一种酿酒葡萄品种组培快繁方法

摘要

一种酿酒葡萄品种组培快繁方法，按下述步骤完成：（A）培养基选用及制作方法:选用GS作为基本培养基，添加糖源为蔗糖、凝固剂为琼脂，抗生素为注射用青霉素钠，pH值为5.5-6.0；（B）材料选择及接种方法：选用无菌培养的葡萄成株无菌苗，在无菌条件下，剪取无菌苗茎段，接种在上述（A）制作的培养基上；（C）培养环境：光照强度控制在4000-6000LX，温度控制在23-25℃。本发明的特点为：获得的酿酒葡萄组培苗在酿酒葡萄快繁及种植推广应用广泛：1)快速繁殖：能缩短酿酒葡萄繁殖周期；2)生根能力强：获得的无菌苗根系发达，有利于移栽。

说明书

技术领域

本发明涉及一种酿酒葡萄品种组培快繁方法，尤其涉及黑比诺、赤霞珠、贝达、山葡萄、LDP、L33、SO4 7个酿酒葡萄品种组培快繁方法。

背景技术

葡萄的快速繁殖技术开始于20世纪40年代,主要包括扦插繁殖、嫁接繁殖、种子繁殖、组织培养等。其中，组织培养在酿酒葡萄快速繁殖中的应用较为广泛，其优点不仅可以加快繁殖速度，而且还可以热处理结合茎尖培养，有效地消除病毒，获得无毒苗木。在我国常见的酿酒葡萄品种有黑比诺、赤霞珠、贝达、山葡萄、LDP、L33、SO4等。在实际生产过程中，为了提高酿酒葡萄的经济效益，须及时采取更新苗木、扩大种植面积、提高品种的抗逆性等措施，这些措施的根本途径均离不开酿酒葡萄的快速繁殖。

然而，要想达到快速繁殖的目的，必须考虑酿酒葡萄外植体、培养基、培养温度、培养光照强度等内外因素，其中培养基的选择占据重要位置。在酿酒葡萄快速繁殖过程中，由于品种较多，其基因型不尽相同，初代无菌苗的内源激素水平也不完全一致。若在基本培养基上添加的外源激素相同，则会出现有些品种生根、生长势较好，有些品种不能生根、生长势较差。凝固剂（支持剂）——琼脂也具有较大的影响，若琼脂浓度过大，则会对根的伸长和生长产生阻碍作用；若琼脂浓度过低，则会出现无菌苗倒伏等不利因素。因此，有必要针对不同酿酒葡萄品种筛选适合组培快繁的培养条件，找到最佳的培养环境，加快苗木的快速繁殖。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为常用黑比诺、赤霞珠、贝达、山葡萄、LDP、L33、SO4等7个酿酒葡萄品种提供一种快速有效的组培快繁方法。

所采用的技术方案如下：一种酿酒葡萄品种组培快繁方法，按下述步骤完成：

（A）培养基选用及制作方法:选用GS作为基本培养基，添加糖源为蔗糖、凝固剂为琼脂，抗生素为注射用青霉素钠，pH值为5.5-6.0；

培养基制作步骤为：1) 在烧杯中加蒸馏水；2) 将GS各母液按照比例取入所述烧杯中；备用；3) 在搪瓷缸中加蒸馏水，进行加热直至沸腾；4) 将琼脂和青霉素钠先后加到3)中所述的沸腾蒸馏水中，煮沸3次，充分搅拌溶解；备用；5) 将所述2）中所得的溶液倒入所述4）中所得的沸腾溶液中，充分搅拌，然后加入蔗糖，再充分搅拌；6) 按要求添加外源激素，然后用蒸馏水定容；7)调节pH值至5.5-6.0；8) 将7）中制作好的培养基均匀的分装到三角瓶中后，在121℃下，高压蒸汽灭菌20min，取出得到硬度适中、清亮透明的培养基备用；

（B）材料选择及接种方法：

选用无菌培养的葡萄成株无菌苗，在无菌条件下，剪取无菌苗茎段，接种在上述（A）制作的培养基上；

（C）培养环境：

光照强度控制在4000-6000LX，温度控制在23-25℃。 

所述培养基的选择为：GS+蔗糖(20g/L) +琼脂(4.0g/L或3.5g/L)+0.002g/L青霉素钠+外源激素，pH值为5.8。

所述剪取无菌苗茎段要求茎段带有一个芽，茎段下部不能少于0.5 cm，茎段上必须带有一个完整叶片。

所述酿酒葡萄品种为：黑比诺、赤霞珠、贝达、山葡萄、LDP、L33、SO4。

所述酿酒葡萄品种分别采用的外源激素及其浓度是：黑比诺：IAA(0.08～0.151mg/L)，赤霞珠：IAA(0.08～0.151mg/L)，贝达：IAA(0.08～0.151mg/L)，山葡萄：IAA(0.08～0.151mg/L)，LDP：GA(0.08～0.151mg/L)+6-BA(0.01～0.05 mg/L)，L33：IBA(0.08～0.151mg/L)，SO4：GA(0.4～0.6mg/L)。

本发明的特点为：获得的酿酒葡萄组培苗在酿酒葡萄快繁及种植推广应用广泛：1)快速繁殖：能缩短酿酒葡萄繁殖周期；2)生根能力强：获得的无菌苗根系发达,有利于移栽。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。

一种酿酒葡萄品种组培快繁方法，按下述步骤完成：

培养基的选择：

（以1L培养基为例）：GS+蔗糖(20g/L) +琼脂(4.0g/L或3.5g/L)+0.002g/L青霉素钠，pH=5.8；

培养基具体制作方法：

（以1L培养基为例）：1) 在500ml烧杯中加300-350ml的蒸馏水；2) 将GS各母液按照比例取到第1步的烧杯中；备用；3) 在搪瓷缸中加400-500ml的蒸馏水，进行加热直至沸腾；4) 将琼脂和0.002g/L的注射用青霉素钠先后加到3)中所述的沸腾蒸馏水中，煮沸3次，充分搅拌溶解；备用；5) 将2)中所得溶液倒入4)中所得的沸腾溶液中，充分搅拌，然后加入蔗糖，再充分搅拌；6) 按要求添加适当的外源激素，然后用蒸馏水定容至1L；7) 用1.0mol/L的HCl调节pH值至5.8；8) 将制作好的培养基均匀的分装到20个150ml的三角瓶中，加棉塞、用牛皮纸包裹、捆绑后，在121℃下，高压蒸汽灭菌20min，取出得到硬度适中、清亮透明的培养基备用； 

外源激素及其浓度的选用：

若外植体材料为黑比诺，激素母液IAA浓度为0.1 mg/L，则配置1L培养基取用母液IAA的体积分别为0.8～1.5 ml，优选1 ml。

若外植体材料为赤霞珠，激素母液IAA浓度为0.1 mg/L，则配置1L培养基取用母液IAA的体积分别为0.8～1.5 ml，优选1 ml。

若外植体材料为贝达，激素母液IAA浓度均0.1 mg/L，则配置1L培养基取用母液IAA的体积分别为0.8～1.5 ml，优选1 ml。

若外植体材料为山葡萄，激素母液IAA浓度为0.1 mg/L，则配置1L培养基取用母液IAA的体积分别为0.8～1.5 ml，优选1 ml。

若外植体材料为LDP，激素母液(GA、6-BA)浓度均为0.1 mg/L，则配置1L培养基取用母液GA和6-BA的体积分别为0.8～1.5 ml和0.1～0.5ml，优选1 ml和0.2ml。

若外植体材料为L33，激素母液IBA浓度为0.1 mg/L，则配置1L培养基取用母液IBA的体积分别为0.8～1.5 ml，优选1 ml。

若外植体材料为SO4，激素母液GA浓度均为0.1 mg/L，则配置1L培养基取用母液GA的体积分别为4.0～6.0 ml，优选5 ml。

接种方法：

选用无菌培养的成株无菌苗，在无菌条件下，剪取无菌苗茎段,要求茎段带有一个芽，茎段下部不能少于0.5cm，茎段上必须带有一个完整叶片，接种在上述适当的培养基上。

培养环境：

光照强度控制在4000-6000LX，温度控制在23-25℃。

本发明的实验结果如下：

在GS+蔗糖(20g/L) +琼脂(4.0g/L或3.5g/L)+0.002g/L青霉素钠的培养基上,添加不同种类、浓度的外源激素情况下，黑比诺、赤霞珠、贝达、山葡萄、LDP、L33、SO4 7个酿酒葡萄品种的实验结果依次如下:

黑比诺：添加外源激素IAA(0.1mg/mL)，接种20天后平均根长达到7cm左右，根数3-4条，植株生长势好，25天可成苗；若添加相同激素IAA(0.5mg/mL),则外植体不生根,只产生愈伤组织；若添加不同外源激素IBA（0.1mg/mL）,接种20天后平均根长为4cm左右，根数3-4条，植株生长势一般，30天方可成苗。

赤霞珠：添加外源激素IAA(0.1mg/mL)，接种20天后平均根长达到4cm左右，根数4-5条，植株生长势好，25天可成苗；若添加相同激素IAA(0.5mg/mL),则外植体也能生根，只是根粗且短，不利于水分和营养物质的吸收；若添加不同外源激素IBA（0.1mg/mL）,接种20天后平均根长为4cm左右，根数2-3条，植株生长势一般，30天方可成苗。

贝达：添加外源激素IAA(0.1mg/mL)，接种20天后平均根长达到3.5cm左右，根数4-5条，植株生长势好，30天可成苗；若添加相同激素IAA(0.5mg/mL),则外植体不生根,只产生愈伤组织；若添加不同外源激素IBA（0.5mg/mL）,接种20天后平均根长为3cm左右，根数4-6条，根粗大，无毛根，不利于水分营养物质的吸收，植株生长势一般，30天方可成苗。

山葡萄：添加外源激素IAA(0.1mg/mL)，接种20天后平均根长达到4cm左右，根数8-11条，植株生长势好，25天可成苗；若添加相同激素IAA(0.5mg/mL), 接种20天后平均根长为4cm左右，根数5-8条，根粗短，不利于水分营养物质的吸收，植株生长势一般，30天方可成苗。若添加不同外源激素NAA（0.1mg/mL）,外植体易形成愈伤组织，接种20天后平均根长仅为0.5cm左右。

LDP：添加外源激素GA (0.1mg/mL)+6-BA(0.02mg/mL)，接种20天后平均根长达到6cm左右，根数4-5条，植株生长势好，20天可成苗；若添加单一外源激素GA (0.1mg/mL)，接种20天后平均根长达到8cm左右，根数2-3条，根过于纤细，植株生长势一般，20天也可成苗；若添加单一外源激素6-BA(0.02mg/mL)，外植体易形成愈伤组织，不能生根成苗。

L33：添加外源激素IBA(0.1mg/mL)，接种20天后平均根长达到6cm左右根数5-7条，植株生长势好，20天可成苗；若添加相同激素IBA(0.5mg/mL), 接种20天后平均根长为4cm左右，根数5-7条，根粗短，不利于水分营养物质的吸收，植株生长势一般，30天方可成苗；若添加不同外源激素IAA（0.1mg/mL）,外植体易形成愈伤组织，接种20天后根数8-11条，平均根长仅为1cm左右，无毛根。

SO4：添加外源激素GA(0.5mg/mL)，接种20天后平均根长达到5cm左右，根数3-5条，植株生长势好，25天可成苗；若添加相同激素GA(0.1mg/mL), 接种20天后平均根长为3.5cm左右，根数3-5条，株生长势一般，30天方可成苗；若添加不同外源激素NAA（0.5mg/mL）,外植体易形成愈伤组织，接种20天后平均根长仅为0.5cm左右，无毛根。