯烷酮(NMP)中）中的溶液1-4小时。在96 微量滴定滤板(Nunc)中使用Rink酰胺LL树脂(Merck)作为固体支持物，每个孔使用约20 mg树脂。使用来自德国Intavis的Multipep RS肽合成仪，进行所述合成，并使用生产商的方案。使用在NMP中的25%哌啶，去除Fmoc。所有肽在N-端偶联生物素，并使用8-氨基-3,6-二氧杂辛酸作为生物素和肽之间的隔离物。根据所述合成方案(IRIS biotech, 德国)，该隔离物也作为Fmoc-保护的结构单元进行偶联。

最终去保护和后处理

使用90%三氟醋酸(TFA)、5%三异丙基硅烷和5% H₂O，进行最终去保护3小时。每个孔使用共1 ml TFA。将TFA过滤至96个深孔(Nunc)，通过蒸发，将TFA的体积减小至约100- 200 ul/孔，将二乙醚加入所有孔中，以便沉淀出肽。将肽在二乙醚中的悬浮液转移至solvinert 96孔滤板(0.47 um, Millipore)，用二乙醚洗涤肽2次，并干燥。将肽重新溶解于80%DMSO和20%水中，得到约1-3 mg/ml的储备溶液。

来自TLT-1的茎区(SEQ ID NO 6)的生物素化的20聚体肽

2-5mg/ml，在75% DMSO/H₂O中(在N-端生物素化)：

在左侧显示肽的编号：

来自TLT-1的茎区(SEQ ID NO 6)的生物素化的16聚体肽

2-5mg/ml，在75% DMSO/H₂O中：

方法

表位作图包括：mAb 0061与来自TLT-1的茎区的2个系列的生物素化肽的结合。所述生物素化的肽被结合在抗生蛋白链菌素平板上。

茎肽：

LNILPPEEEEETHKIGSLAENAFSDPAGSANPLEPSQDEKSIPL

1)用1个残基移码，绘制20聚体肽的图谱(20,1) (参见材料)

2)用1个残基移码，绘制16聚体肽的图谱(16,1) (参见材料)

1. 用250μl洗涤缓冲液预洗涤平板3次

2. 加入100μl生物素化的肽-溶液(来自Masterplate 10000 X稀释，每个孔1个肽)

3. 在室温温育1小时，或在+5℃温育过夜

4. 用洗涤缓冲液洗涤3次

5. 加入100μl第一抗体(稀释度参见上面)

6. 在室温温育1小时

7. 用洗涤缓冲液洗涤3次

8. 加入100μl第二抗体(稀释度参见上面)

9. 在室温温育1小时

10. 用洗涤缓冲液洗涤3次

11. 加入100μl底物/显影缓冲液(反应时间3 min)

12. 加入100μl 2M H₃PO₄

13. 在450 nm读出终点

当在450 nm的吸光度大于3时，将孔中与生物素化的肽的结合记录为“结合”。当信号小于1时，记录“无结合”。将之间的信号记录为“弱结合”。

结果

以下述方式，将生物素化的肽放入孔中：

行A: 肽2-12 (20聚体)

行B: 肽13-24 (20聚体)

行C: 肽25-27 (20聚体)

行C: 肽29-36 (16聚体)

行D: 肽37-48 (16聚体)

行E: 肽49-58 (16聚体)

三重测定的结果:

 123456789101112A <0.1<0.1<0.1>3>3>3>3>3>3>3>3B>3>3>3>3<0.1<0.1<0.1<0.1<0.1<0.1<0.1<0.1C<0.1<0.1<0.1 <0.1<0.1<0.1<0.1<0.1<0.1<0.1>3D>3>3>3>3>3>3<0.1<0.1<0.1<0.1<0.1<0.1E<0.1<0.1<0.1<0.1<0.1<0.1<0.1<0.1<0.1<0.1  F            G            H            

总之，20聚体肽(5-16)产生与氨基酸IGSLAENAF相对应的强阳性信号(<3)。16聚体肽36-42产生与氨基酸KIGSLAENAF相对应的强阳性信号(<3)。

结论

肽行走ELISA已经将表位的用于结合mAb 0061的最小结合区定义为下面的氨基酸残基段：KIGSLAENAF。

该段实际上是上面通过晶体结构定义的表位（ETHKIGSLAENAFSDP）的一部分。

                         序列表

 

<110>  Novo Nordisk A/S

 

<120>  组织因子向活化的血小板的靶向

 

<130>  8076.204-WO

 

<150>  EP09168833.3

<151>  2009-08-27

 

<160>  163  

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  933

<212>  DNA

<213>  智人

 

<400>  1

atgggcctca ccctgctctt gctgctgctc ctgggactag aaggtcaggg catagttggc       60

 

agcctccctg aggtgctgca ggcacccgtg ggaagctcca ttctggtgca gtgccactac      120

 

aggctccagg atgtcaaagc tcagaaggtg tggtgccggt tcttgccgga ggggtgccag      180

 

cccctggtgt cctcagctgt ggatcgcaga gctccagcgg gcaggcgtac gtttctcaca      240

 

gacctgggtg ggggcctgct gcaggtggaa atggttaccc tgcaggaaga ggatgctggc      300

 

gagtatggct gcatggtgga tggggccagg gggccccaga ttttgcacag agtctctctg      360

 

aacatactgc ccccagagga agaagaagag acccataaga ttggcagtct ggctgagaac      420

 

gcattctcag accctgcagg cagtgccaac cctttggaac ccagccagga tgagaagagc      480

 

atccccttga tctggggtgc tgtgctcctg gtaggtctgc tggtggcagc ggtggtgctg      540

 

tttgctgtga tggccaagag gaaacaaggg aacaggcttg gtgtctgtgg ccgattcctg      600

 

agcagcagag tttcaggcat gaatccctcc tcagtggtcc accacgtcag tgactctgga      660

 

ccggctgctg aattgccttt ggatgtacca cacattaggc ttgactcacc accttcattt      720

 

gacaatacca cctacaccag cctacctctt gattccccat caggaaaacc ttcactccca      780

 

gctccatcct cattgccccc tctacctcct aaggtcctgg tctgctccaa gcctgtgaca      840

 

tatgccacag taatcttccc gggagggaac aagggtggag ggacctcgtg tgggccagcc      900

 

cagaatccac ctaacaatca gactccatcc agc                                   933

 

 

<210>  2

<211>  311

<212>  PRT

<213>  智人

 

<400>  2

 

Met Gly Leu Thr Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Leu Glu Gly Gln

1               5                   10                  15     

 

 

Gly Ile Val Gly Ser Leu Pro Glu Val Leu Gln Ala Pro Val Gly Ser

            20                  25                  30         

 

 

Ser Ile Leu Val Gln Cys His Tyr Arg Leu Gln Asp Val Lys Ala Gln

        35                  40                  45             

 

 

Lys Val Trp Cys Arg Phe Leu Pro Glu Gly Cys Gln Pro Leu Val Ser

    50                  55                  60                 

 

 

Ser Ala Val Asp Arg Arg Ala Pro Ala Gly Arg Arg Thr Phe Leu Thr

65                  70                  75                  80 

 

 

Asp Leu Gly Gly Gly Leu Leu Gln Val Glu Met Val Thr Leu Gln Glu

                85                  90                  95     

 

 

Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Gly Cys Met Val Asp Gly Ala Arg Gly Pro

            100                 105                 110        

 

 

Gln Ile Leu His Arg Val Ser Leu Asn Ile Leu Pro Pro Glu Glu Glu

        115                 120                 125            

 

 

Glu Glu Thr His Lys Ile Gly Ser Leu Ala Glu Asn Ala Phe Ser Asp

    130                 135                 140                

 

 

Pro Ala Gly Ser Ala Asn Pro Leu Glu Pro Ser Gln Asp Glu Lys Ser

145                 150                 155                 160

 

 

Ile Pro Leu Ile Trp Gly Ala Val Leu Leu Val Gly Leu Leu Val Ala

                165                 170                 175    

 

 

Ala Val Val Leu Phe Ala Val Met Ala Lys Arg Lys Gln Gly Asn Arg

            180                 185                 190        

 

 

Leu Gly Val Cys Gly Arg Phe Leu Ser Ser Arg Val Ser Gly Met Asn

        195                 200                 205            

 

 

Pro Ser Ser Val Val His His Val Ser Asp Ser Gly Pro Ala Ala Glu

    210                 215                 220                

 

 

Leu Pro Leu Asp Val Pro His Ile Arg Leu Asp Ser Pro Pro Ser Phe

225                 230                 235                 240

 

 

Asp Asn Thr Thr Tyr Thr Ser Leu Pro Leu Asp Ser Pro Ser Gly Lys

                245                 250                 255    

 

 

Pro Ser Leu Pro Ala Pro Ser Ser Leu Pro Pro Leu Pro Pro Lys Val

            260                 265                 270        

 

 

Leu Val Cys Ser Lys Pro Val Thr Tyr Ala Thr Val Ile Phe Pro Gly

        275                 280                 285            

 

 

Gly Asn Lys Gly Gly Gly Thr Ser Cys Gly Pro Ala Gln Asn Pro Pro

    290                 295                 300                

 

 

Asn Asn Gln Thr Pro Ser Ser

305                 310    

 

 

<210>  3

<211>  528

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "hTLT-1-His6的胞外结构域"

 

<400>  3

aagcttgccg ccaccatggg cctcaccctg ctcttgctgc tgctcctggg actagaaggt       60

 

cagggcatag ttggcagcct ccctgaggtg ctgcaggcac ccgtgggaag ctccattctg      120

 

gtgcagtgcc actacaggct ccaggatgtc aaagctcaga aggtgtggtg ccggttcttg      180

 

ccggaggggt gccagcccct ggtgtcctca gctgtggatc gcagagctcc ggcgggcagg      240

 

cgtacgtttc tcacagacct gggtgggggc ctgctgcagg tggaaatggt taccctgcag      300

 

gaagaggatg ctggcgagta tggctgcatg gtggatgggg ccagggggcc ccagattttg      360

 

cacagagtct ctctgaacat actgccccca gaggaagaag aagagaccca taagattggc      420

 

agtctggctg agaacgcatt ctcagaccct gcaggcagtg ccaacccttt ggaacccagc      480

 

caggatgaga agagcatccc ccaccatcac catcaccatt aagaattc                   528

 

 

<210>  4

<211>  168

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "hTLT-1-His6的胞外结构域"

 

<400>  4

 

Met Gly Leu Thr Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Leu Glu Gly Gln

1               5                   10                  15     

 

 

Gly Ile Val Gly Ser Leu Pro Glu Val Leu Gln Ala Pro Val Gly Ser

            20                  25                  30         

 

 

Ser Ile Leu Val Gln Cys His Tyr Arg Leu Gln Asp Val Lys Ala Gln

        35                  40                  45             

 

 

Lys Val Trp Cys Arg Phe Leu Pro Glu Gly Cys Gln Pro Leu Val Ser

    50                  55                  60                 

 

 

Ser Ala Val Asp Arg Arg Ala Pro Ala Gly Arg Arg Thr Phe Leu Thr

65                  70                  75                  80 

 

 

Asp Leu Gly Gly Gly Leu Leu Gln Val Glu Met Val Thr Leu Gln Glu

                85                  90                  95     

 

 

Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Gly Cys Met Val Asp Gly Ala Arg Gly Pro

            100                 105                 110        

 

 

Gln Ile Leu His Arg Val Ser Leu Asn Ile Leu Pro Pro Glu Glu Glu

        115                 120                 125            

 

 

Glu Glu Thr His Lys Ile Gly Ser Leu Ala Glu Asn Ala Phe Ser Asp

    130                 135                 140                

 

 

Pro Ala Gly Ser Ala Asn Pro Leu Glu Pro Ser Gln Asp Glu Lys Ser

145                 150                 155                 160

 

 

Ile Pro His His His His His His

                165            

 

 

<210>  5

<211>  106

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "hTLT-1.20-125"

 

<400>  5

 

Gly Ser Leu Pro Glu Val Leu Gln Ala Pro Val Gly Ser Ser Ile Leu

1               5                   10                  15     

 

 

Val Gln Cys His Tyr Arg Leu Gln Asp Val Lys Ala Gln Lys Val Trp

            20                  25                  30         

 

 

Cys Arg Phe Leu Pro Glu Gly Cys Gln Pro Leu Val Ser Ser Ala Val

        35                  40                  45             

 

 

Asp Arg Arg Ala Pro Ala Gly Arg Arg Thr Phe Leu Thr Asp Leu Gly

    50                  55                  60                 

 

 

Gly Gly Leu Leu Gln Val Glu Met Val Thr Leu Gln Glu Glu Asp Ala

65                  70                  75                  80 

 

 

Gly Glu Tyr Gly Cys Met Val Asp Gly Ala Arg Gly Pro Gln Ile Leu

                85                  90                  95     

 

 

His Arg Val Ser Leu Asn Ile Leu Pro Pro

            100                 105    

 

 

<210>  6

<211>  147

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "hTLT-1.16-162"

 

<400>  6

 

Gln Gly Ile Val Gly Ser Leu Pro Glu Val Leu Gln Ala Pro Val Gly

1               5                   10                  15     

 

 

Ser Ser Ile Leu Val Gln Cys His Tyr Arg Leu Gln Asp Val Lys Ala

            20                  25                  30         

 

 

Gln Lys Val Trp Cys Arg Phe Leu Pro Glu Gly Cys Gln Pro Leu Val

        35                  40                  45             

 

 

Ser Ser Ala Val Asp Arg Arg Ala Pro Ala Gly Arg Arg Thr Phe Leu

    50                  55                  60                 

 

 

Thr Asp Leu Gly Gly Gly Leu Leu Gln Val Glu Met Val Thr Leu Gln

65                  70                  75                  80 

 

 

Glu Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Gly Cys Met Val Asp Gly Ala Arg Gly

                85                  90                  95     

 

 

Pro Gln Ile Leu His Arg Val Ser Leu Asn Ile Leu Pro Pro Glu Glu

            100                 105                 110        

 

 

Glu Glu Glu Thr His Lys Ile Gly Ser Leu Ala Glu Asn Ala Phe Ser

        115                 120                 125            

 

 

Asp Pro Ala Gly Ser Ala Asn Pro Leu Glu Pro Ser Gln Asp Glu Lys

    130                 135                 140                

 

 

Ser Ile Pro

145        

 

 

<210>  7

<211>  37

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "hTLT-1.126-162"

 

<400>  7

 

Glu Glu Glu Glu Glu Thr His Lys Ile Gly Ser Leu Ala Glu Asn Ala

1               5                   10                  15     

 

 

Phe Ser Asp Pro Ala Gly Ser Ala Asn Pro Leu Glu Pro Ser Gln Asp

            20                  25                  30         

 

 

Glu Lys Ser Ile Pro

        35         

 

 

<210>  8

<211>  14

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "hTLT-1.129-142"

 

<400>  8

 

Glu Glu Thr His Lys Ile Gly Ser Leu Ala Glu Asn Ala Phe

1               5                   10                 

 

 

<210>  9

<211>  396

<212>  DNA

<213>  智人

 

<400>  9

atgaagttgc ctgttgggct gttggtgctg atgttctgga ttccagcttc cagcagtgat       60

 

gttgtgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc      120

 

tcttgcagat ctagtcagag ccttgtacac agaaatggaa acacctattt tcattggtgc      180

 

ctgcagaaac caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct      240

 

ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc      300

 

agagtggagg ctgaggatct gggagtttat ttctgctctc aaagtacaca tgttccgtac      360

 

acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaacgt                                396

 

 

<210>  10

<211>  132

<212>  PRT

<213>  智人

 

<400>  10

 

Met Lys Leu Pro Val Gly Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala

1               5                   10                  15     

 

 

Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val

            20                  25                  30         

 

 

Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu

        35                  40                  45             

 

 

Val His Arg Asn Gly Asn Thr Tyr Phe His Trp Cys Leu Gln Lys Pro

    50                  55                  60                 

 

 

Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

65                  70                  75                  80 

 

 

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

                85                  90                  95     

 

 

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys

            100                 105                 110        

 

 

Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

        115                 120                 125            

 

 

Glu Ile Lys Arg

    130        

 

 

<210>  11

<211>  396

<212>  DNA

<213>  智人

 

<400>  11

atggattttg ggctgatttt ttttattgtt gctcttttaa aaggggtcca gtgtgaggtg       60

 

aaacttctcg agtctggagg tggcctggtg cagcctggag gatccctgaa actctcctgt      120

 

gcagcctcag gattcgattt tagtagatac tggatgactt gggtccggca ggctccaggg      180

 

aaagggctag aatggattgg agaaattaat ccagatagca gtacgataaa ctatacgcca      240

 

tctctaaagg ataaattcat catctccaga gacaacgcca agaatacgct gtacctgcaa      300

 

atgagcgaag tgagatctga ggacacagcc ctttattact gtgcaagcgg ggtgtttact      360

 

tcctggggcc aagggactct ggtcactgtc tctgca                                396

 

 

<210>  12

<211>  132

<212>  PRT

<213>  智人

 

<400>  12

 

Met Asp Phe Gly Leu Ile Phe Phe Ile Val Ala Leu Leu Lys Gly Val

1               5                   10                  15     

 

 

Gln Cys Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

            20                  25                  30         

 

 

Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser

        35                  40                  45             

 

 

Arg Tyr Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

    50                  55                  60                 

 

 

Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro

65                  70                  75                  80 

 

 

Ser Leu Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr

                85                  90                  95     

 

 

Leu Tyr Leu Gln Met Ser Glu Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr

            100                 105                 110        

 

 

Tyr Cys Ala Ser Gly Val Phe Thr Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

        115                 120                 125            

 

 

Thr Val Ser Ala

    130        

 

 

<210>  13

<211>  657

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "TF (1-219)"

 

<400>  13

tcaggcacta caaatactgt ggcagcatat aatttaactt ggaaatcaac taatttcaag       60

 

acaattttgg agtgggaacc caaacccgtc aatcaagtct acactgttca aataagcact      120

 

aagtcaggag attggaaaag caaatgcttt tacacaacag acacagagtg tgacctcacc      180

 

gacgagattg tgaaggatgt gaagcagacg tacttggcac gggtcttctc ctacccggca      240

 

gggaatgtgg agagcaccgg ttctgctggg gagcctctgt atgagaactc cccagagttc      300

 

acaccttacc tggagacaaa cctcggacag ccaacaattc agagttttga acaggtggga      360

 

acaaaagtga atgtgaccgt agaagatgaa cggactttag tcagaaggaa caacactttc      420

 

ctaagcctcc gggatgtttt tggcaaggac ttaatttata cactttatta ttggaaatct      480

 

tcaagttcag gaaagaaaac agccaaaaca aacactaatg agtttttgat tgatgtggat      540

 

aaaggagaaa actactgttt cagtgttcaa gcagtgattc cctcccgaac agttaaccgg      600

 

aagagtacag acagcccggt agagtgtatg ggccaggaga aaggggaatt tagagaa         657

 

 

<210>  14

<211>  219

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "TF (1-219)"

 

<400>  14

 

Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser

1               5                   10                  15     

 

 

Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln

            20                  25                  30         

 

 

Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys

        35                  40                  45             

 

 

Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val

    50                  55                  60                 

 

 

Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala

65                  70                  75                  80 

 

 

Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn

                85                  90                  95     

 

 

Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr

            100                 105                 110        

 

 

Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu

        115                 120                 125            

 

 

Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg

    130                 135                 140                

 

 

Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser

145                 150                 155                 160

 

 

Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu

                165                 170                 175    

 

 

Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val

            180                 185                 190        

 

 

Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu

        195                 200                 205            

 

 

Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu

    210                 215                

 

 

<210>  15

<211>  885

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "人组织因子"

 

<400>  15

atggagaccc ctgcctggcc ccgggtcccg cgccccgaga ccgccgtcgc tcggacgctc       60

 

ctgctcggct gggtcttcgc ccaggtggcc ggcgcttcag gcactacaaa tactgtggca      120

 

gcatataatt taacttggaa atcaactaat ttcaagacaa ttttggagtg ggaacccaaa      180

 

cccgtcaatc aagtctacac tgttcaaata agcactaagt caggagattg gaaaagcaaa      240

 

tgcttttaca caacagacac agagtgtgac ctcaccgacg agattgtgaa ggatgtgaag      300

 

cagacgtact tggcacgggt cttctcctac ccggcaggga atgtggagag caccggttct      360

 

gctggggagc ctctgtatga gaactcccca gagttcacac cttacctgga gacaaacctc      420

 

ggacagccaa caattcagag ttttgaacag gtgggaacaa aagtgaatgt gaccgtagaa      480

 

gatgaacgga ctttagtcag aaggaacaac actttcctaa gcctccggga tgtttttggc      540

 

aaggacttaa tttatacact ttattattgg aaatcttcaa gttcaggaaa gaaaacagcc      600

 

aaaacaaaca ctaatgagtt tttgattgat gtggataaag gagaaaacta ctgtttcagt      660

 

gttcaagcag tgattccctc ccgaacagtt aaccggaaga gtacagacag cccggtagag      720

 

tgtatgggcc aggagaaagg ggaattcaga gaaatattct acatcattgg agctgtggta      780

 

tttgtggtca tcatccttgt catcatcctg gctatatctc tacacaagtg tagaaaggca      840

 

ggagtggggc agagctggaa ggagaactcc ccactgaatg tttca                      885

 

 

<210>  16

<211>  295

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "人组织因子"

 

<400>  16

 

Met Glu Thr Pro Ala Trp Pro Arg Val Pro Arg Pro Glu Thr Ala Val

1               5                   10                  15     

 

 

Ala Arg Thr Leu Leu Leu Gly Trp Val Phe Ala Gln Val Ala Gly Ala

            20                  25                  30         

 

 

Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser

        35                  40                  45             

 

 

Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln

    50                  55                  60                 

 

 

Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys

65                  70                  75                  80 

 

 

Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val

                85                  90                  95     

 

 

Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala

            100                 105                 110        

 

 

Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn

        115                 120                 125            

 

 

Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr

    130                 135                 140                

 

 

Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu

145                 150                 155                 160

 

 

Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg

                165                 170                 175    

 

 

Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser

            180                 185                 190        

 

 

Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu

        195                 200                 205            

 

 

Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val

    210                 215                 220                

 

 

Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu

225                 230                 235                 240

 

 

Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu Ile Phe Tyr Ile Ile

                245                 250                 255    

 

 

Gly Ala Val Val Phe Val Val Ile Ile Leu Val Ile Ile Leu Ala Ile

            260                 265                 270        

 

 

Ser Leu His Lys Cys Arg Lys Ala Gly Val Gly Gln Ser Trp Lys Glu

        275                 280                 285            

 

 

Asn Ser Pro Leu Asn Val Ser

    290                 295

 

 

<210>  17

<211>  1377

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "mAb 0012 HC"

 

<400>  17

atggattttg ggctgatttt ttttattgtt gctcttttaa aaggggtcca gtgtgaggtg       60

 

aaacttctcg agtctggagg tggcctggtg cagcctggag gatccctgaa actctcctgt      120

 

gcagcctcag gattcgattt tagtagatac tggatgactt gggtccggca ggctccaggg      180

 

aaagggctag aatggattgg agaaattaat ccagatagca gtacgataaa ctatacgcca      240

 

tctctaaagg ataaattcat catctccaga gacaacgcca agaatacgct gtacctgcaa      300

 

atgagcgaag tgagatctga ggacacagcc ctttattact gtgcaagcgg ggtgtttact      360

 

tcctggggcc aagggactct ggtcactgtc tctgcagcta gcaccaaggg cccatccgtc      420

 

ttccccctgg cgccctgctc caggagcacc tccgagagca cagccgccct gggctgcctg      480

 

gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc      540

 

ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg      600

 

gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacg aagacctaca cctgcaacgt agatcacaag      660

 

cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt gagtccaaat atggtccccc atgcccacca      720

 

tgcccagcac ctgagttcct ggggggacca tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag      780

 

gacactctca tgatctcccg gacccctgag gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag      840

 

gaagaccccg aggtccagtt caactggtac gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag      900

 

acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc      960

 

ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc     1020

 

ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg     1080

 

tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg     1140

 

gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag     1200

 

aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctctacagc     1260

 

aggctaaccg tggacaagag caggtggcag gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg     1320

 

catgaggctc tgcacaacca ctacacacag aagagcctct ccctgtctct gggtaaa        1377

 

 

<210>  18

<211>  714

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "mAb 0012 LC, Fab 0012 LC"

 

<400>  18

atgaagttgc ctgttgggct gttggtgctg atgttctgga ttccagcttc cagcagtgat       60

 

gttgtgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc      120

 

tcttgcagat ctagtcagag ccttgtacac agaaatggaa acacctattt tcattggtgc      180

 

ctgcagaaac caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct      240

 

ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc      300

 

agagtggagg ctgaggatct gggagtttat ttctgctctc aaagtacaca tgttccgtac      360

 

acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaacgtacgg tggctgcacc atctgtcttc      420

 

atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg      480

 

aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg      540

 

ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc      600

 

agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc      660

 

acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt            714

 

 

<210>  19

<211>  1401

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "mAb 0023 HC"

 

<400>  19

atgaacttgg ggctcagctt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt ccagtgtgaa       60

 

gtgaggctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc      120

 

tgtgcaacct ctggattcac tttcagtgac tatttcatgt attggattcg ccagactcca      180

 

gagaagaggc tggagtgggt cgcatacatt agtaatggtg gtgatagcag ctcttatcca      240

 

gacactgtaa agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg      300

 

caaatgagcc gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt attgtgcaac aaataaaaac      360

 

tgggacgatt actatgatat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca      420

 

gctagcacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag      480

 

agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg      540

 

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca      600

 

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc      660

 

tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc      720

 

aaatatggtc ccccatgccc accatgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc      780

 

ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg      840

 

tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat      900

 

ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac      960

 

cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag     1020

 

tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa     1080

 

gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag     1140

 

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag     1200

 

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc     1260

 

gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg     1320

 

aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc     1380

 

ctctccctgt ctctgggtaa a                                               1401

 

 

<210>  20

<211>  717

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "mAb 0023 LC"

 

<400>  20

atggattcac aggcccaggt tcttatattg ctgctgctat gggtatctgg ttcctgtggg       60

 

gacattgtgg tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact      120

 

atgagttgca aatccagtca gagtctgctc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct      180

 

tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg      240

 

gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc      300

 

atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttataatctg      360

 

ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaacgta cggtggctgc accatctgtc      420

 

ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg      480

 

ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa      540

 

tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc      600

 

agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa      660

 

gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt         717

 

 

<210>  21

<211>  1401

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "mAb 0051 HC"

 

<400>  21

atgggttgga gctgtatcat cttctttctg gtagcaacag ctacaggtgt gcactcccag       60

 

gtccagctgg agcagtctgg ggctgagctg gtgaggcctg gggtctcagt gaagatttcc      120

 

tgcaagggtt ctggctacac attcactgat tattctatgc actgggtgaa gcagagtcat      180

 

gcaaagagtc tagagtggat tggagttatt agtacttact atggtgatgt taggtacaac      240

 

cagaagttca agggcaaggc cacaatgact gtagacaaat cctccagcac agcctatatg      300

 

gcacttgcca gactgacatc tgaggattct gccatctatt actgtgcaag agcccctatg      360

 

attacgacag gggcctggtt tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca      420

 

gctagcacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag      480

 

agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg      540

 

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca      600

 

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc      660

 

tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc      720

 

aaatatggtc ccccatgccc accatgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc      780

 

ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg      840

 

tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat      900

 

ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac      960

 

cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag     1020

 

tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa     1080

 

gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag     1140

 

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag     1200

 

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc     1260

 

gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg     1320

 

aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc     1380

 

ctctccctgt ctctgggtaa a                                               1401

 

 

<210>  22

<211>  702

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "mAb 0051 LC"

 

<400>  22

atgaagtcac agacccaggt cttcgtattt ctactgctct gtgtgtctgg tgctcatggg       60

 

agtattgtga tgacccagac tcccaaattc ctgcttgtat cagcaggaga cagggttacc      120

 

ataacctgca aggccagtca gagtgtgagt aatgatgtag cttggtacca acagaagcca      180

 

gggcagtctc ctaaactgct gataaactat gcatccagtc gctacactgg aatccctgat      240

 

cgcttcactg gcagtggata tgggacggat ttcactttca ccatcagcac tgtgcaggct      300

 

gaagacctgg cagtttattt ctgtcagcag gattatagct ctccgtacac gttcggaggg      360

 

gggaccaagc tggaaataga acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca      420

 

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat      480

 

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag      540

 

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg      600

 

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc      660

 

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt                         702

 

 

<210>  23

<211>  1404

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "mAb 0052 HC"

 

<400>  23

atggaatgga cctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccattcccag       60

 

gtccagctgc agcagtctgg agctgagccg atgaagcctg gggcctcagt gaagatatcc      120

 

tgcaaggcta ctggctacac atttagtagt cactggatag agtggataaa acagaggcct      180

 

ggacatggcc ttgagtggat tggagagatt ttacctggaa gtggaaatac taattacaat      240

 

gagaaattca agggcaaggc cacattcact gcagatacat cctccaacac agcctacatg      300

 

caactcagca gcctgacatc tgaggactct gccgtctatt gctgtgcaag agggtactac      360

 

ggtcttaact acgactggta tttcgatgtc tggggcgcag ggaccacggt caccgtctcc      420

 

tcagctagca ccaagggccc atccgtcttc cccctggcgc cctgctccag gagcacctcc      480

 

gagagcacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg      540

 

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc      600

 

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacgaag      660

 

acctacacct gcaacgtaga tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag      720

 

tccaaatatg gtcccccatg cccaccatgc ccagcacctg agttcctggg gggaccatca      780

 

gtcttcctgt tccccccaaa acccaaggac actctcatga tctcccggac ccctgaggtc      840

 

acgtgcgtgg tggtggacgt gagccaggaa gaccccgagg tccagttcaa ctggtacgtg      900

 

gatggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagtt caacagcacg      960

 

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaacgg caaggagtac     1020

 

aagtgcaagg tctccaacaa aggcctcccg tcctccatcg agaaaaccat ctccaaagcc     1080

 

aaagggcagc cccgagagcc acaggtgtac accctgcccc catcccagga ggagatgacc     1140

 

aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct accccagcga catcgccgtg     1200

 

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac     1260

 

tccgacggct ccttcttcct ctacagcagg ctaaccgtgg acaagagcag gtggcaggag     1320

 

gggaatgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacacagaag     1380

 

agcctctccc tgtctctggg taaa                                            1404

 

 

<210>  24

<211>  1404

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "mAb 0062 HC"

 

<400>  24

atggaatgga cctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccattcccag       60

 

gtccagctgc agcagtctgg agctgagccg atgaagcctg gggcctcagt gaagatatcc      120

 

tgcaaggcta ctggctacac atttagtagt cactggatag agtggataaa acagaggcct      180

 

ggacatggcc ttgagtggat tggagagatt ttacctggaa gtggaaatac taattacaat      240

 

gagaaattca agggcaaggc cacattcact gcagatacat cctccaacac agcctacatg      300

 

caactcagca gcctgacatc tgaggactct gccgtctatt actgtgcaag agggtactac      360

 

ggtcttaact acgactggta tttcgatgtc tggggcgcag ggaccacggt caccgtctcc      420

 

tcagctagca ccaagggccc atccgtcttc cccctggcgc cctgctccag gagcacctcc      480

 

gagagcacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg      540

 

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc      600

 

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacgaag      660

 

acctacacct gcaacgtaga tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag      720

 

tccaaatatg gtcccccatg cccaccatgc ccagcacctg agttcctggg gggaccatca      780

 

gtcttcctgt tccccccaaa acccaaggac actctcatga tctcccggac ccctgaggtc      840

 

acgtgcgtgg tggtggacgt gagccaggaa gaccccgagg tccagttcaa ctggtacgtg      900

 

gatggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagtt caacagcacg      960

 

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaacgg caaggagtac     1020

 

aagtgcaagg tctccaacaa aggcctcccg tcctccatcg agaaaaccat ctccaaagcc     1080

 

aaagggcagc cccgagagcc acaggtgtac accctgcccc catcccagga ggagatgacc     1140

 

aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct accccagcga catcgccgtg     1200

 

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac     1260

 

tccgacggct ccttcttcct ctacagcagg ctaaccgtgg acaagagcag gtggcaggag     1320

 

gggaatgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacacagaag     1380

 

agcctctccc tgtctctggg taaa                                            1404

 

 

<210>  25

<211>  702

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "mAb 0052 LC, mAb 0062 LC"

 

<400>  25

atgatgtcct ctgctcagtt ccttggtctc ctgttgctct gttttcaagg taccagatgt       60

 

gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc      120

 

attagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca      180

 

gatggaactg ttaaactcct tatcttctac acatcaagat tacactcagg agtcccgtca      240

 

aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagat tattctctca ccattagcaa cctggaaccg      300

 

gaagatattg ccacttacta ttgccaacag gatactaagc ttccgtacac gttcggaggg      360

 

gggaccaaac tggagatgaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca      420

 

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat      480

 

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag      540

 

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg      600

 

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc      660

 

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt                         702

 

 

<210>  26

<211>  1377

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "mAb 0061 HC"

 

<400>  26

atggattttg ggctgatttt ttttattgtt gctcttttaa aaggggtcca gtgtgaggtg       60

 

aaacttctcg agtctggagg tggcctggtg cagcctggag gatccctgaa actctcctgt      120

 

gcagcctcag gattcgattt tagtagatac tggatgactt gggtccggca ggctccaggg      180

 

aaagggctag aatggattgg agaaattaat ccagatagca gtacgataaa ctataaccca      240

 

tctctaaagg ataaattcat catctccaga gacaacgcca agaatacgct gtacctgcaa      300

 

atgagcgaag tgagatctga ggacacagcc ctttattact gtgcaagcgg ggtgtttact      360

 

tcctggggcc aagggactct ggtcactgtc tctgcagcta gcaccaaggg cccatccgtc      420

 

ttccccctgg cgccctgctc caggagcacc tccgagagca cagccgccct gggctgcctg      480

 

gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc      540

 

ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg      600

 

gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacg aagacctaca cctgcaacgt agatcacaag      660

 

cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt gagtccaaat atggtccccc atgcccacca      720

 

tgcccagcac ctgagttcct ggggggacca tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag      780

 

gacactctca tgatctcccg gacccctgag gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag      840

 

gaagaccccg aggtccagtt caactggtac gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag      900

 

acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc      960

 

ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc     1020

 

ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg     1080

 

tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg     1140

 

gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag     1200

 

aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctctacagc     1260

 

aggctaaccg tggacaagag caggtggcag gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg     1320

 

catgaggctc tgcacaacca ctacacacag aagagcctct ccctgtctct gggtaaa        1377

 

 

<210>  27

<211>  1377

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "mAb 0082 HC"

 

<400>  27

atggattttg ggctgatttt ttttattgtt gctcttttaa aaggggtcca gtgtgaggtg       60

 

aaacttctcg agtctggagg tggcctggtg cagcctggag gatccctgaa actctcctgt      120

 

gcagcctcag gattcgattt tagtagatac tggatgactt gggtccggca ggctccaggg      180

 

aaagggctag aatggattgg agaaattaat ccagatagca gtacgataaa ctatgcgcca      240

 

tctctaaagg ataaattcat catctccaga gacaacgcca agaatacgct gtacctgcaa      300

 

atgagcgaag tgagatctga ggacacagcc ctttattact gtgcaagcgg ggtgtttact      360

 

tcctggggcc aagggactct ggtcactgtc tctgcagcta gcaccaaggg cccatccgtc      420

 

ttccccctgg cgccctgctc caggagcacc tccgagagca cagccgccct gggctgcctg      480

 

gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc      540

 

ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg      600

 

gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacg aagacctaca cctgcaacgt agatcacaag      660

 

cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt gagtccaaat atggtccccc atgcccacca      720

 

tgcccagcac ctgagttcct ggggggacca tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag      780

 

gacactctca tgatctcccg gacccctgag gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag      840

 

gaagaccccg aggtccagtt caactggtac gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag      900

 

acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc      960

 

ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc     1020

 

ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg     1080

 

tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg     1140

 

gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag     1200

 

aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctctacagc     1260

 

aggctaaccg tggacaagag caggtggcag gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg     1320

 

catgaggctc tgcacaacca ctacacacag aagagcctct ccctgtctct gggtaaa        1377

 

 

<210>  28

<211>  714

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "mAb 0061 LC, Fab 0061 LC, mAb 0082 LC, Fab 0082 LC"

 

<400>  28

atgaagttgc ctgttgggct gttggtgctg atgttctgga ttccagcttc cagcagtgat       60

 

gttgtgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc      120

 

tcttgcagat ctagtcagag ccttgtacac agaaatggaa acacctattt tcattgggcc      180

 

ctgcagaaac caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct      240

 

ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc      300

 

agagtggagg ctgaggatct gggagtttat ttctgctctc aaagtacaca tgttccgtac      360

 

acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaacgtacgg tggctgcacc atctgtcttc      420

 

atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg      480

 

aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg      540

 

ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc      600

 

agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc      660

 

acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt            714

 

 

<210>  29

<211>  699

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "Fab 0012 VH-CH1"

 

<400>  29

atggattttg ggctgatttt ttttattgtt gctcttttaa aaggggtcca gtgtgaggtg       60

 

aaacttctcg agtctggagg tggcctggtg cagcctggag gatccctgaa actctcctgt      120

 

gcagcctcag gattcgattt tagtagatac tggatgactt gggtccggca ggctccaggg      180

 

aaagggctag aatggattgg agaaattaat ccagatagca gtacgataaa ctatacgcca      240

 

tctctaaagg ataaattcat catctccaga gacaacgcca agaatacgct gtacctgcaa      300

 

atgagcgaag tgagatctga ggacacagcc ctttattact gtgcaagcgg ggtgtttact      360

 

tcctggggcc aagggactct ggtcactgtc tctgcagcta gcaccaaggg cccatccgtc      420

 

ttccccctgg cgccctgctc caggagcacc tccgagagca cagccgccct gggctgcctg      480

 

gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc      540

 

ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg      600

 

gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacg aagacctaca cctgcaacgt agatcacaag      660

 

cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt gagtccaaa                             699

 

 

<210>  30

<211>  723

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "Fab 0023 VH-CH1"

 

<400>  30

atgaacttgg ggctcagctt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt ccagtgtgaa       60

 

gtgaggctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc      120

 

tgtgcaacct ctggattcac tttcagtgac tatttcatgt attggattcg ccagactcca      180

 

gagaagaggc tggagtgggt cgcatacatt agtaatggtg gtgatagcag ctcttatcca      240

 

gacactgtaa agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg      300

 

caaatgagcc gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt attgtgcaac aaataaaaac      360

 

tgggacgatt actatgatat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca      420

 

gctagcacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag      480

 

agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg      540

 

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca      600

 

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc      660

 

tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc      720

 

aaa                                                                    723

 

 

<210>  31

<211>  723

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "Fab 0051 VH-CH1"

 

<400>  31

atgggttgga gctgtatcat cttctttctg gtagcaacag ctacaggtgt gcactcccag       60

 

gtccagctgg agcagtctgg ggctgagctg gtgaggcctg gggtctcagt gaagatttcc      120

 

tgcaagggtt ctggctacac attcactgat tattctatgc actgggtgaa gcagagtcat      180

 

gcaaagagtc tagagtggat tggagttatt agtacttact atggtgatgt taggtacaac      240

 

cagaagttca agggcaaggc cacaatgact gtagacaaat cctccagcac agcctatatg      300

 

gcacttgcca gactgacatc tgaggattct gccatctatt actgtgcaag agcccctatg      360

 

attacgacag gggcctggtt tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca      420

 

gctagcacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag      480

 

agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg      540

 

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca      600

 

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc      660

 

tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc      720

 

aaa                                                                    723

 

 

<210>  32

<211>  726

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "Fab 0052 VH-CH1"

 

<400>  32

atggaatgga cctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccattcccag       60

 

gtccagctgc agcagtctgg agctgagccg atgaagcctg gggcctcagt gaagatatcc      120

 

tgcaaggcta ctggctacac atttagtagt cactggatag agtggataaa acagaggcct      180

 

ggacatggcc ttgagtggat tggagagatt ttacctggaa gtggaaatac taattacaat      240

 

gagaaattca agggcaaggc cacattcact gcagatacat cctccaacac agcctacatg      300

 

caactcagca gcctgacatc tgaggactct gccgtctatt gctgtgcaag agggtactac      360

 

ggtcttaact acgactggta tttcgatgtc tggggcgcag ggaccacggt caccgtctcc      420

 

tcagctagca ccaagggccc atccgtcttc cccctggcgc cctgctccag gagcacctcc      480

 

gagagcacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg      540

 

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc      600

 

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacgaag      660

 

acctacacct gcaacgtaga tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag      720

 

tccaaa                                                                 726

 

 

<210>  33

<211>  699

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "Fab 0061 VH-CH1"

 

<400>  33

atggattttg ggctgatttt ttttattgtt gctcttttaa aaggggtcca gtgtgaggtg       60

 

aaacttctcg agtctggagg tggcctggtg cagcctggag gatccctgaa actctcctgt      120

 

gcagcctcag gattcgattt tagtagatac tggatgactt gggtccggca ggctccaggg      180

 

aaagggctag aatggattgg agaaattaat ccagatagca gtacgataaa ctataaccca      240

 

tctctaaagg ataaattcat catctccaga gacaacgcca agaatacgct gtacctgcaa      300

 

atgagcgaag tgagatctga ggacacagcc ctttattact gtgcaagcgg ggtgtttact      360

 

tcctggggcc aagggactct ggtcactgtc tctgcagcta gcaccaaggg cccatccgtc      420

 

ttccccctgg cgccctgctc caggagcacc tccgagagca cagccgccct gggctgcctg      480

 

gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc      540

 

ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg      600

 

gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacg aagacctaca cctgcaacgt agatcacaag      660

 

cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt gagtccaaa                             699

 

 

<210>  34

<211>  699

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "Fab 0082 VH-CH1"

 

<400>  34

atggattttg ggctgatttt ttttattgtt gctcttttaa aaggggtcca gtgtgaggtg       60

 

aaacttctcg agtctggagg tggcctggtg cagcctggag gatccctgaa actctcctgt      120

 

gcagcctcag gattcgattt tagtagatac tggatgactt gggtccggca ggctccaggg      180

 

aaagggctag aatggattgg agaaattaat ccagatagca gtacgataaa ctatgcgcca      240

 

tctctaaagg ataaattcat catctccaga gacaacgcca agaatacgct gtacctgcaa      300

 

atgagcgaag tgagatctga ggacacagcc ctttattact gtgcaagcgg ggtgtttact      360

 

tcctggggcc aagggactct ggtcactgtc tctgcagcta gcaccaaggg cccatccgtc      420

 

ttccccctgg cgccctgctc caggagcacc tccgagagca cagccgccct gggctgcctg      480

 

gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc      540

 

ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg      600

 

gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacg aagacctaca cctgcaacgt agatcacaag      660

 

cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt gagtccaaa                             699

 

 

<210>  35

<211>  720

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "Fab AP-3 VH-VH1"

 

<400>  35

atggaatgga gcggggtctt tatctttctc ttgtcagtaa ctgcagatgt ccactcccag       60

 

gtccagttgc agcagtctgg agctgagctg gtaaggcctg ggacttcagt gaagatatcc      120

 

tgcaaggctt ctggctacac cttcactaac tactggctag gttgggtaaa gcagaggcct      180

 

ggacatggac ttgagtggat tggagatatt taccctggag gtggttataa taagtacaat      240

 

gagaatttca agggcaaggc cacactgact gcagacacat cctccagcac tgcctacatg      300

 

cagctcagta gcctgacatc tgaggactct gctgtctatt tctgtgcaag agagtatggt      360

 

aactacgact atgctatgga ctcctggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctcagct      420

 

agcaccaagg gcccatccgt cttccccctg gcgccctgct ccaggagcac ctccgagagc      480

 

acagccgccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg      540

 

aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga      600

 

ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac gaagacctac      660

 

acctgcaacg tagatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tgagtccaaa      720

 

 

<210>  36

<211>  717

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "Fab AP-3 LC"

 

<400>  36

atgaggtgcc tagctgagtt cctggggctg cttgtgctct ggatccctgg agccattggg       60

 

gatattgtga tgactcaggc tgcaccctct gtacctgtca ctcctggaga gtcagtatcc      120

 

atctcctgca ggtctagtag gagtctcctg catagtaatg gcaacactta cttgtgttgg      180

 

ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcag ctcctgatat atcggatgtc caaccttgcc      240

 

tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa ctgctttcac actgagaatc      300

 

agtagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgta tgcaacatct agaatatcca      360

 

ttcacgttcg gctcggggac aaagttggaa ataaaacgta cggtggctgc accatctgtc      420

 

ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg      480

 

ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa      540

 

tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc      600

 

agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa      660

 

gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt         717

 

 

<210>  37

<211>  717

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "Fab-AP-3 LC.C34S"

 

<400>  37

atgaggtgcc tagctgagtt cctggggctg cttgtgctct ggatccctgg agccattggg       60

 

gatattgtga tgactcaggc tgcaccctct gtacctgtca ctcctggaga gtcagtatcc      120

 

atctcctgca ggtctagtag gagtctcctg catagtaatg gcaacactta cttgtcctgg      180

 

ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcag ctcctgatat atcggatgtc caaccttgcc      240

 

tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa ctgctttcac actgagaatc      300

 

agtagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgta tgcaacatct agaatatcca      360

 

ttcacgttcg gctcggggac aaagttggaa ataaaacgta cggtggctgc accatctgtc      420

 

ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg      480

 

ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa      540

 

tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc      600

 

agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa      660

 

gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt         717

 

 

<210>  38

<211>  741

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "hIgG4铰链-CH2-CH3"

 

<400>  38

atggattttg ggctgatttt ttttattgtt gctcttttaa aaggggtcca gtgtgagtcc       60

 

aaatatggtc ccccatgccc accatgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc      120

 

ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg      180

 

tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat      240

 

ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac      300

 

cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag      360

 

tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa      420

 

gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag      480

 

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag      540

 

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc      600

 

gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg      660

 

aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc      720

 

ctctccctgt ctctgggtaa a                                                741

 

 

<210>  39

<211>  459

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "mAb 0012, HC (小鼠VH-人IgG4 CH1-CH2-CH3)"

 

<400>  39

 

Met Asp Phe Gly Leu Ile Phe Phe Ile Val Ala Leu Leu Lys Gly Val

1               5                   10                  15     

 

 

Gln Cys Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

            20                  25                  30         

 

 

Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser

        35                  40                  45             

 

 

Arg Tyr Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

    50                  55                  60                 

 

 

Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro

65                  70                  75                  80 

 

 

Ser Leu Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr

                85                  90                  95     

 

 

Leu Tyr Leu Gln Met Ser Glu Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr

            100                 105                 110        

 

 

Tyr Cys Ala Ser Gly Val Phe Thr Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

        115                 120                 125            

 

 

Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

    130                 135                 140                

 

 

Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

145                 150                 155                 160

 

 

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

                165                 170                 175    

 

 

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

            180                 185                 190        

 

 

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

        195                 200                 205            

 

 

Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr

    210                 215                 220                

 

 

Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro

225                 230                 235                 240

 

 

Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

                245                 250                 255    

 

 

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

            260                 265                 270        

 

 

Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn

        275                 280                 285            

 

 

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

    290                 295                 300                

 

 

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

305                 310                 315                 320

 

 

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

                325                 330                 335    

 

 

Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

            340                 345                 350        

 

 

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu

        355                 360                 365            

 

 

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

    370                 375                 380                

 

 

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

385                 390                 395                 400

 

 

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

                405                 410                 415    

 

 

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly

            420                 425                 430        

 

 

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

        435                 440                 445            

 

 

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

    450                 455                

 

 

<210>  40

<211>  238

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "mAb 0012, LC (小鼠VL - 人κ CL); Fab 0012, LC

       (小鼠VL - 人κ CL)"

 

<400>  40

 

Met Lys Leu Pro Val Gly Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala

1               5                   10                  15     

 

 

Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val

            20                  25                  30         

 

 

Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu

        35                  40                  45             

 

 

Val His Arg Asn Gly Asn Thr Tyr Phe His Trp Cys Leu Gln Lys Pro

    50                  55                  60                 

 

 

Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

65                  70                  75                  80 

 

 

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

                85                  90                  95     

 

 

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys

            100                 105                 110        

 

 

Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

        115                 120                 125            

 

 

Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

    130                 135                 140                

 

 

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu

145                 150                 155                 160

 

 

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn

                165                 170                 175    

 

 

Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser

            180                 185                 190        

 

 

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala

        195                 200                 205            

 

 

Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly

    210                 215                 220                

 

 

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225                 230                 235            

 

 

<210>  41

<211>  467

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "mAb 0023, HC (小鼠VH-人IgG4 CH1-CH2-CH3)"

 

<400>  41

 

Met Asn Leu Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly

1               5                   10                  15     

 

 

Val Gln Cys Glu Val Arg Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

            20                  25                  30         

 

 

Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe

        35                  40                  45             

 

 

Ser Asp Tyr Phe Met Tyr Trp Ile Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu

    50                  55                  60                 

 

 

Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Asn Gly Gly Asp Ser Ser Ser Tyr Pro

65                  70                  75                  80 

 

 

Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

                85                  90                  95     

 

 

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Arg Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met

            100                 105                 110        

 

 

Tyr Tyr Cys Ala Thr Asn Lys Asn Trp Asp Asp Tyr Tyr Asp Met Asp

        115                 120                 125            

 

 

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

    130                 135                 140                

 

 

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu

145                 150                 155                 160

 

 

Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

                165                 170                 175    

 

 

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

            180                 185                 190        

 

 

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

        195                 200                 205            

 

 

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn

    210                 215                 220                

 

 

Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser

225                 230                 235                 240

 

 

Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly

                245                 250                 255    

 

 

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

            260                 265                 270        

 

 

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln

        275                 280                 285            

 

 

Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

    290                 295                 300                

 

 

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr

305                 310                 315                 320

 

 

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

                325                 330                 335    

 

 

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile

            340                 345                 350        

 

 

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

        355                 360                 365            

 

 

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

    370                 375                 380                

 

 

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

385                 390                 395                 400

 

 

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

                405                 410                 415    

 

 

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val

            420                 425                 430        

 

 

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

        435                 440                 445            

 

 

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

    450                 455                 460                

 

 

Leu Gly Lys

465        

 

 

<210>  42

<211>  239

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "mAb 0023, LC (小鼠VL - 人κ CL); Fab 0023, LC

       (小鼠VL - 人κ CL)"

 

<400>  42

 

Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Ile Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser

1               5                   10                  15     

 

 

Gly Ser Cys Gly Asp Ile Val Val Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala

            20                  25                  30         

 

 

Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser

        35                  40                  45             

 

 

Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln

    50                  55                  60                 

 

 

Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg

65                  70                  75                  80 

 

 

Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

                85                  90                  95     

 

 

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr

            100                 105                 110        

 

 

Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys

        115                 120                 125             

 

 

Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro

    130                 135                 140                

 

 

Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu

145                 150                 155                 160

 

 

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp

                165                 170                 175    

 

 

Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp

            180                 185                 190        

 

 

Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys

        195                 200                 205            

 

 

Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln

    210                 215                 220                

 

 

Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225                 230                 235                

 

 

<210>  43

<211>  467

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "mAb 0051, HC (小鼠VH-人IgG4 CH1-CH2-CH3)"

 

<400>  43

 

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Phe Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1               5                   10                  15     

 

 

Val His Ser Gln Val Gln Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg

            20                  25                  30         

 

 

Pro Gly Val Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe

        35                  40                  45             

 

 

Thr Asp Tyr Ser Met His Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Ser Leu

    50                  55                  60                 

 

 

Glu Trp Ile Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Val Arg Tyr Asn

65                  70                  75                  80 

 

 

Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser

                85                  90                  95     

 

 

Thr Ala Tyr Met Ala Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile

            100                 105                 110        

 

 

Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Pro Met Ile Thr Thr Gly Ala Trp Phe Ala

        115                 120                 125            

 

 

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys

    130                 135                 140                

 

 

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu

145                 150                 155                 160

 

 

Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

                165                 170                 175    

 

 

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

            180                 185                 190        

 

 

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

        195                 200                 205            

 

 

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn

    210                 215                 220                

 

 

Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser

225                 230                 235                 240

 

 

Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly

                245                 250                 255    

 

 

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

            260                 265                 270        

 

 

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln

        275                 280                 285            

 

 

Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

    290                 295                 300                

 

 

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr

305                 310                 315                 320

 

 

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

                325                 330                 335    

 

 

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile

            340                 345                 350        

 

 

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

        355                 360                 365            

 

 

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

    370                 375                 380                

 

 

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

385                 390                 395                 400

 

 

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

                405                 410                 415    

 

 

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val

            420                 425                 430        

 

 

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

        435                 440                 445            

 

 

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

    450                 455                 460                

 

 

Leu Gly Lys

465        

 

 

<210>  44

<211>  234

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "mAb 0051, LC (小鼠VL - 人κ CL); Fab 0051, LC

       (小鼠VL - 人κ CL)"

 

<400>  44

 

Met Lys Ser Gln Thr Gln Val Phe Val Phe Leu Leu Leu Cys Val Ser

1               5                   10                  15     

 

 

Gly Ala His Gly Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu

            20                  25                  30         

 

 

Val Ser Ala Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser

        35                  40                  45             

 

 

Val Ser Asn Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro

    50                  55                  60                 

 

 

Lys Leu Leu Ile Asn Tyr Ala Ser Ser Arg Tyr Thr Gly Ile Pro Asp

65                  70                  75                  80 

 

 

Arg Phe Thr Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser

                85                  90                  95     

 

 

Thr Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr

            100                 105                 110        

 

 

Ser Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Glu Arg

        115                 120                 125             

 

 

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

    130                 135                 140                

 

 

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

145                 150                 155                 160

 

 

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

                165                 170                 175    

 

 

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

            180                 185                 190        

 

 

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

        195                 200                 205            

 

 

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

    210                 215                 220                

 

 

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225                 230                

 

 

<210>  45

<211>  468

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "mAb 0052, HC (小鼠VH-人IgG4 CH1-CH2-CH3)"

 

<400>  45

 

Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly

1               5                   10                  15     

 

 

Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Pro Met Lys

            20                  25                  30         

 

 

Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe

        35                  40                  45             

 

 

Ser Ser His Trp Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu

    50                  55                  60                 

 

 

Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn

65                  70                  75                  80 

 

 

Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn

                85                  90                  95     

 

 

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

            100                 105                 110        

 

 

Tyr Cys Cys Ala Arg Gly Tyr Tyr Gly Leu Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe

        115                 120                 125            

 

 

Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

    130                 135                 140                

 

 

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser

145                 150                 155                 160

 

 

Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

                165                 170                 175    

 

 

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

            180                 185                 190        

 

 

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

        195                 200                 205            

 

 

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys

    210                 215                 220                

 

 

Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu

225                 230                 235                 240

 

 

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu

                245                 250                 255    

 

 

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

            260                 265                 270        

 

 

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

        275                 280                 285            

 

 

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

    290                 295                 300                

 

 

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

305                 310                 315                 320

 

 

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

                325                 330                 335    

 

 

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

            340                 345                 350        

 

 

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

        355                 360                 365            

 

 

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

    370                 375                 380                

 

 

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

385                 390                 395                 400

 

 

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

                405                 410                 415    

 

 

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

            420                 425                 430        

 

 

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

        435                 440                 445            

 

 

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

    450                 455                 460                

 

 

Ser Leu Gly Lys

465            

 

 

<210>  46

<211>  234

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "mAb 0052, LC (小鼠VL - 人κ CL); mAb 0062, LC

       (小鼠VL - 人κ CL); Fab 0052, LC (小鼠VL - 人κ

       CL)"

 

<400>  46

 

Met Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln

1               5                   10                  15     

 

 

Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser

            20                  25                  30         

 

 

Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp

        35                  40                  45             

 

 

Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val

    50                  55                  60                 

 

 

Lys Leu Leu Ile Phe Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser

65                  70                  75                  80 

 

 

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser

                85                  90                  95     

 

 

Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Thr

            100                 105                 110        

 

 

Lys Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys Arg

        115                 120                 125            

 

 

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

    130                 135                 140                

 

 

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

145                 150                 155                 160

 

 

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

                165                 170                 175    

 

 

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

            180                 185                 190        

 

 

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

        195                 200                 205            

 

 

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

    210                 215                 220                

 

 

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225                 230                

 

 

<210>  47

<211>  459

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "mAb 0061, HC (小鼠VH-人IgG4 CH1-CH2-CH3)"

 

<400>  47

 

Met Asp Phe Gly Leu Ile Phe Phe Ile Val Ala Leu Leu Lys Gly Val

1               5                   10                  15     

 

 

Gln Cys Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

            20                  25                  30         

 

 

Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser

        35                  40                  45             

 

 

Arg Tyr Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

    50                  55                  60                 

 

 

Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Asn Pro

65                  70                  75                  80 

 

 

Ser Leu Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr

                85                  90                  95     

 

 

Leu Tyr Leu Gln Met Ser Glu Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr

            100                 105                 110        

 

 

Tyr Cys Ala Ser Gly Val Phe Thr Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

        115                 120                 125            

 

 

Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

    130                 135                 140                

 

 

Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

145                 150                 155                 160

 

 

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

                165                 170                 175    

 

 

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

            180                 185                 190        

 

 

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

        195                 200                 205            

 

 

Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr

    210                 215                 220                

 

 

Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro

225                 230                 235                 240

 

 

Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

                245                 250                 255    

 

 

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

            260                 265                 270        

 

 

Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn

        275                 280                 285            

 

 

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

    290                 295                 300                

 

 

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

305                 310                 315                 320

 

 

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

                325                 330                 335    

 

 

Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

            340                 345                 350        

 

 

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu

        355                 360                 365            

 

 

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

    370                 375                 380                

 

 

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

385                 390                 395                 400

 

 

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

                405                 410                 415    

 

 

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly

            420                 425                 430        

 

 

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

        435                 440                 445            

 

 

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

    450                 455                

 

 

<210>  48

<211>  238

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "mAb 0061, LC (小鼠VL - 人κ CL); Fab 0061, LC

       (小鼠VL - 人κ CL); mAb 0082, LC (小鼠VL - 人κ

       CL); Fab 0082, LC (小鼠VL - 人κ CL)"

 

<400>  48

 

Met Lys Leu Pro Val Gly Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala

1               5                   10                  15     

 

 

Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val

            20                  25                  30         

 

 

Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu

        35                  40                  45             

 

 

Val His Arg Asn Gly Asn Thr Tyr Phe His Trp Ala Leu Gln Lys Pro

    50                  55                  60                 

 

 

Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

65                  70                  75                  80 

 

 

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

                85                  90                  95     

 

 

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys

            100                 105                 110        

 

 

Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

        115                 120                 125             

 

 

Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

    130                 135                 140                

 

 

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu

145                 150                 155                 160

 

 

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn

                165                 170                 175    

 

 

Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser

            180                 185                 190        

 

 

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala

        195                 200                 205            

 

 

Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly

    210                 215                 220                

 

 

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225                 230                 235            

 

 

<210>  49

<211>  468

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "mAb 0062, HC (小鼠VH-人IgG4 CH1-CH2-CH3)"

 

<400>  49

 

Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly

1               5                   10                  15     

 

 

Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Pro Met Lys

            20                  25                  30         

 

 

Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe

        35                  40                  45             

 

 

Ser Ser His Trp Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu

    50                  55                  60                 

 

 

Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn

65                  70                  75                  80 

 

 

Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn

                85                  90                  95     

 

 

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

            100                 105                 110        

 

 

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Tyr Gly Leu Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe

        115                 120                 125            

 

 

Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

    130                 135                 140                

 

 

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser

145                 150                 155                 160

 

 

Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

                165                 170                 175    

 

 

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

            180                 185                 190        

 

 

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

        195                 200                 205            

 

 

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys

    210                 215                 220                

 

 

Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu

225                 230                 235                 240

 

 

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu

                245                 250                 255    

 

 

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

            260                 265                 270        

 

 

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

        275                 280                 285            

 

 

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

    290                 295                 300                

 

 

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

305                 310                 315                 320

 

 

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

                325                 330                 335    

 

 

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

            340                 345                 350        

 

 

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

        355                 360                 365            

 

 

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

    370                 375                 380                

 

 

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

385                 390                 395                 400

 

 

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

                405                 410                 415    

 

 

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

            420                 425                 430        

 

 

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

        435                 440                 445            

 

 

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

    450                 455                 460                

 

 

Ser Leu Gly Lys

465            

 

 

<210>  50

<211>  459

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "mAb 0082, HC (小鼠VH-人IgG4 CH1-CH2-CH3)"

 

<400>  50

 

Met Asp Phe Gly Leu Ile Phe Phe Ile Val Ala Leu Leu Lys Gly Val

1               5                   10                  15     

 

 

Gln Cys Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

            20                  25                  30         

 

 

Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser

        35                  40                  45             

 

 

Arg Tyr Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

    50                  55                  60                 

 

 

Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro

65                  70                  75                  80 

 

 

Ser Leu Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr

                85                  90                  95     

 

 

Leu Tyr Leu Gln Met Ser Glu Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr

            100                 105                 110        

 

 

Tyr Cys Ala Ser Gly Val Phe Thr Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

        115                 120                 125            

 

 

Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

    130                 135                 140                

 

 

Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

145                 150                 155                 160

 

 

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

                165                 170                 175    

 

 

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

            180                 185                 190         

 

 

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

        195                 200                 205            

 

 

Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr

    210                 215                 220                 

 

 

Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro

225                 230                 235                 240

 

 

Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

                245                 250                 255    

 

 

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

            260                 265                 270        

 

 

Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn

        275                 280                 285            

 

 

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

    290                 295                 300                

 

 

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

305                 310                 315                 320

 

 

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

                325                 330                 335    

 

 

Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

            340                 345                 350        

 

 

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu

        355                 360                 365            

 

 

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

    370                 375                 380                

 

 

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

385                 390                 395                 400

 

 

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

                405                 410                 415    

 

 

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly

            420                 425                 430        

 

 

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

        435                 440                 445            

 

 

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

    450                 455                

 

 

<210>  51

<211>  233

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "Fab 0012, 小鼠VH - 人IgG4 CH1"

 

<400>  51

 

Met Asp Phe Gly Leu Ile Phe Phe Ile Val Ala Leu Leu Lys Gly Val

1               5                   10                  15     

 

 

Gln Cys Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

            20                  25                  30         

 

 

Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser

        35                  40                  45             

 

 

Arg Tyr Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

    50                  55                  60                 

 

 

Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro

65                  70                  75                  80 

 

 

Ser Leu Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr

                85                  90                  95     

 

 

Leu Tyr Leu Gln Met Ser Glu Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr

            100                 105                 110        

 

 

Tyr Cys Ala Ser Gly Val Phe Thr Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

        115                 120                 125            

 

 

Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

    130                 135                 140                

 

 

Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

145                 150                 155                 160

 

 

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

                165                 170                 175    

 

 

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

            180                 185                 190        

 

 

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

        195                 200                 205            

 

 

Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr

    210                 215                 220                

 

 

Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys

225                 230            

 

 

<210>  52

<211>  241

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "Fab 0023, 小鼠VH - 人IgG4 CH1"

 

<400>  52

 

Met Asn Leu Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly

1               5                   10                  15     

 

 

Val Gln Cys Glu Val Arg Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

            20                  25                  30         

 

 

Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe

        35                  40                  45             

 

 

Ser Asp Tyr Phe Met Tyr Trp Ile Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu

    50                  55                  60                 

 

 

Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Asn Gly Gly Asp Ser Ser Ser Tyr Pro

65                  70                  75                  80 

 

 

Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

                85                  90                  95     

 

 

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Arg Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met

            100                 105                 110        

 

 

Tyr Tyr Cys Ala Thr Asn Lys Asn Trp Asp Asp Tyr Tyr Asp Met Asp

        115                 120                 125            

 

 

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

    130                 135                 140                

 

 

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu

145                 150                 155                 160

 

 

Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

                165                 170                 175    

 

 

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

            180                 185                 190        

 

 

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

        195                 200                 205            

 

 

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn

    210                 215                 220                

 

 

Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser

225                 230                 235                 240

 

 

Lys

   

 

 

<210>  53

<211>  241

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "Fab 0051, 小鼠VH - 人IgG4 CH1"

 

<400>  53

 

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Phe Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1               5                   10                  15     

 

 

Val His Ser Gln Val Gln Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg

            20                  25                  30         

 

 

Pro Gly Val Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe

        35                  40                  45             

 

 

Thr Asp Tyr Ser Met His Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Ser Leu

    50                  55                  60                 

 

 

Glu Trp Ile Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Val Arg Tyr Asn

65                  70                  75                  80 

 

 

Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser

                85                  90                  95     

 

 

Thr Ala Tyr Met Ala Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile

            100                 105                 110        

 

 

Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Pro Met Ile Thr Thr Gly Ala Trp Phe Ala

        115                 120                 125            

 

 

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys

    130                 135                 140                

 

 

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu

145                 150                 155                 160

 

 

Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

                165                 170                 175    

 

 

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

            180                 185                 190        

 

 

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

        195                 200                 205            

 

 

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn

    210                 215                 220                

 

 

Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser

225                 230                 235                 240

 

 

Lys

   

 

 

<210>  54

<211>  242

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "Fab 0052, 小鼠VH - 人IgG4 CH1"

 

<400>  54

 

Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly

1               5                   10                  15     

 

 

Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Pro Met Lys

            20                  25                  30         

 

 

Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe

        35                  40                  45             

 

 

Ser Ser His Trp Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu

    50                  55                  60                 

 

 

Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn

65                  70                  75                  80 

 

 

Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn

                85                  90                  95     

 

 

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

            100                 105                 110        

 

 

Tyr Cys Cys Ala Arg Gly Tyr Tyr Gly Leu Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe

        115                 120                 125            

 

 

Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

    130                 135                 140                

 

 

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser

145                 150                 155                 160

 

 

Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

                165                 170                 175    

 

 

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

            180                 185                 190        

 

 

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

        195                 200                 205            

 

 

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys

    210                 215                 220                

 

 

Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu

225                 230                 235                 240

 

 

Ser Lys

       

 

 

<210>  55

<211>  233

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "Fab 0082, 小鼠VH - 人IgG4 CH1"

 

<400>  55

 

Met Asp Phe Gly Leu Ile Phe Phe Ile Val Ala Leu Leu Lys Gly Val

1               5                   10                  15     

 

 

Gln Cys Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

            20                  25                  30         

 

 

Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser

        35                  40                  45             

 

 

Arg Tyr Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

    50                  55                  60                 

 

 

Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro

65                  70                  75                  80 

 

 

Ser Leu Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr

                85                  90                  95     

 

 

Leu Tyr Leu Gln Met Ser Glu Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr

            100                 105                 110        

 

 

Tyr Cys Ala Ser Gly Val Phe Thr Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

        115                 120                 125            

 

 

Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

    130                 135                 140                

 

 

Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

145                 150                 155                 160

 

 

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

                165                 170                 175    

 

 

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

            180                 185                 190        

 

 

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

        195                 200                 205            

 

 

Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr

    210                 215                 220                

 

 

Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys

225                 230            

 

 

<210>  56

<211>  240

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "Fab AP-3, 小鼠VH - 人IgG4 CH1"

 

<400>  56

 

Met Glu Trp Ser Gly Val Phe Ile Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Asp

1               5                   10                  15     

 

 

Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg

            20                  25                  30         

 

 

Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

        35                  40                  45             

 

 

Thr Asn Tyr Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu

    50                  55                  60                 

 

 

Glu Trp Ile Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Asn Lys Tyr Asn

65                  70                  75                  80 

 

 

Glu Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser

                85                  90                  95     

 

 

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

            100                 105                 110        

 

 

Tyr Phe Cys Ala Arg Glu Tyr Gly Asn Tyr Asp Tyr Ala Met Asp Ser

        115                 120                 125            

 

 

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

    130                 135                 140                

 

 

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser

145                 150                 155                 160

 

 

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

                165                 170                 175    

 

 

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

            180                 185                 190        

 

 

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

        195                 200                 205            

 

 

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val

    210                 215                 220                

 

 

Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys

225                 230                 235                 240

 

 

<210>  57

<211>  239

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "Fab AP-3, LC (小鼠VL - 人κ CL)"

 

<400>  57

 

Met Arg Cys Leu Ala Glu Phe Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro

1               5                   10                  15     

 

 

Gly Ala Ile Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro

            20                  25                  30         

 

 

Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Ser

        35                  40                  45             

 

 

Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Cys Trp Phe Leu Gln Arg

    50                  55                  60                 

 

 

Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala

65                  70                  75                  80 

 

 

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe

                85                  90                  95     

 

 

Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr

            100                 105                 110        

 

 

Cys Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys

        115                 120                 125            

 

 

Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro

    130                 135                 140                

 

 

Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu

145                 150                 155                 160

 

 

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp

                165                 170                 175    

 

 

Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp

            180                 185                 190        

 

 

Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys

        195                 200                 205            

 

 

Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln

    210                 215                 220                

 

 

Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225                 230                 235                

 

 

<210>  58

<211>  239

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "Fab AP-3.LC.C34S, LC (小鼠VL - 人κ CL)"

 

<400>  58

 

Met Arg Cys Leu Ala Glu Phe Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro

1               5                   10                  15     

 

 

Gly Ala Ile Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro

            20                  25                  30         

 

 

Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Ser

        35                  40                  45             

 

 

Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Phe Leu Gln Arg

    50                  55                  60                 

 

 

Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala

65                  70                  75                  80 

 

 

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe

                85                  90                  95     

 

 

Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr

            100                 105                 110        

 

 

Cys Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys

        115                 120                 125            

 

 

Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro

    130                 135                 140                

 

 

Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu

145                 150                 155                 160

 

 

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp

                165                 170                 175    

 

 

Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp

            180                 185                 190        

 

 

Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys

        195                 200                 205            

 

 

Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln

    210                 215                 220                

 

 

Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225                 230                 235                

 

 

<210>  59

<211>  7

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "连接物, L2"

 

<400>  59

 

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1               5          

 

 

<210>  60

<211>  12

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "连接物, L3"

 

<400>  60

 

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1               5                   10         

 

 

<210>  61

<211>  17

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "连接物, L4a"

 

<400>  61

 

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1               5                   10                  15     

 

 

Ser

   

 

 

<210>  62

<211>  17

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "连接物, L4b"

 

<400>  62

 

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1               5                   10                  15     

 

 

Ser

   

 

 

<210>  63

<211>  22

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "连接物, L5"

 

<400>  63

 

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1               5                   10                  15     

 

 

Ser Gly Gly Gly Gly Ser

            20         

 

 

<210>  64

<211>  27

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "连接物, L6"

 

<400>  64

 

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1               5                   10                  15     

 

 

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

            20                  25         

 

 

<210>  65

<211>  32

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "连接物, L7"

 

<400>  65

 

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1               5                   10                  15      

 

 

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

            20                  25                  30         

 

 

<210>  66

<211>  37

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "连接物, L8"

 

<400>  66

 

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1               5                   10                  15     

 

 

Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

            20                  25                  30         

 

 

Gly Gly Gly Gly Ser

        35         

 

 

<210>  67

<211>  42

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "连接物, L9"

 

<400>  67

 

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1               5                   10                  15     

 

 

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

            20                  25                  30         

 

 

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

        35                  40         

 

 

<210>  68

<211>  16

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "连接物, L10"

 

<400>  68

 

Tyr Gly Pro Pro Ser Pro Ser Ser Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly

1               5                   10                  15     

 

 

<210>  69

<211>  12

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "纯化标签, HPC4标签"

 

<400>  69

 

Glu Asp Gln Val Asp Pro Arg Leu Ile Asp Gly Lys

1               5                   10         

 

 

<210>  70

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号50"

 

<400>  70

caacacttac ttgtcctggt tcctgcag                                          28

 

 

<210>  71

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号51"

 

<400>  71

ctgcaggaac caggacaagt aagtgttg                                          28

 

 

<210>  72

<211>  36

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号69"

 

<400>  72

gctctagact aacactcatt cctgttgaag ctcttg                                 36

 

 

<210>  73

<211>  39

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号98"

 

<400>  73

tttaaagaat tcctaacact ctcccctgtt gaagctctt                              39

 

 

<210>  74

<211>  39

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号100"

 

<400>  74

tttaaagaat tctcatttac ccagagacag ggagaggct                              39

 

 

<210>  75

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号312"

 

<400>  75

gtctaccaca acacacgtga c                                                 21

 

 

<210>  76

<211>  27

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号339"

 

<400>  76

actggatggt gggaagatgg atacagt                                           27

 

 

<210>  77

<211>  27

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号341"

 

<400>  77

agatccaggg gctagcggat agacaga                                           27

 

 

<210>  78

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号348"

 

<400>  78

ggagctggtg gtggcatctc aggacctttg                                        30

 

 

<210>  79

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号347"

 

<400>  79

cctgtaggac cagagggctc caaggacact                                        30

 

 

<210>  80

<211>  48

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号448"

 

<400>  80

tttaaaaagc ttgccgccac catggagacc cctgcctggc cccgggtc                    48

 

 

<210>  81

<211>  48

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号449"

 

<400>  81

tttaaagaat tcctattctc taaattcccc tttctcctgg cccataca                    48

 

 

<210>  82

<211>  75

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号466"

 

<400>  82

ggaggtggcg ggtctggtgg cgggggatca ggcgggggag gttcctcagg cactacaaat       60

 

actgtggcag catat                                                        75

 

 

<210>  83

<211>  75

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号467"

 

<400>  83

ggaacctccc ccgcctgatc ccccgccacc agacccgcca cctccttctc taaattcccc       60

 

tttctcctgg cccat                                                        75

 

 

<210>  84

<211>  65

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号483"

 

<400>  84

aaatttaagc ttactagtcc tgcaggttta aacgaatttg gatccggagg tggcgggtct       60

 

ggtgg                                                                   65

 

 

<210>  85

<211>  48

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号484"

 

<400>  85

gaatttagcg gccgcgaatt cggatccgga acctcccccg cctgatcc                    48

 

 

<210>  86

<211>  81

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号485"

 

<400>  86

aaatttgaat tcttacttgc cgtcgatcag tctggggtcc acctggtcct cacactctcc       60

 

cctgttgaag ctctttgtga c                                                 81

 

 

<210>  87

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号486"

 

<400>  87

acggatctct agcaagcttc gtacggtggc                                        30

 

 

<210>  88

<211>  81

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号487"

 

<400>  88

aaatttgaat tcttacttgc cgtcgatcag tctggggtcc acctggtcct ctttggactc       60

 

aactctcttg tccaccttgg t                                                 81

 

 

<210>  89

<211>  45

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号488"

 

<400>  89

aaatttgaat tcttatttgg actcaactct cttgtccacc ttggt                       45

 

 

<210>  90

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号489"

 

<400>  90

acggatctct agcaagcttg ctagcaccaa                                        30

 

 

<210>  91

<211>  54

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号490"

 

<400>  91

aaatttaagc ttgccgccac catggatttt gggctgattt tttttattgt tgct             54

 

 

<210>  92

<211>  45

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号491"

 

<400>  92

aaatttgcta gctgcagaga cagtgaccag agtcccttgg cccca                       45

 

 

<210>  93

<211>  51

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号492"

 

<400>  93

aaatttaagc ttgccgccac catgaagtca cagacccagg tcttcgtatt t                51

 

 

<210>  94

<211>  51

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号493"

 

<400>  94

aaatttaagc ttgccgccac catgaagttg cctgttgggc tgttggtgct g                51

 

 

<210>  95

<211>  38

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号494"

 

<400>  95

aaatttcgta cgttctattt ccagcttggt cccccctc                               38

 

 

<210>  96

<211>  42

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号495"

 

<400>  96

aaatttcgta cgttttattt ccagcttggt cccccctccg aa                          42

 

 

<210>  97

<211>  69

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号512"

 

<400>  97

aaatttggat ccgaggtgaa acttctcgag tctggaggtg gcctggtgca gcctggaggt       60

 

tccctgaaa                                                               69

 

 

<210>  98

<211>  36

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号513"

 

<400>  98

tttaaaggat tctttaccca gagacaggga gaggct                                 36

 

 

<210>  99

<211>  42

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号514"

 

<400>  99

aaatttggat cctttggact caactctctt gtccaccttg gt                          42

 

 

<210>  100

<211>  54

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号546"

 

<400>  100

aaatttaagc ttgccgccac catgaacttg gggctcagct tgattttcct tgtc             54

 

 

<210>  101

<211>  42

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号547"

 

<400>  101

aaatttgcta gctgaggaga cggtgactga ggttccttga cc                          42

 

 

<210>  102

<211>  54

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号548"

 

<400>  102

aaatttaagc ttgccgccac catggattca caggcccagg ttcttatatt gctg             54

 

 

<210>  103

<211>  42

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号549"

 

<400>  103

aaatttcgta cgtttcagct ccagcttggt cccagcaccg aa                          42

 

 

<210>  104

<211>  48

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号551"

 

<400>  104

aaatttaaat ttggatccga tgttgtgatg acccaaactc cactctcc                    48

 

 

<210>  105

<211>  42

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号552"

 

<400>  105

aaatttaaat ttggatccac actctcccct gttgaagctc tt                          42

 

 

<210>  106

<211>  54

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号572"

 

<400>  106

aaatttaagc ttgccgccac catggatttt gggctgattt tttttattgt tgct             54

 

 

<210>  107

<211>  49

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号574"

 

<400>  107

aaatttaagc ttgccgccac catgaagttg cctgttgggc tgttggtgc                   49

 

 

<210>  108

<211>  84

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号583"

 

<400>  108

aaatttggat ccggaacctc ccccgcctga tcccccgcca ccagacccgc cacctccaca       60

 

ctctcccctg ttgaagctct ttgt                                              84

 

 

<210>  109

<211>  99

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号584"

 

<400>  109

aaatttggat ccagacccgc cacctccgga acctcccccg cctgatcccc cgccaccaga       60

 

cccgccacct ccacactctc ccctgttgaa gctctttgt                              99

 

 

<210>  110

<211>  69

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号585"

 

<400>  110

aaatttggat cctgatcccc cgccaccaga cccgccacct ccacactctc ccctgttgaa       60

 

gctctttgt                                                               69

 

 

<210>  111

<211>  69

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号586"

 

<400>  111

aaatttggat ccggtggcgg gggatcaggc gggggaggtt cctcaggcac tacaaatact       60

 

gtggcagca                                                               69

 

 

<210>  112

<211>  87

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号587"

 

<400>  112

aaatttggat ccggaacctc ccccgcctga tcccccgcca ccagacccgc cacctccttt       60

 

acccagagac agggagaggc tcttctg                                           87

 

 

<210>  113

<211>  102

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号588"

 

<400>  113

aaatttggat ccagacccgc cacctccgga acctcccccg cctgatcccc cgccaccaga       60

 

cccgccacct cctttaccca gagacaggga gaggctcttc tg                         102

 

 

<210>  114

<211>  72

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号589"

 

<400>  114

aaatttggat cctgatcccc cgccaccaga cccgccacct cctttaccca gagacaggga       60

 

gaggctcttc tg                                                           72

 

 

<210>  115

<211>  54

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号590"

 

<400>  115

aaatttggat ccagacccgc cacctccaca ctctcccctg ttgaagctct ttgt             54

 

 

<210>  116

<211>  114

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号591"

 

<400>  116

aaatttggat ccagacccgc cacctccaga cccgccacct ccggaacctc ccccgcctga       60

 

tcccccgcca ccagacccgc cacctccaca ctctcccctg ttgaagctct ttgt            114

 

 

<210>  117

<211>  57

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号592"

 

<400>  117

aaatttggat cctgatcccc cgccaccttt acccagagac agggagaggc tcttctg          57

 

 

<210>  118

<211>  117

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号593"

 

<400>  118

aaatttggat ccagacccgc cacctccaga cccgccacct ccggaacctc ccccgcctga       60

 

tcccccgcca ccagacccgc cacctccttt acccagagac agggagaggc tcttctg         117

 

 

<210>  119

<211>  45

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号598"

 

<400>  119

ggaaacacct attttcattg ggccctgcag aaaccaggcc agtct                       45

 

 

<210>  120

<211>  45

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号599"

 

<400>  120

agactggcct ggtttctgca gggcccaatg aaaataggtg tttcc                       45

 

 

<210>  121

<211>  36

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号610"

 

<400>  121

gctctagact aacactcatt cctgttgaag ctcttg                                 36

 

 

<210>  122

<211>  38

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号613"

 

<400>  122

aaaaatctag aatagacaga tgggggtgtc gttttggc                               38

 

 

<210>  123

<211>  34

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号614"

 

<400>  123

aaaaatctag acttgaccag gcatcctaga gtca                                   34

 

 

<210>  124

<211>  35

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号615"

 

<400>  124

aaaaatctag aaggggccag tggatagact gatgg                                  35

 

 

<210>  125

<211>  35

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号616"

 

<400>  125

aaaaatctag aagggaccaa gggatagaca gatgg                                  35

 

 

<210>  126

<211>  50

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号617"

 

<400>  126

aaatttaagc ttgccgccac catggaatgg acctgggtct ttctcttcct                  50

 

 

<210>  127

<211>  39

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号618"

 

<400>  127

aaatttgcta gctgaggaga cggtgaccgt ggtccctgc                              39

 

 

<210>  128

<211>  48

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号619"

 

<400>  128

aaatttaagc ttgccgccac catgatgtcc tctgctcagt tccttggt                    48

 

 

<210>  129

<211>  39

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号620"

 

<400>  129

aaatttcgta cgtttcatct ccagtttggt cccccctcc                              39

 

 

<210>  130

<211>  50

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号627"

 

<400>  130

aaatttaagc ttgccgccac catgggttgg agctgtatca tcttctttct                  50

 

 

<210>  131

<211>  39

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号628"

 

<400>  131

aaatttgcta gctgcagaga cagtgaccag agtcccttg                              39

 

 

<210>  132

<211>  45

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号682"

 

<400>  132

gatagcagta cgataaacta taacccatct ctaaaggata aattc                       45

 

 

<210>  133

<211>  45

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号683"

 

<400>  133

gaatttatcc tttagagatg ggttatagtt tatcgtactg ctatc                       45

 

 

<210>  134

<211>  45

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号684"

 

<400>  134

tctgaggact ctgccgtcta ttactgtgca agagggtact acggt                       45

 

 

<210>  135

<211>  45

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号685"

 

<400>  135

accgtagtac cctcttgcac agtaatagac ggcagagtcc tcaga                       45

 

 

<210>  136

<211>  81

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号686"

 

<400>  136

tgctgccaca gtatttgtag tgcctgatcc ccccaggaac tcaggtgctg gggatgatgg       60

 

ggatggggga ccatatttgg a                                                 81

 

 

<210>  137

<211>  51

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号687"

 

<400>  137

ccagcacctg agttcctggg gggatcaggc actacaaata ctgtggcagc a                51

 

 

<210>  138

<211>  45

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号688"

 

<400>  138

gatagcagta cgataaacta tgcgccatct ctaaaggata aattc                       45

 

 

<210>  139

<211>  45

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号689"

 

<400>  139

gaatttatcc tttagagatg gcgcatagtt tatcgtactg ctatc                       45

 

 

<210>  140

<211>  54

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号699"

 

<400>  140

aaatttggat ccggcggggg aggttcctca ggcactacaa atactgtggc agca             54

 

 

<210>  141

<211>  39

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号700"

 

<400>  141

aaatttggat cctcaggcac tacaaatact gtggcagca                              39

 

 

<210>  142

<211>  57

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号701"

 

<400>  142

accaaggtgg acaagagagt tgagtccaaa tcaggcacta caaatactgt ggcagca          57

 

 

<210>  143

<211>  60

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号702"

 

<400>  143

tgctgccaca gtatttgtag tgcctgattt ggactcaact ctcttgtcca ccttggtgtt       60

 

 

<210>  144

<211>  57

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号703"

 

<400>  144

gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt tcaggcacta caaatactgt ggcagca          57

 

 

<210>  145

<211>  57

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号704"

 

<400>  145

tgctgccaca gtatttgtag tgcctgaaca ctctcccctg ttgaagctct ttgtgac          57

 

 

<210>  146

<211>  60

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号800"

 

<400>  146

cagaagagcc tctccctgtc tctgggtaaa tcaggcacta caaatactgt ggcagcatat       60

 

 

<210>  147

<211>  60

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号801"

 

<400>  147

atatgctgcc acagtatttg tagtgcctga tttacccaga gacagggaga ggctcttctg       60

 

 

<210>  148

<211>  49

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号842"

 

<400>  148

aaatttaagc ttgccgccac catgaggtgc ctagctgagt tcctggggc                   49

 

 

<210>  149

<211>  45

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号843"

 

<400>  149

aaatttcgta cgttttattt ccaactttgt ccccgagccg aacgt                       45

 

 

<210>  150

<211>  49

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号844"

 

<400>  150

aaatttaagc ttgccgccac catggaatgg agcggggtct ttatctttc                   49

 

 

<210>  151

<211>  39

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号845"

 

<400>  151

aaatttgcta gctgaggaga cggtgactga ggttccttg                              39

 

 

<210>  152

<211>  55

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "primer 1000"

 

<400>  152

ctgtctctgg gtaaacacca tcaccaccac cactgagaat tccccgacct cgacc            55

 

 

<210>  153

<211>  55

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号1001"

 

<400>  153

gaggtcgggg aattctcagt ggtggtggtg atggtgttta cccagagaca gggag            55

 

 

<210>  154

<211>  48

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号1002"

 

<400>  154

ctcttttaaa aggggtccag tgtgagtcca aatatggtcc cccatgcc                    48

 

 

<210>  155

<211>  50

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号1003"

 

<400>  155

catgggggac catatttgga ctcacactgg acccctttta aaagagcaac                  50

 

 

<210>  156

<211>  233

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "0061VH-CH1"

 

<400>  156

 

Met Asp Phe Gly Leu Ile Phe Phe Ile Val Ala Leu Leu Lys Gly Val

1               5                   10                  15     

 

 

Gln Cys Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

            20                  25                  30         

 

 

Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser

        35                  40                  45             

 

 

Arg Tyr Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

    50                  55                  60                 

 

 

Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Asn Pro

65                  70                  75                  80  

 

 

Ser Leu Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr

                85                  90                  95     

 

 

Leu Tyr Leu Gln Met Ser Glu Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr

            100                 105                 110        

 

 

Tyr Cys Ala Ser Gly Val Phe Thr Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

        115                 120                 125            

 

 

Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

    130                 135                 140                

 

 

Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

145                 150                 155                 160

 

 

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

                165                 170                 175    

 

 

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

            180                 185                 190        

 

 

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

        195                 200                 205            

 

 

Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr

    210                 215                 220                

 

 

Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys

225                 230            

 

 

<210>  157

<211>  247

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "hIgG4-铰链-CH2-CH3"

 

<400>  157

 

Met Asp Phe Gly Leu Ile Phe Phe Ile Val Ala Leu Leu Lys Gly Val

1               5                   10                  15     

 

 

Gln Cys Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

            20                  25                  30         

 

 

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

        35                  40                  45             

 

 

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

    50                  55                  60                 

 

 

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

65                  70                  75                  80 

 

 

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

                85                  90                  95     

 

 

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

            100                 105                 110        

 

 

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

        115                 120                 125            

 

 

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

    130                 135                 140                

 

 

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

145                 150                 155                 160

 

 

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

                165                 170                 175    

 

 

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

            180                 185                 190        

 

 

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

        195                 200                 205             

 

 

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

    210                 215                 220                

 

 

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

225                 230                 235                 240

 

 

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

                245        

 

 

<210>  158

<211>  6

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "His6标签"

 

<400>  158

 

His His His His His His

1               5      

 

 

<210>  159

<211>  172

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "hTLT-1.18-188"

 

<400>  159

 

Met Ile Val Gly Ser Leu Pro Glu Val Leu Gln Ala Pro Val Gly Ser

1               5                   10                  15     

 

 

Ser Ile Leu Val Gln Cys His Tyr Arg Leu Gln Asp Val Lys Ala Gln

            20                  25                  30         

 

 

Lys Val Trp Cys Arg Phe Leu Pro Glu Gly Cys Gln Pro Leu Val Ser

        35                  40                  45             

 

 

Ser Ala Val Asp Arg Arg Ala Pro Ala Gly Arg Arg Thr Phe Leu Thr

    50                  55                  60                 

 

 

Asp Leu Gly Gly Gly Leu Leu Gln Val Glu Met Val Thr Leu Gln Glu

65                  70                  75                  80 

 

 

Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Gly Cys Met Val Asp Gly Ala Arg Gly Pro

                85                  90                  95     

 

 

Gln Ile Leu His Arg Val Ser Leu Asn Ile Leu Pro Pro Glu Glu Glu

            100                 105                 110        

 

 

Glu Glu Thr His Lys Ile Gly Ser Leu Ala Glu Asn Ala Phe Ser Asp

        115                 120                 125            

 

 

Pro Ala Gly Ser Ala Asn Pro Leu Glu Pro Ser Gln Asp Glu Lys Ser

    130                 135                 140                

 

 

Ile Pro Leu Ile Trp Gly Ala Val Leu Leu Val Gly Leu Leu Val Ala

145                 150                 155                 160

 

 

Ala Val Val Leu Phe Ala Val Met Ala Lys Arg Lys

                165                 170        

 

 

<210>  160

<211>  32

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号1004"

 

<400>  160

ggaattccat atgatagttg gcagcctccc tg                                     32

 

 

<210>  161

<211>  39

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "引物编号1005"

 

<400>  161

ataagaatgc ggccgcctat ttcctcttgg ccatcacag                              39

 

 

<210>  162

<211>  215

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "Fab 0100 HC"

 

<400>  162

 

Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15     

 

 

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr

            20                  25                  30         

 

 

Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

        35                  40                  45             

 

 

Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Asn Pro Ser Leu

    50                  55                  60                 

 

 

Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80 

 

 

Leu Gln Met Ser Glu Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95     

 

 

Ala Ser Gly Val Phe Thr Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

            100                 105                 110        

 

 

Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys

        115                 120                 125            

 

 

Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys

    130                 135                 140                

 

 

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu

145                 150                 155                 160

 

 

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu

                165                 170                 175    

 

 

Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr

            180                 185                 190        

 

 

Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val

        195                 200                 205            

 

 

Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys

    210                 215

 

 

<210>  163

<211>  219

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  /注 = "Fab 0100 LC"

 

<400>  163

 

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1               5                   10                  15     

 

 

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg

            20                  25                  30         

 

 

Asn Gly Asn Thr Tyr Phe His Trp Ala Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

        35                  40                  45             

 

 

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

    50                  55                  60                 

 

 

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65                  70                  75                  80 

 

 

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser

                85                  90                  95     

 

 

Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

            100                 105                 110        

 

 

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

        115                 120                 125            

 

 

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

    130                 135                 140                

 

 

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145                 150                 155                 160

 

 

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

                165                 170                 175    

 

 

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

            180                 185                 190        

 

 

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

        195                 200                 205            

 

 

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

    210                 215