一种酵母培养物在促进纤维素分解菌增殖中的应用

摘要

本发明公开了一种酵母培养物在促进纤维素分解菌增殖中的应用。所述酵母培养物是按照包括如下步骤的方法制备得到的：将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No.2.1882)进行液体发酵后，收集发酵液，除去所述发酵液中的所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No.2.1882)细胞得到的无菌液体即为所述酵母培养物。实验证明，使用上述工艺制备得到的酵母培养物分别培养纤维素分解菌产琥珀酸拟杆菌、牛黄瘤胃球菌和白色瘤胃球菌可使其生物量分别提高75.6％-80.9％、69.89％-82.75％和64.78％-76.76％。本发明为提高反刍动物生产力水平、优化饲料组成提供了一个重要途径。

说明书

技术领域

本发明涉及一种酵母培养物在促进纤维素分解菌增殖中的应用。

背景技术

目前，我国北方地区仍以玉米秸秆等粗饲料作为反刍动物的部分能量来源。由于 这类饲料质地粗硬、适口性差，导致反刍动物采食量降低，从而影响营养物质的吸收， 造成生产效率低下，因此很多研究人员对如何提高这类粗饲料的消化率进行了大量的 研究。研究反刍动物对粗饲料的利用，实际上就是研究瘤胃内微生物如何利用粗纤维 的过程。瘤胃内主要的纤维分解菌包括产琥珀酸丝状杆菌、牛黄瘤胃球菌及白色瘤胃 球菌，另外还有一部分次级纤维分解菌，它对纤维降解也起到一定的作用。目前存在 许多方法用以调控瘤胃微生物菌群结构，如应用离子载体和抗生素。但对于饲料工业 中应用抗生素所引起的问题和寻求安全饲料的广泛关注，促使研究者致力于发展一种 新型非抗生素或“天然”的饲料添加剂。微生物饲料添加剂，即直接饲喂微生物(DFM)， 完全满足发展需求，因此被推到了历史前台。DFM包括细菌、酵母等，许多研究证明 DFM使用效果良好，尤其是酵母培养物。

酵母培养物(Yeast culture，YC)是指由酵母菌在特定工艺条件下经充分发酵 后所形成的微生态制品，主要包括酵母细胞代谢产物、经发酵后变异的培养基以及少 量已无活性的酵母细胞。酵母培养物的复杂成分主要包括酵母细胞内的营养物质和酵 母细胞的发酵代谢产物。作为集营养、保健于一体的新型饲料添加剂，酵母培养物通 过调控瘤胃微生物区系有效提高反刍动物对饲料的利用率，这也是近年来反刍动物学 和营养学研究的热点。

酵母培养物的质量受菌种、发酵生产工艺以及检测手段等因素的影响。酵母菌在 不同的培养环境下，如：不同的温度、湿度或酸碱环境尤其是底物成分，会产生不同 的发酵产物，而这其中又包含大量的未知生长因子。生产酵母培养物时所使用的培养 基和发酵工艺控制参数对其终端产品中代谢产物的组成、浓度及其生物利用率的稳定 性有着至关重要的影响。即便在使用相同酵母菌种的情况下，不同培养基组成或不同 的发酵生产控制工艺会导致酵母培养物产品中代谢产物组成和浓度出现明显的差异。

发明内容

本发明的目的是提供一种酵母培养物在制备促纤维素分解菌增殖制剂中的用途。

所述酵母培养物是按照包括如下步骤的方法制备得到的：将酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae CGMCC No.2.1882)进行液体发酵后，收集发酵液，除去 所述发酵液中的所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No.2.1882)细胞得 到的无菌液体即为所述酵母培养物。

所述液体发酵在如下条件下进行：20-40℃、100-200转/分钟振荡培养10-30 小时后再静置培养10-60小时；该振荡培养是在有氧条件下进行的，该静置培养是在 厌氧条件下进行的。

所述液体发酵所使用的发酵培养基的溶剂为水，溶质由如下1)-3)的物质组成：

1)碳源，所述碳源为如下A)-C)中的任一种：

A)葡萄糖、蔗糖和糖蜜；

B)葡萄糖、蔗糖和糖蜜中的任两种；

C)葡萄糖、蔗糖和糖蜜中的任一种；

2)氮源，所述氮源为如下D)-F)中的任一种：

D)酵母膏、蛋白胨和硫酸铵；

E)酵母膏、蛋白胨和硫酸铵中的任两种；

F)酵母膏、蛋白胨和硫酸铵中的任一种；

3)无机盐，所述无机盐为KH₂PO₄、MgSO₄、MnSO₄、CaCl₂、GuSO₄、ZnSO₄和FeSO₄；

所述碳源在所述发酵培养基中的总浓度为30-300g/L；所述碳源具体可由10g/L -100g/L葡萄糖、10g/L-100g/L蔗糖和10g/L-100g/L糖蜜组成；

所述氮源在所述发酵培养基中的总浓度为25-640g/L；所述氮源具体可由10g/L -300g/L酵母膏、10g/L-300g/L蛋白胨和5g/L-40g/L硫酸铵组成；

所述无机盐中的各组分在所述发酵培养基中的浓度分别为：KH₂PO₄ 0.1g/L- 10.0g/L、MgSO₄ 0.0488g/L-4.88g/L、MnSO₄ 0.089g/L-3.56g/L、FeSO₄ 0.068g/L- 2.714g/L、CaCl₂ 0.1g/L-4.0g/L、CuSO₄ 0.0639g/L-2.556g/L、ZnSO₄ 0.0561g/L- 2.244g/L；

所述发酵培养基的pH值为4.0-6.5。

所述液体发酵按照包括如下步骤的方法进行：将所述酿酒酵母(Saccharomyces  cerevisiae CGMCC No.2.1882)接种于种子培养基中，20-40℃、100-200转/分钟 振荡培养18-40小时，获得种子液；再将所述种子液按照(1-30)∶100的体积比接种 于所述发酵培养基中进行所述液体发酵；所述种子液中所述酿酒酵母(Saccharomyces  cerevisiae CGMCC No.2.1882)的浓度为10⁶-10⁸cfu/L。

所述种子培养基的溶剂为水，溶质为葡萄糖、酵母粉、蛋白胨和MnSO₄，在所述 种子培养基中各溶质的浓度分别为：葡萄糖10g/L-40g/L、酵母粉5.0g/L-40g/L、 蛋白胨5.0g/L-40g/L、MnSO₄ 0.089g/L-3.56g/L。

本发明还提供一种纤维素分解菌增殖的培养方法，该方法包括将所述纤维素分解 菌接种于含有所述酵母培养物的培养基中进行培养的步骤。

在上述应用或方法中，所述纤维素分解菌为产琥珀酸拟杆菌(Fibrobacter  succinogenes subsp.succinogenes(Hungate))和/或牛黄瘤胃球菌(Ruminococcus  flavefaciens Sijpesteijn)和/或白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus Hungate)。

在上述应用或方法中，所述产琥珀酸拟杆菌(Fibrobacter succinogenes subsp. succinogenes(Hungate))为产琥珀酸拟杆菌(Fibrobacter succinogenes subsp. succinogenes(Hungate)ATCC NO.19169)；

所述牛黄瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens Sijpesteijn)为牛黄瘤胃球菌 (Ruminococcus flavefaciens Sijpesteijn ATCC NO.19208)；

所述白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus Hungate)为白色瘤胃球菌(Ruminococcus  albus Hungate ATCC NO.27210)。

实验证明，使用上述工艺制备得到的酵母培养物分别培养纤维素分解菌产琥珀酸 拟杆菌(Fibrobacter succinogenes subsp.succinogenes(Hungate)ATCC NO.19169)、 牛黄瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens Sijpesteijn ATCC NO.19208)和白色瘤胃 球菌(Ruminococcus albus Hungate ATCC NO.27210)可使其生物量分别提高75.6％ -80.9％、69.89％-82.75％和64.78％-76.76％。本发明为提高反刍动物生产力水平、 优化饲料组成提供了一个重要途径。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例所用的培养基、菌株的详细信息如下：

CDC培养基：青岛海博生物技术有限公司。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)：CGMCC编号为2.1882。

产琥珀酸拟杆菌(Fibrobacter succinogenes subsp.succinogenes(Hungate)： ATCC编号为19169。

牛黄瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens Sijpesteijn)：ATCC编号为19208。

白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus Hungate)：ATCC编号为27210。

实施例1、酵母培养物及其制备方法与应用

一、酵母培养物的制备

1、培养基的配制

液体种子培养基：称取10g葡萄糖、5g酵母粉、5g蛋白胨和0.1g MnSO₄·H₂O， 用1L蒸馏水加热溶解后，121℃、0.1Mpa高温灭菌15min，备用。

液体发酵培养基：称取10g葡萄糖，10g蔗糖，10g糖蜜，10g蛋白胨，10g酵母 膏，5g硫酸铵，0.1g KH₂PO₄，0.1g MgSO₄·7H₂O，0.1g MnSO₄·H₂O，0.1g CaCl₂，0.1g CuSO₄·5H₂O，0.1g ZnSO₄·7H₂O和0.1g FeSO₄·4H₂O，蒸馏水溶解后，用0.1mol/L HCl 溶液调节pH值至4.0，定容至1L，121℃、0.1Mpa高温灭菌15min，备用。

2、种子液的获得

将冻干保藏的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No.2.1882)活化三代 后接入上述液体种子培养基中，20℃、100转/分钟振摇培养18h，获得种子液，经检 测，该种子液经15倍稀释后的OD₆₀₀值为0.491，酿酒酵母的活细胞数为1.1×10⁹cfu/L。

3、发酵液的获得

将步骤2获得的种子液按1∶100的体积比接种于液体发酵培养基中，20℃、100 转/分钟条件下发酵培养10h后转入20℃恒温箱中静置培养10h，获得发酵液。

4、酵母培养物的获得

将步骤3获得的发酵液于4000转/分钟条件下离心5min除去菌体，将获得的上清 液用细菌过滤器(0.22μm)过滤，经平板检验无菌长出，得到的无细胞滤液即为无菌 酵母培养物。

二、利用酵母培养物对纤维素分解菌进行增殖培养

将冻干保藏的三种纤维素分解菌产琥珀酸拟杆菌、牛黄瘤胃球菌和白色瘤胃球菌 分别进行如下步骤1-4的实验：

1、活化后分别接入CDC培养基，30℃严格厌氧培养30h，获得菌悬液；

2、制备如下培养基：羧甲基纤维素钠25ml、硫酸铵10g、NaCl 10g、KH₂PO₄5.0g、 MgSO₄·7H₂O 5.0g/L、MnSO₄·H₂O 2.0g/L、CaCl₂ 2.0g/L、CuSO₄·5H₂O 2.0g/L、ZnSO₄·7H₂O 2.0g/L和FeSO₄·4H₂O 2.0g/L，蒸馏水溶解后，用0.1mol/L HCl调节pH值至5.0，， 定容至1L，121℃、0.1Mpa高温灭菌15min，备用。

3、设置如下两组处理，每种处理3次重复：

处理1(实验组)：取5.0ml步骤2制备的培养基、0.5ml步骤一制备的酵母培养 物和0.5ml的纤维素分解菌菌悬液(约1×10⁷cfu/ml)在10ml无菌离心管中混合后 密封，37℃恒温培养24h，得到纤维素分解菌培养液。

处理2(对照组)：取5.0ml步骤2制备的培养基、0.5ml无菌水和0.5ml的纤维 素分解菌菌悬液(约1×10⁷cfu/ml)在10ml无菌离心管中混合后密封，37℃恒温培养 24h，得到纤维素分解菌培养液。

4、培养液中纤维素分解菌的生物量测定

以纤维分解菌培养基(即步骤2制备的培养基)为调零空白对照，将步骤3培养的 纤维素分解菌培养液直接用TU-1901紫外可见分光光度计测定其在600nm波长条件下 的吸光值即OD₆₀₀值，结果如表1所示。

表1.培养液中纤维素分解菌生物量的测定结果

  实验组的OD₆₀₀结果   对照组的OD₆₀₀结果   产琥珀酸拟杆菌   0.975±0.02   0.539±0.01   牛黄瘤胃球菌   0.943±0.03   0.516±0.02   白色瘤胃球菌   0.903±0.03   0.548±0.02

与对照组相比，实验组获得的培养液中产琥珀酸拟杆菌生物量提高80.9％，牛黄 瘤胃球菌生物量提高82.75％，白色瘤胃球菌生物量提高64.78％。

实施例2、酵母培养物及其制备方法与应用

一、酵母培养物的制备

1、培养基的配制

液体种子培养基：称取40g葡萄糖、40g酵母粉、40g蛋白胨和4.0g MnSO₄·H₂O， 用1L蒸馏水加热溶解后，121℃、0.1Mpa高温灭菌15min，备用。

液体发酵培养基：100g葡萄糖，100g蔗糖，100g糖蜜，300g蛋白胨，300g酵母 膏，40g硫酸铵，10g KH₂PO₄，10g MgSO₄·7H₂O，4.0g MnSO₄·H₂O，4.0g CaCl₂，4.0g CuSO₄·5H₂O，4.0g ZnSO₄·7H₂O和4.0g FeSO₄·4H₂O，蒸馏水溶解后，用0.1mol/L NaOH 溶液调节pH值至6.5，定容至1L，121℃、0.1Mpa高温灭菌15min，备用。

2、种子液的获得

将冻干保藏的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No.2.1882)活化三代 后接入上述液体种子培养基中，40℃、200转/分钟振摇培养40h，获得种子液，经检 测，该种子液经10倍稀释后的OD₆₀₀值为0.591，酿酒酵母的活细胞数为8.9×10⁸cfu/L

3、发酵液的获得

将步骤2获得的种子液按体积分数30％接种于液体发酵培养基中，40℃、200转/ 分钟条件下发酵培养30h后转入40℃恒温箱中静置培养60h，获得发酵液。

4、酵母培养物的获得

将步骤3获得的发酵液于4000转/分钟条件下离心5min除去菌体，将获得的上清 液用细菌过滤器(0.22μm)过滤，经平板检验无菌长出，得到的无细胞滤液即为无菌 酵母培养物。

二、利用酵母培养物对纤维素分解菌进行增殖培养

方法同实施例1中的步骤二，结果如表2所示。

表2.培养液中纤维素分解菌生物量的测定结果

  实验组的OD₆₀₀结果   对照组的OD₆₀₀结果   产琥珀酸拟杆菌   0.962±0.02   0.548±0.04   牛黄瘤胃球菌   0.890±0.02   0.524±0.03

  白色瘤胃球菌   0.867±0.03   0.498±0.03

与对照组相比，实验组获得的培养液中产琥珀酸拟杆菌生物量提高75.6％，牛黄 瘤胃球菌生物量提高69.85％，白色瘤胃球菌生物量提高74.10％。

实施例3、酵母培养物及其制备方法与应用

一、酵母培养物的制备

1、培养基的配制

液体种子培养基：20g葡萄糖、20g酵母粉、20g蛋白胨和2.0g MnSO₄·H₂O。

液体发酵培养基：50g葡萄糖，50g蔗糖，50g糖蜜，50g蛋白胨，50g酵母膏， 20g硫酸铵，5.0g KH₂PO₄，5.0g MgSO₄·7H₂O，2.0g MnSO₄·H₂O，2.0g CaCl₂，2.0g CuSO₄·5H₂O，2.0g ZnSO₄·7H₂O和2.0g FeSO₄·4H₂O，蒸馏水溶解后，用0.1mol/L NaOH 溶液调节pH值至5.5，定容至1L，121℃、0.1Mpa高温灭菌15min，备用。

2、种子液的获得

将冻干保藏的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No.2.1882)活化三代 后接入上述液体种子培养基中，30℃、150转/分钟振摇培养20h，获得种子液，经检 测，该种子液经13倍稀释后的OD₆₀₀值为0.572，酿酒酵母的活细胞数为1.1×10⁹cfu/L

3、发酵液的获得

将步骤2获得的种子液按体积分数15％接种于液体发酵培养基中，30℃、150转/ 分钟条件下发酵培养24h后转入30℃恒温箱中静置培养40h，获得发酵液。

4、酵母培养物的获得

将步骤3获得的发酵液于4000转/分钟条件下离心5min除去菌体，将获得的上清 液用细菌过滤器(0.22μm)过滤，经平板检验无菌长出，得到的无细胞滤液即为无菌 酵母培养物。

二、利用酵母培养物对纤维素分解菌进行增殖培养

方法同实施例1中的步骤二，结果如表3所示。

表3.培养液中纤维素分解菌生物量的测定结果

  实验组的OD₆₀₀结果   对照组的OD₆₀₀结果   产琥珀酸拟杆菌   0.989±0.03   0.551±0.02   牛黄瘤胃球菌   0.913±0.02   0.532±0.02   白色瘤胃球菌   0.905±0.02   0.512±0.03

与对照组相比，产琥珀酸拟杆菌提高79.49％，牛黄瘤胃球菌提高71.62％，白色 瘤胃球菌提高76.76％。