利用微观动态离子流技术检测水稻氮素营养的方法及其应用

摘要

本发明提供一种利用微观动态离子流技术检测水稻氮素营养的方法，该方法包括以下步骤：1)向微电极灌入离子灌充液至充满所述电极尖端，再将电极前端吸入相应测试离子交换剂；2)将经过步骤1)处理后的电极套入已氯化的Ag/AgCl电极线基座，并放入校正液中校正；3)取待测水稻苗，将其根部先放在测试缓冲液中平衡，再用校正后的电极对待测水稻苗进行检测；4)对检测结果进行处理和分析。该方法主要针对于水稻，实现了对水稻氮素吸收能力的无损、快速、准确检测，耗时短，检测准确性高，不同品种水稻幼苗对不同形态氮素吸收的净离子流对比差异明显，方法简单可靠，为水稻氮素营养高效育种提供无损、快速的筛选方法。

说明书

技术领域

本发明属于农业技术领域，具体地说，涉及一种利用微观动态离 子流技术检测水稻氮素营养的方法及该方法在水稻氮素营养高效利 用方面的应用。

背景技术

氮素是细胞原生质的重要组成成分，是所有生命必需的基本营养 元素，是植物首要的、需求量最大的营养元素，在植株构建、能量代 谢及品质形成等过程中发挥着不可代替的作用，它对植物生长及体内 含氮化合物有着十分重要的影响。适量的氮素能促进植物营养器官和 生殖器官的生长发育，增加绿叶面积，加强光合作用和营养物质的积 累。而过量地施用氮肥导致氮肥利用率(NUE)降低、环境严重污染 等突出问题。

水稻是中国最主要的粮食作物，在农业生产和粮食安全方面具有 举足轻重的地位。而氮素是影响水稻产量和品质最为重要的营养元 素。水稻对氮的吸收、同化与转运直接影响着其生长和发育状况，从 而影响产量和品质。深入研究氮素吸收动态变化规律，有助于采取有 效措施调控水稻生长发育过程，提高产量和改善品质，同时能够节约 肥料、改善土壤营养结构。微观动态离子流检测技术作为无损、实时、 动态、快速的检测方法是鉴别水稻氮素营养利用率的直接工具，利用 该技术检测不同品种水稻对不同形态氮NH₄⁺、NO₃^-的吸收能力，旨 在针对水稻氮素营养高效的评价育种需求，为氮肥高产高效提供理论 依据和技术支持。

NH₄⁺和NO₃^-是高等植物吸收的两种主要氮素形态，而植株对这 两种形态氮素离子的选择性吸收受到植株种类、品种、生长发育阶段 和pH值等土壤理化性质因素影响。MichaelA等研究黑核桃幼苗时发 现，施加合适比例的NH₄⁺/NO₃^-的氮肥能更好地促进黑核桃的生长发 育(Michael A.，Nicodemus K.Nitrate reductase activity and nitrogen compounds in xylem exudate of Juglans nigra seedlings：relation to nitrogen source and supply[J].Trees，2008，22：685-695.)。(在黑核 桃木质部渗出物中硝酸还原酶活性和含氮化合物体现的氮源和补给 关系)因此，在植物生长发育的不同时期保持适宜的NH⁴⁺/NO^3-比例 具有重要的作用，所以利用植物根系对NH₄⁺、NO₃^-离子的吸收能力 来指导合理施肥，实现氮素高效利用成为可能，本发明以空育131、 空育163、绥粳8为实验材料研究不同品种水稻根系对NH₄⁺、NO₃^-离 子的吸收规律，作为不同品种水稻营养高效利用评价筛选的依据。

微观动态离子流检测技术是一项综合性的特异离子/分子检测的 电生理技术，核心技术是在电脑自动控制下利用离子/分子选择性微 电极在不接触被测样品的情况下检测进出样品的离子/分子的浓度 (mM级)、流速(10^-12mol·cm^-2·S^-1)及其运动方向等信息。该技术操 作方便、快捷、实时、无损，能真实反映其他技术难以反映的生命活 动规律。该技术为生命科学研究提供了一种可视化的技术手段，促进 人类探知传统技术无法检测到的信息，已解决了许多科学问题。

为了及时掌握作物生长情况，除根据经验进行外观观察外，往往 以地上部分的氮素营养作为判断作物氮素营养状况的依据。基于化学 组分分析法的传统氮素营养检测方法操作复杂，分析周期长，时效性 差，无法做到作物生长期间的实时、活体检测。

叶绿素计(SPAD)法(李刚华，薛利红，尤娟，等.水稻氮素 和叶绿素SPAD叶位分布特点及氮素诊断的叶位选择[J].中国农业科 学，2007，40(6)：1127-1134.；Arregui L M，Lasa B，Lafarga A， Iranneta I，Baroja E，Quemada M.Evaluation of chlorophyll meters as tools for N fertilization in winter wheat under humid Mediterranean conditions(潮湿地中海条件下，叶绿素含量作为氮肥施用的评价工 具).Eur J Agron，2006，24：140-148.)能快速测定作物叶绿素水平 及快速诊断作物氮素水平。但叶绿素计采集的信息面偏小，工作量较 大，对测定规范有较高的要求，而且诊断标准难掌握。SPAD值会受 年份、地点、品种、土壤性状、作物生长季节及生长环境的影响。

光谱技术(谭昌伟，庄恒扬，周清波.水稻叶片营养的光谱诊断 研究[J].扬州大学学报：农业与生命科学版，2009，30(2)：50-53.； 张立周等.数字图像技术在夏玉米氮素营养诊断中的应用[J].中国生 态农业学报，2010，18(6)：1340-1344.；李红军等.应用数字图像进 行小麦氮素营养诊断中图像分析方法的研究[J].中国生态农业学报， 2011，19(1)：155-159.)具有信息获取快速、经济、可操作性好、 非破坏性等优点，也可发展为远程诊断技术，最近发展较为快速。然 而，光谱技术还不够成熟，而影响光吸收和反射的因素很多，且作 物品种间冠层色彩参数存在差异，应尽量减少误差，使光谱技术做为 氮素诊断方法更加准确，更好地应用于作物的氮素诊断。

如上所述，以往分析作物氮素营养利用效率时常用化学分析方 法、叶绿素计(SPAD)法、光谱技术等方法。如：基于化学组分分 析法的传统氮素营养检测方法操作复杂，分析周期长，时效性差，无 法做到作物生长期间的实时、活体检测；而光谱技术还不够成熟，而 影响光吸收和反射的因素很多，且作物品种间冠层色彩参数存在差 异，误差较大。上述这些方法虽然在一定程度上改善了经验施肥带来 的盲目性和氮肥过量的问题，但仍不能简便、快速、实时、无损、准 确地进行氮素营养形态诊断并指导施肥。因此，开发新的检测水稻真 菌性立枯病的方法具有非常重要的意义。

发明内容

本发明旨在为水稻育苗、水稻育种、水稻栽培提供一种快速、无 损的检测水稻氮素营养的方法，以应用于水稻氮素营养高效利用方 面。

具体地，本发明提供一种利用微观动态离子流检测技术检测水稻 氮素营养的方法，采用BIO-001B系统检测。

所述方法包括以下步骤：

1)向微电极灌入离子灌充液至充满所述电极尖端，再将电极前 端吸入相应测试离子交换剂；

2)将经过步骤1)处理后的电极套入已氯化的Ag/AgCl电极线 基座，并放入校正液中校正；

3)取待测水稻苗，将其根部先放在测试缓冲液中平衡，再用校 正后的电极对待测水稻苗进行检测；

4)对检测结果进行处理和分析。

进一步地，所述方法包括以下步骤：

1)向微电极灌入离子灌充液至充满所述电极尖端1～1.5cm，再 将电极前端吸入相应测试离子交换剂；

2)将经过步骤(1)处理后的电极套入已氯化的Ag/AgCl电极 线基座，并放入校正液中校正；

3)取待测水稻苗，将其根部先放在测试缓冲液中平衡30-40min， 再用校正后的电极对待测水稻苗进行检测10～15min；

4)对检测结果进行处理和分析。

更进一步地，所述方法包括以下步骤：

1)向微电极灌入离子灌充液至充满所述电极尖端1cm，再将电 极前端吸入相应测试离子交换剂；

2)将经过步骤(1)处理后的电极套入已氯化的Ag/AgCl电极 线基座，并放入校正液中校正；

3)取待测水稻苗，将其根部先放在测试缓冲液中平衡30-40min， 再用校正后的电极对待测水稻苗进行检测15min；

4)对检测结果进行处理和分析。

在所述方法中，检测使用的水稻处于幼苗期。

所述微观动态离子流检测技术中测试缓冲液中的测试离子浓度 范围为0.05～0.15mM。

检测使用的水稻处于2叶1心期，测量位置为距所述水稻苗根尖 100～400μm的根尖分生区的外表面10～45μm处。

所述步骤1)中电极的前端吸入液体离子交换剂的长度为：

NH₄⁺：20～50μm；

NO₃^-：40～60μm。

所述步骤1)中的灌充液为：

NH₄⁺：80～140mM NH₄Cl；

NO₃^-：80～140mM CaCl₂。

所述步骤2)中的校正液为：

NH₄⁺：0.05～0.15mM NH₄Cl和0.5～1.5mM NH₄Cl；

NO₃^-：0.05～0.15mM KNO₃和0.5～1.5mM KNO₃；

校正后电极的能斯特方程计算理想值为：

NH₄⁺：56～60mV；

NO₃^-：56～60mV；

所述步骤3)所述的测试缓冲液为：

NH₄⁺：0.8～1.2mM KCl、0.05～0.15mM CaCl₂、0.05～0.15mM NH₄Cl。

NO₃^-：0.05～0.15mM KNO₃、0.8～1.2mM KCl、0.05～0.15mM CaCl₂。

本发明还提供所述利用微观动态离子流技术检测水稻氮素营养 的方法在水稻氮素营养高效利用方面的应用。

以空育131水稻幼苗为参照材料：检测NH₄⁺离子的吸收流速绝 对值大于18.44pmol·cm^-2·S^-1即评价为NH₄⁺离子利用高效植株；检测 NO₃^-离子的吸收流速绝对值大于96.41pmol·cm^-2·S^-1即评价为NO₃^-离 子利用高效植株。

NH₄⁺离子吸收流速绝对值大于18.44pmol·cm^-2·S^-1和NO₃^-离子的 吸收流速绝对值大于96.41pmol·cm^-2·S^-1一同具备的材料可判断为氮素 营养利用高效型水稻品种。

通过测得的NH⁴⁺离子和NO^3-离子的吸收流速，能够指导合理施 肥，实现氮素高效利用成为可能。

本发明利用微观动态离子流检测技术可测得水稻氮素营养高效 利用离子流信息，通过不同水稻品种比较，获得不同水稻氮素营养高 效利用离子流吸收或释放规律，利用此规律评价水稻氮素营养高效利 用，从而实现对水稻氮素营养利用的快速、无损检测，检测后的植株 材料还能够正常生长，避免了珍贵水稻苗的损失，检测结果对比明显， 方法可靠，为水稻育苗、水稻育种、水稻栽培提供了一种快速、无损 的检测氮素营养的新方法。

此外，利用微观动态离子流检测技术直接检测水稻氮素营养利用 直接相关的NH⁴⁺和NO^3-避免了间接检测的各种方法的不足，直接从 检测相应离子吸收速率判断水稻氮素营养的利用差别，鉴别水稻氮素 营养利用效率不同的差异个体。

附图说明

图1为本发明利用微观动态离子流技术检测水稻氮素营养的方法 的实验过程图。

图2为本发明实施例1中的空育131、空育163、绥粳8NH4+离子 动态吸收分析图(实时流速)；

图3为本发明实施例1中的空育131、空育163、绥粳8NH4+平均 离子流速分析图(平均流速)；

图4为本发明实施例1中的空育131、空育163、绥粳8NO3-离子 动态吸收分析图(实时流速)；

图5为本发明实施例1中的空育131、空育163、绥粳8NO3-平均 离子流速分析图(平均流速)；

其中，图2、4中纵坐标为离子流速，单位为pmol.cm^-2.s^-1，横坐 标为时间，单位为秒(s)；图3、5中纵坐标为离子流速，单位为 pmol.cm^-2.s^-1。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未 特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规 手段，所用原料均为市售商品。水稻品种空育131(黑龙江省农垦科 学院水稻研究所)、空育163(黑龙江省农垦科学院水稻研究所)、绥 粳8(黑龙江省农科院绥化农业科学研究所)。

实施例1

1.实验材料及培养条件：为水稻品种空育131(黑龙江省农垦科 学院水稻研究所)、空育163(黑龙江省农垦科学院水稻研究所)、绥 粳8(黑龙江省农科院绥化农业科学研究所)，种子经过10％次氯酸 钠消毒30min，蒸馏水冲洗后，置于底垫湿润滤纸的培养皿上，25℃ 光照培养箱内萌发，发芽后加入Hogland营养液培养，生长至两叶一 心期时，测试其根系的离子流。

2.实验仪器及耗材：

微观动态离子流检测用非损伤微测系统(BIO-001B，Younger USA Sci.&Tech.Corp.，USA)，系统软件imFlux，玻璃微电极尖端 直径为3μm。

3.实验试剂及溶液：

(1)液态离子交换剂包括：

NH₄⁺：Ammonium ionophore I-cocktail A；Sigma-Aldrich，Louis， MO 63103，USA.

NO₃^-：Xuyue(Beijing)Sci.&Tech.Co.，Ltd.Beijing，100080， P.R.China.

(2)测试缓冲液成分：

NH₄⁺离子：0.1mM NH₄Cl、1mM KCl、0.1mM CaCl₂

NO₃^-离子：0.1mM KNO₃、1mM KCl、0.1mM CaCl₂

(3)电极灌充液：

NH₄⁺：100mM NH₄Cl

NO₃^-：10mM KNO₃

(4)校正液：

NH₄⁺离子：0.05mM和0.5mM NH₄Cl

NO₃^-离子：0.05mM和0.5mM KNO₃

4.实验内容及方法：

实验过程如说明书附图1所示。

从电极末端灌入1cm的相应测试离子的灌充液至电极尖端充满， 前端吸入适当长度(NH₄⁺：30μm；NO₃^-：50μm)离子交换剂(LIX)。 将电极套入已氯化的Ag/AgCl电极线基座。参比电极为固体低渗漏性 电极(WPI)。电极在相应的校正液中校正能斯特理想值为：NH₄⁺58mV、NO₃^--58mV。

测试前将材料在相应的测试液中平衡35min。然后在距离水稻根 尖分生区(距离根尖400μm)表面20μm的地方振动检测，每个样品 检测15min。

5.数据处理

离子流处理基于Fick′s扩散定律，并通过在线软件MageFlux-3D Ion Flux Plotting System(http://www.xuyue.net/mageflux/)计算得 出。由大于3次独立实验所得到的数据做统计分析，利用Excel2003分 析作图。

6实验评价结果：

如图2和图3所示，三种水稻空育131、空育163、绥粳8幼苗吸收 NH₄⁺离子幅度不同，其离子吸收平均流速分别为-24.88pmol·cm^-2·S^-1、 -33.58pmol·cm^-2·S^-1、-39.74pmol·cm^-2·S^-1。

如图4和图5所示，三种水稻空育131、空育163、绥粳8幼苗 对NO₃^-吸收幅度很大，离子吸收平均流速分别为 -102.48pmol·cm^-2·S^-1、-261.81pmol·cm^-2·S^-1、-253.38pmol·cm^-2·S^-1。 实施例2

1.实验材料及培养条件同实施例1。

2.实验仪器及耗材

微观动态离子流检测用非损伤微测系统(BIO-001B，Younger USA Sci.&Tech.Corp.，USA)，系统软件imFlux，玻璃微电极尖端 直径为2μm。

3.实验试剂及溶液：

(1)液态离子交换剂包括：

NH₄⁺：Ammonium ionophore I-cocktail A；Sigma-Aldrich，Louis， MO 63103，USA.

NO₃^-：Xuyue(Beijing)Sci.&Tech.Co.，Ltd.Beijing，100080， P.R.China.

(2)测试缓冲液成分：

NH₄⁺离子：0.05mM NH₄Cl、0.8mM KCl、0.05mM CaCl₂

NO₃^-离子：0.05mM KNO₃、0.8mM KCl、0.05mM CaCl₂

(3)电极灌充液：

NH₄⁺：100mM NH₄Cl

NO₃^-：10mM KNO₃

(4)校正液：

NH₄⁺离子：0.15mM和1.5mMNH₄Cl

NO₃^-离子：0.15mM和1.5mM KNO₃

4.实验内容及方法：

实验过程如说明书附图1所示。

从电极末端灌入1.5cm的相应测试离子的灌充液至电极尖端充 满，前端吸入适当长度(NH₄⁺：20μm；NO₃^-：40μm)离子交换剂 (LIX)。将电极套入已氯化的Ag/AgCl电极线基座。参比电极为固体 低渗漏性电极(WPI)。电极在相应的校正液中校正能斯特理想值为： NH₄⁺：56mV、NO₃^-：56mV。测试前将材料在相应的测试液中平衡 30min。然后在距离水稻根尖分生区(距离根尖100μm)表面10μm 的地方振动检测，每个样品检测10min。

5.数据处理

离子流处理基于Fick′s扩散定律，并通过在线软件MageFlux-3D Ion Flux Plotting System(http://www.xuyue.net/mageflux/)计算得 出。由大于3次独立实验所得到的数据做统计分析，利用Excel2003分 析数据。

6实验评价结果：

三种水稻空育131、空育163、绥粳8幼苗吸收NH₄⁺离子幅度不同， 其离子吸收平均流速分别为-20.00pmol·cm^-2·S^-1、-31.01pmol·cm^-2·S^-1、 -35.22pmol·cm^-2·S^-1。

三种水稻空育131、空育163、绥粳8幼苗对NO₃^-吸收幅度很大， 离子吸收平均流速分别为-100.03pmol·cm^-2·S^-1、-260.55pmol·cm^-2·S^-1、 -251.74pmol·cm^-2·S^-1。

实施例3

1.实验材料及培养条件同实施例1。

2.实验仪器及耗材：

微观动态离子流检测用非损伤微测系统(BIO-001B，Younger USA Sci.&Tech.Corp.，USA)，系统软件imFlux，玻璃微电极尖端 直径为4μm。

3.实验试剂及溶液：

(1)液态离子交换剂包括：

NH₄⁺：Ammonium ionophore I-cocktail A；Sigma-Aldrich，Louis， MO 63103，USA

NO₃^-：Xuyue(Beijing)Sci.&Tech.Co.，Ltd.Beijing，100080， P.R.China.

(2)测试缓冲液成分：

NH₄⁺离子：0.15mM NH₄Cl、1.2mM KCl、0.15mM CaCl₂

NO₃^-离子：0.15mM KNO₃、1.2mM KCl、0.15mM CaCl₂

(3)电极灌充液：

NH₄⁺：100mM NH₄Cl

NO₃^-：10mM KNO₃

(4)校正液：

NH₄⁺离子：0.15mM和1.5mMNH₄Cl

NO₃^-离子：0.15mM和1.5mM KNO₃

4.实验内容及方法：

实验过程如说明书附图1所示。

从电极末端灌入1cm的相应测试离子的灌充液至电极尖端充满， 前端吸入适当长度(NH₄⁺：50μm；NO₃^-：60μm)离子交换剂(LIX)。 将电极套入已氯化的Ag/AgCl电极线基座。参比电极为固体低渗漏 性电极(WPI)。电极在相应的校正液中校正能斯特理想值为：NH₄⁺： 60mV、NO₃^-：60mV。

测试前将材料在相应的测试液中平衡40min。然后在距离水稻根 尖分生区(距离根尖400μm)表面20μm的地方振动检测，每个样 品检测40min。

5.数据处理

离子流处理基于Fick′s扩散定律，并通过在线软件MageFlux-3D Ion Flux Plotting System(http://www.xuyue.net/mageflux/)计算得 出。由大于3次独立实验所得到的数据做统计分析，利用Excel2003 分析数据。

6.实验评价结果：

三种水稻空育131、空育163、绥粳8幼苗吸收NH₄⁺离子幅度不 同，其离子吸收平均流速分别为-18.44pmol·cm^-2·S^-1、-28.15pmol·cm^-2·S^-1、-36.65pmol·cm^-2·S^-1。

三种水稻空育131、空育163、绥粳8幼苗对NO₃^-吸收幅度很大， 离子吸收平均流速分别为-96.41pmol·cm^-2·S^-1、-251.76pmol·cm^-2·S^-1、 -241.35pmol·cm^-2·S^-1。

因此，本发明以空育131水稻幼苗为参照材料：检测NH₄⁺离子 的吸收流速绝对值大于18.44pmol·cm^-2·S^-1即评价为NH₄⁺离子利用高 效植株；检测NO₃^-离子的吸收流速绝对值大于96.41pmol·cm^-2·S^-1即 评价为NO₃^-离子利用高效植株；而NH₄⁺离子吸收流速绝对值大于 18.44pmol·cm^-2·S^-1和NO₃^-离子的吸收流速绝对值大于 96.41pmol·cm^-2·S^-1一同具备的材料可判断为氮素营养利用高效型水 稻品种。本实施例中的空育163和绥粳8即为氮素营养高效利用型水 稻品种。

由上述实施例可以看出，三种水稻空育131、空育163、绥粳8 吸收NO₃^-离子的能力和NH₄⁺离子的能力都不尽相同，说明不同品种 的水稻对氮肥的利用效率不同。利用参照的水稻品种空育131的离子 流检测结果作为标准，来判断其他品种对NH₄⁺、NO₃^-离子的吸收能 力的差别鉴别不同水稻品种的氮素营养利用效率。本方法可作为水稻 氮素营养高效利用的评价手段，合理精确施加不同形态氮肥的一种快 速有效的技术手段，同时也为水稻氮素营养高效育种提供无损、快速 的筛选方法。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。