人KLF8基因在肿瘤治疗中的新用途

摘要

本发明公开了人KLF8基因的用途及其相关药物。本发明公开了人KLF8基因在肿瘤治疗、肿瘤诊断及药物制备中的新用途。本发明还进一步构建了人KLF8基因小分子干扰RNA、人KLF8基因干扰核酸构建体、人KLF8基因干扰慢病毒并公开了他们的用途。本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人KLF8基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中KLF8基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体设计人KLF8基因在肿瘤治疗中的新用途。

背景技术

核糖核酸干扰(RNA interference，RNAi)作为一种基因沉默技术，可高效、特异地阻断体内特定基因的表达，从而引起生物体内特异基因的沉默，使细胞表现出某种基因表型的缺失。目前，该技术在基因功能研究、肿瘤的基因治疗及新药的研发等方面已经显示出广阔前景。siRNA被认为是RNA干扰的主要效应物，但是由于转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成的siRNA对基因表达的抑制作用一般是短暂的。临床研究中，一般采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体，然后转移到细胞内转录siRNA的策略。目前常用的载体有逆转录病毒、腺病毒和慢病毒。慢病毒表达系统相比于其他表达系统，具有免疫原性低、感染效率高、感染时间长、感染效果稳定、且能感染分裂相细胞和非分裂相细胞等优点。慢病毒载体技术在国外已经发展到了临床研究阶段，是生物医药研究领域在临床肿瘤的应用技术研究的强力手段。

核糖核酸干扰(RNA interference，RNAi)作为一种基因沉默技术，可高效、特异地阻断体内特定基因的表达，从而引起生物体内特异基因的沉默，使细胞表现出某种基因表型的缺失。研究发现，长度为21-23个核苷酸组成的短的双链核糖核酸(dsRNA)能够在转录和转录后水平特异性的引起基因沉默(Zamore PD，Tuschl T，Sharp PA，Bartel DP.RNAi：double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21to 23nucleotideintervals.Cell.2000；101(1)：25-33.)。目前，该技术在基因功能研究、肿瘤的基因治疗及新药的研究与开发等方面已显示出广阔前景。最新的研究发现，一种特定的由21个碱基组成的小干扰核糖核酸(siRNA)在一种直径仅为70nm的微小载体运送下经血液循环到达皮肤癌患者的癌变部位，干扰了癌细胞RRM2基因并起到治疗作用，且不引起免疫系统的排异反应(Davis ME，Zuckerman JE，Choi CH，Seligson D，Tolcher A，Alabi CA，Yen Y，Heidel JD，Ribas A.Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targetednanoparticles.Nature.2010Apr 15；464(7291)：1067-70.)。

Kruppel样转录因子(Kruppel-like factors，KLF)是一类具有锌指结构的基础转录因子，以细胞和启动子特异性方式通过调控富含GC启动子的基因表达，广泛参与细胞增殖、凋亡、分化及胚胎发育、癌症发生和血管形成等生理病理过程。目前在哺乳动物中共有17个KLF成员被确认(按照发现顺序命名为KLF1到KLF17)。这些KLF因子广泛表达于各种细胞系中，在不同的细胞中发挥着重要的作用，包括心血管重建(Shindo T，Manabe I，Fukushima Y，Tobe K，Aizawa K，Miyamoto S，Kawai-Kowase K，Moriyama N，Imai Y，Kawakami H，Nishimatsu H，Ishikawa T，Suzuki T，Morita H，Maemura K，Sata M，Hirata Y，Komukai M，Kagechika H，Kadowaki T，Kurabayashi M，Nagai R.Krüppel-like zinc-finger transcription factorKLF5/BTEB2is a target for angiotensin II sighaling and an essential regulator of cardiovascularremodeling.Nat Med.2002；8(8)：856-63.)、造血、血管生成(Bhattacharya R，Senbanerjee S，LinZ，Mir S，Hamik A，Wang P，Mukherjee P，Mukhopadhyay D，Jain MK.Inhibition of vascularpermeability factor/vascular endothelial growth factor-mediated angiogenesis by the Kruppel-likefactor KLF2.J Biol Chem.2005；280(32)：28848-51.)、肿瘤发生(Rowland BD，Bernards R，Peeper DS.The KLF4 tumour suppressor is a transcriptional repressor of p53that acts as acontext-dependent oncogene.Nat Cell Biol.2005；7(11)：1074-82.)、内皮基因表达(Parmar KM，Larman HB，Dai G，Zhang Y，Wang ET，Moorthy SN，Kratz JR，Lin Z，Jain MK，Gimbrone MA Jr，García- G.Integration of flow-dependent endothelial phenotypes by Kruppel-like factor 2.J Clin Invest.2006；116(1)：49-58.)、糖异生(Gray S，Wang B，Orihuela Y，Hong EG，Fisch S，Haldar S，Cline GW，Kim JK，Peroni OD，Kahn BB，Jain MK.Regulation of gluconeogenesis byKrüppel-like factor 15.Cell Metab.2007；5(4)：305-12.)、单核细胞活化(Feinberg MW，Cao Z，Wara AK，Lebedeva MA，Senbanerjee S，Jain MK.Kruppel-like factor 4is a mediator ofproinflammatory signaling in macrophages.J Biol Chem.2005；280(46)：38247-58.)和多元肝细胞分化方向(Takahashi K，Yamahaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouseembryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.Cell.2006；126(4)：663-76.)的决定等。

作为该家族成员之一的KLF8最初是作为Kruppel样CyS2/His2锌指转录因子蛋白家族的一个转录抑制蛋白而被识别的，通过与辅助抑制因子羧基端结合蛋白(C-terminal bindingprotein，CtBP)相互作用抑制基因表达(van Vliet J，Turner J，Crossley M.Human Krüppel-likefactor 8：a CACCC-box binding protein that associates with CtBP and represses transcription.Nucleic Acids Res.2000；28(9)：1955-62.)。最近的研究发现，KLF8在多种肿瘤细胞系和肾细胞癌、肝细胞癌、乳腺癌、卵巢癌等肿瘤中均过表达，在肿瘤增殖、侵袭、转移、致癌转化中发挥重要作用(Wang X，Zhao J.KLF8 transcription factor participates in oncogenictransformation.Oncogene.2007；26(3)：456-61.Wang X，Zheng  M，Liu  G，Xia W，McKeown-Longo PJ，Hung MC，Zhao J.Krüppel-like factor 8 induces epithelial to mesenchymaltransition and epithelial eell invasion.Cancer Res.2007；67(15)：7184-93.Wang X，Lu H，UrvalekAM，Li T，Yu L，Lamar J，Dipersio CM，Feustel PJ，Zhao J.KLF8 promotes human breast cancercell invasion and metastasis by transcriptional activation of MMP9.Oncogene.2010.Wang X，Urvalek AM，Liu J，Zhao J.Activation of KLF8 transcription by focal adhesion kinase in humanovarian epithelial and cancer cells.J Biol Chem.200816；283(20)：13934-42.)。其中，在肾细胞癌组织中，KLF8的表达显著高于癌旁非肿瘤组织。KLF8siRNA抑制人肾癌细胞系786-0的生长和侵袭，诱导G0/G1期的细胞增多，促进细胞的凋亡(Fu WJ，Li JC，Wu XY，Yang ZB，Mo ZN，Huang JW，Xia GW，Ding Q，Liu KD，Zhu HG.Small interference RNA targetingKrüppel-like factor 8inhibits the renal carcinoma 786-0cells growth in vitro and in vivo.JCancer Res Clin Oncol.2010；136(8)：1255-65.)。在高转移性肝癌细胞及复发肝癌病人肿瘤组织中，KLF8过表达。KLF8表达上调能够促进肝癌细胞的增殖和侵袭，抑制肝癌细胞凋亡(Li JC，Yang XR，Sun HX，Xu Y，Zhou J，Qiu SJ，Ke AW，Cui YH，Wang ZJ，Wang WM，LiuKD，Fan J.Up-regulation of Krüppel-like factor 8 promotes tumor invasion and indicates poorprognosis for hepatocellular carcinoma.Gastroenterology.2010；139(6)：2146-2157.e12.)。此外，发现整合蛋白FAK能够诱导KLF8表达，活化的KLF8作用于cyclinD1启动子GC盒中的A，激活cyclinD1，进而发挥其调控细胞周期的作用(Zhao J，Bian ZC，Yee K，Chen BP，ChienS，Guan JL.Identification of transcription factor KLF8as a downstream target of focal adhesionkinase in its regulation ofcyclin D1and cell cycle progression.Mol Cell.2003；11(6)：1503-15.)。KLF8的转录后翻译受到类泛素化作用的调节，类泛素化可负调节KLF8的转录活性和细胞周期调节功能(Wei H，Wang X，Gan B，Urvalek AM，Melkoumian ZK，Guan JL，Zhao J.Sumoylation delimits KLF8 transcriptional activity associated with the cell cycle regulation.JBiol Chem.2006；281(24)：16664-71.Epub 2006Apr 13.)。上述研究阐释了KLF8的在恶性肿瘤的发生和发展中发挥重要的功能。然而，目前尚未有KLF8调节胰腺癌、胃癌和胶质瘤恶性增殖的相关研究。

发明内容

本发明的目的在于公开与人KLF8基因相关的治疗方法及药物。

本发明第一方面，公开了将人KLF8基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物，或者将人KLF8基因用于制备肿瘤诊断药物。

人KLF8基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物包括两方面的内容：其一，将人KLF8基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物或制剂；其二，将人KLF8基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂。

所述将人KLF8基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标具体是指：将人KLF8基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞产生RNA干扰作用的靶标，从而能降低肿瘤细胞人KLF8基因的表达水平。

所述将人KLF8基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂具体是指：将人KLF8基因作为作用对象对药物或制剂进行筛选，以找到可以抑制或促进人KLF8基因表达的药物作为肿瘤治疗备选药物。如之后所述的人KLF8基因小分子干扰RNA即是以人KLF8基因为作用对象筛选获得的，可用作具有抑制肿瘤细胞增殖作用的药物。诸如抗体药物，小分子药物等也可将KLF8基因作为作用对象。

所述将人KLF8基因用于制备肿瘤诊断药物，是指将人KLF8基因表达产物作为一项肿瘤诊断指标应用于肿瘤诊断药物的制备。

所述的肿瘤可以为其肿瘤细胞的增殖与人KLF8基因的表达相关的任一种肿瘤，更进一步的，为一种恶性肿瘤，例如选自：人胰腺癌、胃癌和胶质瘤。

所述肿瘤治疗药物可以为小分子化学药，抗体药，也可以为核酸类药物。

进一步的，所述肿瘤治疗药物能降低人KLF8基因的表达水平从而抑制肿瘤细胞的增殖。

采用前述肿瘤治疗药物治疗肿瘤的方法，主要是通过降低人KLF8基因的表达水平抑制肿瘤细胞的增殖来达到治疗目的的。

具体的，治疗时，将能有效降低人KLF8基因表达水平的物质给药于患者。

进一步的，所述的能有效降低人KLF8基因表达水平的物质，包括能够特异性沉默人KLF8基因表达的小分子干扰RNA(siRNA)。该小分子干扰RNA(siRNA)可以起到特异性沉默肿瘤细胞中内源KLF8基因的表达的作用。

进一步的，所述小分子干扰RNA以选自SEQ ID NO：1-19之任一的序列作为特异性沉默人KLF8基因表达的靶点序列。

所述小分子干扰RNA以选自SEQ ID NO：1-19之任一的序列作为特异性沉默人KLF8基因表达的靶点序列是指：该小分子干扰RNA能与SEQ ID NO：1-19中的任一种序列所编码的mRNA片段特异性结合，并特异性沉默人KLF8基因的表达。

进一步的，所述能够特异性沉默人KLF8基因表达的小分子干扰RNA(siRNA)经由慢病毒载体表达。具体而言，这个过程包括：将编码所述人KLF8基因小分子干扰RNA的DNA片段克隆入慢病毒载体获得人KLF8基因干扰慢病毒载体，进而利用该人KLF8基因干扰慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染肿瘤细胞并最终表达所述siRNA。

人KLF8基因干扰慢病毒载体为将编码所述人KLF8基因小分子干扰RNA的DNA片段克隆入慢病毒载体后获得，能产生人KLF8基因小分子干扰RNA。

进一步的，所述的慢病毒载体可选自：pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ中的任一种慢病毒载体，本发明实施例具体列举了以pGCSIL-GFP为载体。

慢病毒载体可在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒。

本发明第二方面，公开了一种分离的人KLF8基因小分子干扰RNA(siRNA)靶标片段，其序列为SEQ ID NO：1-19中任意一条序列。

所述分离的人KLF8基因小分子干扰RNA(siRNA)靶标片段可应用于人KLF8基因小分子干扰RNA的筛选与制备。

本发明第三方面，公开了一种人KLF8基因小分子干扰RNA(siRNA)，能够特异性沉默人KLF8基因的表达。

所述人KLF8基因小分子干扰RNA以选自SEQ ID NO：1-19之任一的序列作为特异性沉默人KLF8基因表达的靶点序列。

进一步的，所述人KLF8基因小分子干扰RNA包含正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义RNA片段和所述反义RNA片段互补，所述正义RNA片段含有SEQ ID NO：1-19中之任一序列编码的RNA。

所述正义RNA片段和反义RNA片段存在于两条不同的RNA链上或者存在于同一条RNA链上。

所述正义RNA片段和反义RNA片段的长度均为15-27个核苷酸；较佳的，长度均为19-23个核苷酸；最佳的，长度均为19、20或者21个核苷酸。

进一步的，所述人KLF8基因小分子干扰RNA为发夹型单链RNA，包括正义RNA片段、茎环片段和反义RNA片段，正义RNA片段和反义RNA片段中间由茎环片段分隔；其中，正义RNA片段和反义RNA片段互补，正义RNA片段的序列选自SEQ ID NO：1-19之任一。

所述茎环片段结构包括6个或9个碱基。进一步的所述茎环片段的序列选自以下任一：UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC。本发明具体列举了以UUCAAGAGA为茎环。

如实施例列举的，所述人KLF8基因小分子干扰RNA的序列为SEQ ID NO：20：CAGCACUGUUUAAUGACAUUUCAAGAGAAUGUCAUUAAACAGUGCUG。

本发明第四方面，公开了一种人KLF8基因干扰核酸构建体，包含编码前述人KLF8基因小分子干扰RNA的基因片段，能表达前述人KLF8基因小分子干扰RNA。

所述的人KLF8基因干扰核酸构建体可以是将编码前述人KLF8基因小分子干扰RNA的基因片段克隆入已知载体获得。

进一步的，所述人KLF8基因干扰核酸构建体为人KLF8基因干扰慢病毒载体，为将编码所述人KLF8基因小分子干扰RNA的基因片段克隆入慢病毒载体后获得，能产生人KLF8基因小分子干扰RNA。

所述慢病毒载体可以选自：pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ中的任一。

本发明实施例具体列举了以pGCSIL-GFP为载体构建的人KLF8基因干扰核酸构建体，命名为P-KLF8-siRNA-N。

进一步的，编码所述人KLF8基因小分子干扰RNA的基因片段的序列含有SEQ IDNO：1-19中之任一序列及其互补序列。

本发明的人KLF8基因小分子干扰RNA可用于抑制肿瘤细胞的增殖，进一步地可以用作治疗或诊断肿瘤的药物或制剂。人KLF8基因干扰核酸构建体则可用于制备所述人KLF8基因小分子干扰RNA。

当用作治疗肿瘤的药物或制剂时，是将安全有效量的人KLF8基因小分子干扰RNA施用于哺乳动物。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明第五方面，公开了一种人KLF8基因干扰慢病毒，由前述人KLF8基因干扰慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。该慢病毒可感染肿瘤细胞并产生人KLF8基因小分子干扰RNA，从而抑制肿瘤细胞的增殖。

本发明第六方面，还公开了一种药物组合物，含有治疗有效量的人KLF8基因小分子干扰RNA或人KLF8基因干扰慢病毒。

进一步的，所述药物组合物含有1～99wt％如前所述的人KLF8基因小分子干扰RNA或人KLF8基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在制备这些组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括：湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。

综上所述，本发明设计了针对人KLF8基因的19个RNAi靶点序列，构建相应的KLF8RNAi载体，其中编码序列SEQ ID NO：7的RNAi载体P-KLF8-siRNA-N能够显著下调KLF8基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。使用慢病毒(lentivirus，简写为Lv)作为基因操作工具携带RNAi载体P-KLF8-siRNA-N能够靶向地将针对KLF8基因的RNAi序列高效导入人胰腺癌Panc-1、胃癌SGC7901细胞和胶质瘤U251细胞，降低KLF8基因的表达水平，显著抑制上述肿瘤细胞的增殖能力。因此慢病毒介导的KLF8基因沉默是恶性肿瘤潜在的临床非手术治疗方式。

本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人KLF8基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中KLF8基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。

附图说明

图1为pGCSIL-GFP质粒DNA图谱示意图。

图2表示KLF8-siRNA-N慢病毒侵染人胰腺癌Panc-1细胞、胃癌SGC7901细胞和胶质瘤U251细胞5天后，KLF8mRNA的表达水平示意图。

图3为高内涵筛选分析仪检测KLF8-siRNA-N慢病毒侵染人胰腺癌Panc-1细胞5天内，细胞Panc-1的增殖能力结果示意图。

图4为高内涵筛选分析仪检测KLF8-siRNA-N慢病毒侵染人胃癌SGC7901细胞5天内，细胞SGC7901的增殖能力结果示意图。

图5为高内涵筛选分析仪检测KLF8-siRNA-N慢病毒侵染人胶质瘤U251细胞5天内，细胞U251的增殖能力结果示意图。

图6使用klf8抗体在肿瘤组织样本上的免疫组化检测结果

a为胃癌，b为胰腺癌，c、d为肺癌

具体实施方式

本发明基于锌指蛋白KLF8在肿瘤组织中显著高表达，可能与肿瘤细胞的增殖、耐药和血管形成等相关的研究，认为KLF8作为一个新发现的锌指蛋白还可能参与了人胰腺癌、喉癌、肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌和胶质瘤的发生和发展。

本发明涉及了一组针对人KLF8基因的小分子干扰RNA(siRNA)序列、RNA干扰载体和RNA干扰慢病毒。选取人KLF8mRNA编码区序列作为siRNA的靶位点，根据靶位点中连续的10-30(优选15-27，更优选19-23)个碱基序列设计siRNA靶点序列。通过基因克隆，构建表达上述siRNA的核酸构建体，包装表达上述siRNA的慢病毒。细胞实验证明，上述siRNA序列能够特异性沉默人肿瘤细胞中内源KLF8基因的表达。

发明人发现，采用RNAi方法下调人KLF8基因的表达后可有效地抑制肿瘤细胞的增殖，表明KLF8基因是原癌基因，可作为肿瘤治疗的靶点。发明人进一步合成和测试了多种针对KLF8基因的siRNA，筛选出了可有效抑制KLF8的表达进而抑制人胰腺癌Panc-1细胞、胃癌SGC7901细胞和胶质瘤U251细胞增殖的siRNA，在此基础上完成了本发明。

本发明提供了一系列干扰人KLF8基因的小干扰RNA(siRNA)序列，构建了可特异性沉默KLF8基因表达的慢病毒。本发明研究发现，针对人KLF8基因设计的小干扰RNA及RNAi慢病毒，稳定并特异地下调KLF8基因的表达，并有效地抑制人肿瘤细胞的增殖。本发明表明KLF8基因可促进肿瘤细胞生长，有望成为肿瘤早期诊断和治疗的靶点。而且，通过RNAi方式沉默KLF8基因的表达，可作为抑制肿瘤发展的有效手段。

本发明的设计思路为：

本发明通过如下方法来筛选获得一种人KLF8基因RNAi慢病毒：从Genbank中调取人KLF8基因序列；预测siRNA位点；合成针对KLF8基因的有效的siRNA序列，两端含酶切位点粘端的双链DNA Oligo；慢病毒载体双酶切后与双链DNA Oligo连接，构建表达KLF8基因siRNA序列的RNAi质粒；将RNAi质粒和慢病毒包装需要的辅助载体(Packing Mix，Sigma-aldrich公司)共转染人胚肾细胞293T，产生重组慢病毒颗粒，即可制得高效沉默KLF8基因的慢病毒。

基于上述方法，本发明提供了19个干扰KLF8基因的有效靶点(具体如SEQ ID NO：1-19所示)，构建了特异干扰人KLF8基因的慢病毒。

同时本发明还公开一种人KLF8基因RNAi慢病毒(KLF8-RNAi)及其制备与应用。

本研究发现，利用慢病毒介导的RNAi方法，在降低KLF8基因在肿瘤细胞中的表达后，可以有效抑制肿瘤细胞的增殖。本研究表明，KLF8基因是一个原癌基因，可促进肿瘤细胞增殖，在肿瘤发生和发展中具有重要的生物学功能，KLF8基因可以为肿瘤治疗的靶标，慢病毒介导的KLF8基因特异性沉默可作为肿瘤治疗的一种新手段。

下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件，如[美]Sambrook.J等著；黄培堂等译。分子克隆试验指南，第三版。北京：科学出版社2002中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。

实施例1：人KLF8基因高效干扰慢病毒的筛选与制备。

1.对人KLF8基因的有效的siRNA靶点的筛选

从Genbank调取KLF8(NM_007250)基因信息；利用上海吉凯基因化学技术有限公司的设计软件Genechem设计针对KLF8基因的有效的siRNA靶点。在KLF8基因的编码序列(CDS)区域内，每隔一个碱基起始获得19或21个碱基的序列，表1列出了其中19条针对KLF8基因的有效siRNA靶点序列。

表1靶向于人KLF8基因的siRNA靶点序列

  序列号  TargetSeq  SEQ ID NO：1  CAGCAAGAACCAGCAGCAA  SEQ ID NO：2  GAGAAGACGGATTCACCAA  SEQ ID NO：3  CAGGATGCAGCAAAGTGTA  SEQ ID NO：4  CAGCAAAGTGTACACCAAA  SEQ ID NO：5  CTGAAAGCTCACCGCAGAA

  SEQ ID NO：6  GCTCACCGCAGAATCCATA  SEQ ID NO：7  CAGCACTGTTTAATGACAT  SEQ ID NO：8  CCCAGCACTGTTTAATGACAT  SEQ ID NO：9  CTAGCATGCTACAAGCTCCAA  SEQ ID NO：10  CCTCAGTCAGTCTGCCAAATA  SEQ ID NO：11  GCCATTACAGTCCCACTCATT  SEQ ID NO：12  TACAGCAAGAACCAGCAGCAA  SEQ ID NO：13  AAGAGAAGACGGATTCACCAA  SEQ ID NO：14  CGGATTCACCAATGTGACTTT  SEQ ID NO：15  TGCAGGATGCAGCAAAGTGTA  SEQ ID NO：16  TGCAGCAAAGTGTACACCAAA  SEQ ID NO：17  ACCTGAAAGCTCACCGCAGAA  SEQ ID NO：18  AAGCTCACCGCAGAATCCATA  SEQ ID NO：19  CGCTGCTTTATTCTTTCCAAT

针对siRNA靶点(以SEQ ID NO：7为例)合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo序列(表2)；以AgeI和EcoR I限制性内切酶作用于pGCSIL-GFP载体(上海吉凯基因化学技术有限公司提供，图1)，使其线性化，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切片段。

表2两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo

通过T4DNA连接酶将双酶切线性化(酶切体系如表4所示，37℃，反应1h)的载体DNA和纯化好的双链DNAOligo连接，在适当的缓冲体系(连接体系如表5所示)中于16℃连接过夜，回收连接产物。将连接产物转化氯化钙制备的新鲜的大肠杆菌感受态细胞(转化操作参考：分子克隆实验指南第二版55-56页)。在连接转化产物长出菌克隆表面沾一下，溶于10μl LB培养基，混匀取1μl作为模板；在以慢病毒载体中RNAi序列的上下游，设计通用PCR引物(上游引物序列：5’-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3’(SEQ ID NO：21)；下游引物序列：5’-GTAATACGGTTATCCACGCG-3’(SEQ ID NO：22)，进行PCR鉴定实验(PCR反应体系如表6-1，反应条件如表6-2)。对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的克隆即为构建成功的含有SEQ ID NO：7的RNAi载体，命名为P-KLF8-siRNA-N。

构建pGCSIL-GFP-Scr-siRNA阴性对照质粒，阴性对照siRNA靶序列为5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’(SEQ ID NO：23)。构建pGCSIL-GFP-Scr-siRNA阴性对照质粒时，针对Scr(scramble)siRNA靶点合成两端含AgeI和EcoRI酶切位点粘端的双链DNA Oligo序列(表3)，其余构建方法、鉴定方法及条件均同P-KLF8-siRNA-N。

表3两端含AgeI和EcoRI酶切位点粘端的双链DNAOligo

通过T4DNA连接酶将双酶切线性化(酶切体系如表4所示，37℃，反应1h)的载体

表4pGCSIL-GFP质粒酶切反应体系

  试剂 体积(μl)  pGCSIL-GFP质粒(1μg/μl)  2.0  10×buffer  5.0  100×BSA  0.5  AgeI(10U/μl)  1.0  EcoRI(10U/μl)  1.0  ddH₂O  40.5  Total  50.0

表5载体DNA和双链双链DNA Oligo连接反应体系

  试剂 阳性对照(μl) 自连对照(μl) 连接组(μl)  线性化的载体DNA(100ng/μl)  1.0  1.0  1.0  退火的双链DNA Oligo(100ng/μl)  1.0  1.0

  10×T4噬菌体DNA连接酶缓冲液  1.0  1.0  1.0  T4噬菌体DNA连接酶  1.0  1.0  1.0  ddH₂O  16.0  17.0  16.0  Total  20.0  20.0  20.0

表6-1PCR反应体系

  试剂 体积(μl)  10×buffer  2.0  dNTPs(2.5mM)  0.8  上游引物  0.4  下游引物  0.4  Taq聚合酶  0.2  模板  1.0  ddH₂O  15.2  Total  20.0

表6-2PCR反应体系程序设定

2.慢病毒KLF8-siRNA-N的构建

以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取RNAi质粒P-KLF8-siRNA-N的DNA，配制成100ng/μl质粒DNA储存液。转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的人胚肾细胞株293T细胞，以含10％胎牛血清的DMEM完全培养基调整细胞密度为1.5×10⁵细胞/ml，接种于6孔板，37℃，5％CO₂培养箱内培养。待细胞密度达70％-80％时即可用于转染。转染前2h，吸出原有培养基，加入1.5ml新鲜的完全培养基。按照Sigma-aldrich公司的MISSION LentiviralPackaging Mix试剂盒的说明，向一灭菌离心管中加入Packing Mix(PVM)20μl，PEI 12μl，无血清DMEM培养基400μl，取20μl上述抽提的质粒DNA，加至上述PVM/PEI/DMEM混合液。将上述转染混和物在室温下孵育15min，转移至人胚肾细胞株293T细胞的培养基中，37℃，5％CO₂培养箱内培养16h。弃去含有转染混和物的培养介质，PBS溶液洗涤，加入完全培养基2ml，继续培养48h。收集细胞上清液，通过Centricon Plus-20离心超滤装置(Millipore)纯化和浓缩慢病毒，步骤如下：(1)4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；(2)0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；(3)4000g离心，10-15min，至需要的病毒浓缩体积；(4)离心结束后，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开，将过滤杯倒扣在样品收集杯上，离心2min离心力不超过1000g；(5)把离心杯从样品收集杯上移开，样品收集杯中的即为病毒浓缩液。将病毒浓缩液分装后于-80度保存。病毒浓缩液中含有的siRNA序列为SEQ ID NO：20。对照慢病毒(Scr-siRNA)包装和纯化方法同KLF8-siRNA-N慢病毒，仅以pGCSIL-GFP-Scr-siRNA载体代替P-KLF8-siRNA-N载体。

实施例2：实时荧光定量RT-PCR法检测KLF8基因的沉默效率。

处于对数生长期的人胰腺癌Panc-1细胞、胃癌SGC7901细胞和胶质瘤U251细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为5×104/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30％。根据感染复数(MOI)值，加入适宜量的KLF8-siRNA-N慢病毒(Panc-1的MOI＝15，SGC7901的MOI＝20，U251的MOI＝10)，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到5天后，收集细胞。根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书，抽提总RNA。根据Promega公司的M-MLV操作说明书，将RNA逆转录获得cDNA。反应体系11μl，各管分别含逆转录缓冲液(5×)4.0μl，dNTPs(10mM)2μl，RNasin 0.5μl，M-MLV-RTase 1.0μl，DEPC水3.5μl，42℃反应1h，然后在70℃水浴锅中水浴10min，使逆转录酶失活。

采用TP800型Real time PCR仪(TAKARA)进行定量检测。KLF8基因的引物序列如下：上游引物5’-TTCAGAAGGTGGCTCAATGC-3’(SEQ ID NO：24)和下游引物5’-GGAGTGTTGGAGAAGTCATATTAC-3’(SEQ ID NO：25)。以管家基因GAPDH为内参，引物序列如下：上游引物5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’(SEQ ID NO：26)和下游引物5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’。(SEQ ID NO：27)反应体系20μl，各管分别含cDNA 1.0μl，KLF8(或GAPDH)上游、下游引物各0.5μl，SYBR premix ex taq TM10μl，ddH2O 8.0μl。反应参数：95℃预变性15s；之后95℃变性5s，60℃退火延伸30s，共进行45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。PCR结束后，95℃变性1min，然后冷却至55℃，使DNA双链充分结合。从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持4s，同时读取吸光值，制作熔解曲线。采用2-ΔΔCt分析法计算侵染了KLF8mRNA的表达丰度。

对照组Scr-siRNA慢病毒的侵染、培养和检测方法同KLF8-siRNA-N慢病毒。

实验结果如图2所示，人胰腺癌Panc-1细胞、胃癌SGC7901细胞和胶质瘤U251细胞中，KLF8-siRNA-N慢病毒侵染组中KLF8mRNA表达水平与对照组相比分别下降了71.0、72.8和83.0％。

实施例3：检测侵染KLF8-siRNA-N慢病毒的肿瘤细胞的增殖能力

处于对数生长期的人胰腺癌Panc-1细胞、胃癌SGC7901细胞、和胶质瘤U251细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为5×104/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30％。根据感染复数(MOI)值(Panc-1的MOI＝15，SGC7901的MOI＝20，U251的MOI＝10)，加入适宜量的KLF8-siRNA-N病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到5天后，收集细胞。完全培养基重悬成细胞悬液(2×10⁴/ml)，以细胞密度约为2000个/孔，接种96孔板。每组5个复孔，每孔100μl。铺好板后，置37℃、5％CO2培养箱培养。从铺板后第二天开始，每天用Cellomics ArrayScan VTI高内涵筛选分析仪(Thermo Scientific)读板一次，连续读板5天。对照组Scr-siRNA慢病毒的侵染、培养和检测方法同KLF8-siRNA-N慢病毒。

通过调整Cellomics仪的输入参数，准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量，对数据进行统计绘图，分别绘出人胰腺癌Panc-1细胞、胃癌SGC7901细胞和、胶质瘤U251细胞的增殖曲线对比图，如图3、图4和图5所示。结果表明，KLF8-siRNA-N慢病毒侵染组各肿瘤在细胞体外培养5天后，增殖速度显著减缓，远低于对照组肿瘤细胞的增殖速度，活力细胞数目分别下降了611％、90.1％和78.7％，表明KLF8基因沉默导致肿瘤细胞增殖能力被抑制。

实施例4：肿瘤细胞中KLF8基因过表达的试验

组织样本：人肺癌，胃癌，胰腺癌的组织样本

抗体：购自Sigma公司

试验方法：

取出组织芯片，将组织芯片在60℃恒温箱中烘烤30分钟。然后对组织芯片脱蜡，脱蜡过程为：二甲苯15分钟，二甲苯∶乙醇＝1∶1混液中，无水乙醇中，95％乙醇中，85％乙醇中，75％乙醇中，蒸馏水中依次浸泡10分钟；然后用蒸馏水或PBS配置新鲜的3％H₂O₂，室温封闭10分钟；抗原修复在微波炉里高火加热0.01M柠檬酸钠缓冲溶液(pH6.0)至沸腾后将组织芯片放入，低火维持20分钟；自然冷却至室温后，置入蒸馏水中浸泡10分钟；10％血清(TBS配制)封闭30分钟；吸弃血清，勿洗加入klf8抗体(1∶100稀释)孵育过夜；TBS洗2遍，每次5分钟；加入HRP标记的羊抗兔二抗，室温孵育60分钟；TBS洗4遍，每次5分钟；加入DAB染色，直到显浅黄色为止，放入蒸馏水中终止反应；用苏木浸30秒，清水漂洗7-8遍；脱水封片，于75％乙醇，85％乙醇，95％乙醇，无水乙醇，二甲苯∶乙醇＝1∶1混液，二甲苯中，依次浸置5分钟；取出后，滴加30ul中性树胶，用盖玻片封片，晾干，观察结果，拍照，结果如图6所示。

结果表明：

使用KLF8抗体对不同肿瘤组织进行免疫组化表达检测，结果发现，在人肺癌，胃癌，胰腺癌的组织样本中，都能发现klf8基因编码蛋白的高表达。图中深灰色代表表达阳性。基于此实验结果，认为可通过检测组织细胞klf8基因的表达来辅助诊断癌症。