一种基于聚苯胺纳米金复合膜免疫传感器的制备方法及其应用

摘要

本发明涉及一种基于聚苯胺纳米金复合膜免疫传感器的制备方法及其应用，通过制备聚苯胺纳米金复合膜，提高了材料自身传导性，并成功应用于免疫传感器中，极大的降低了传感器的检测限并获得了更好的稳定性，采用循环伏安法及交流阻抗法对传感器进行表征与测定，建立了金黄色葡萄球菌肠毒素B检测标准曲线，线性范围在0.1～8ng/ml之间，相关系数为R2＝0.9932，检测限为0.033ng/ml(S/N＝3)。本发明特异性良好，乳品检测回收率在84～111％之间，可再生使用，稳定性好，可应用于乳品中的金黄色葡萄球菌肠毒素B快速检测，具有非常广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于聚苯胺纳米金复合膜免疫传感器的制备方法及其应用，本发明属于 乳品质量检测技术领域。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种广泛存在于自然界的革兰氏阳性球菌。金 黄色葡萄球菌的致病能力主要取决于其产肠毒素和酶的能力。金黄色葡萄球菌肠毒素 (staphylococcal enterotoxin简称SE)，是金黄色葡萄球菌分泌的一种细胞外毒素，是一组结构 相关，毒力相近的单肽链毒性蛋白质。按血清学分类，主要有A、B、Cs、D、E等血清型，主 要存在于肉类，乳类等蛋白质含量较高的食物中。Ses热稳定性高，在70～80℃30min内不 会被完全破坏，仍有致病性，并且不被胰蛋白酶所降解。

金黄色葡萄球菌肠毒素最初采用的检测方法就是动物学试验方法，但是由于实验动物的 来源较困难，而灵敏度又比较低，致使检测结果不是很理想。酶联免疫法的基础是抗原或抗 体的固相化及抗原或抗体的酶标记。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果， 使测定方法达到很高的灵敏度。酶联免疫法灵敏、简单、快速，并且，技术人员不需要特别 训练，适用于葡萄球菌食物中毒的检测和鉴定。研究的比较多的是双抗体夹心法和间接竞争 法，其最低检测量能够达到1ng/ml，且线性范围良好。酶联免疫方法效果的优劣很大部分取 决于抗体的制备。

90年代以来，以生物传感器技术为基础的各类生物检测系统迅速兴起，一些快速和采用 现代技术的检测方法不断出现，并日趋成熟，不断的应用于各类毒素的检测中去。利用表面 等离子体共振(SPR)传感技术针对葡萄球菌肠毒素的检测最为常见的监测对象是抗原/抗体 的相互识别过程，抗原抗体反应特异性强，灵敏度高，重复性好，响应时间往往在十几分钟 左右。利用SPR技术对葡萄球菌肠毒素B进行测定，其检出限可达到ng/ml级，响应时间 10min左右。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测金黄色葡萄球菌肠毒素的免疫传感器的制备方法。

本发明提供如下技术方案：将聚苯胺纳米金液体滴涂于经过清洁的金电极表面，室温下 静置，待修饰完全后，在修饰好的电极表面上滴加金黄色葡萄球菌肠毒素B抗体，孵育20～ 100min，以BSA-PBS封闭20～140Min，制得基于聚苯胺修饰纳米金自组装免疫传感器。

所述金黄色葡萄球菌肠毒素B抗体为市场上购买或制备得到，制备方法见Jeremy M. Yarwood，John K.McCormick，Michael L.Paustian，Vivek Kapur，and Patrick M.Schlievert， Repression of the Staphylococcus aureus Accessory Gene Regulator in Serum and In Vivo， JOURNAL OF BACTERIOLOGY，Feb.2002，p.1095-1101。

所述聚苯胺纳米金液体是将HAuCl₄溶解于水中，待其沸腾，加入柠檬酸钠溶液，反应 5-15min后，依次加入氢氧化钠溶液、苯胺溶液、过硫酸钠溶液，搅拌条件下沸腾20-50min， 停止加热，搅拌至室温。

优选地，所述聚苯胺纳米金液体制备方法如下：将250μL 4％的HAuCl₄溶解于100mL水 中，待其沸腾，加入800μL 4％的柠檬酸钠，反应8min后，依次加入0.2molL^-1的氢氧化钠 溶液1200μL、0.1molL^-1的苯胺溶液1000μL、0.1molL^-1的过硫酸钠溶液1500μL，搅拌条件 下沸腾30min，停止加热，搅拌至室温。

优选地，金电极清洁方法如下：将金电极(Φ＝2mm)置于Piranha溶液中浸泡15Min，依次 用0.3，0.05μm的Al₂O₃抛光粉将电极表面抛成镜面，再用再用1∶1(体积比)的硝酸、无水乙醇、 超纯水超声清洗5min，氮气吹干，4℃备用；

优选地，在修饰好的电极表面上滴加10ul 200～900ug/ml金黄色葡萄球菌肠毒素B抗体， 37℃孵育20～100min，以1％BSA-PBS37℃下封闭20～140Min，制得基于聚苯胺修饰纳米金 自组装免疫传感器。

上述抗体浓度为700ug/ml时，材料所结合的抗体达到饱和状态，若抗体浓度过高，则会 造成抗体的浪费；上述抗体孵育时间为60min，当抗体浓度为60min时，抗体能够最大程度 的结合在材料上；所述的封闭时间为120min，当封闭时间达到120min时，1％BSA-PBS能够 较好的封闭住抗体的未结合位点。

本发明还提供了一种所述免疫传感器的应用，步骤如下：取出已修饰完成的金黄色葡萄 球菌肠毒素B免疫电极，依次滴加10μL不同浓度的金黄色葡萄球菌肠毒素B标准品37℃孵 育5～30min后，采用循环伏安法和交流阻抗法考察工作电极界面的变化，并对电极表进行 表征。

CV测试条件：电压0.2-0.6V，扫描速率0.1V/s；EIS测试条件：初幅0.05V， 频率为1～100kHz，静置时间2s。反应介质液为2.5mmolFe(CN)₆^3-/4-溶液(所有测试均在室 温下进行)。

所述的金黄色葡萄球菌肠毒素B标准品孵育时间为5～30min，优选地，所述的金黄色葡 萄球菌肠毒素B标准品孵育时间为25min，当孵育时间达到25min时，金黄色葡萄球菌肠毒 素B抗体能够充分与金黄色葡萄球菌肠毒素B标准品反应。

所述依次滴加的不同浓度的金黄色葡萄球菌肠毒素B标准品的浓度为0.1、0.5、1、2、3、 4、5、6、7、8ng/ml，模拟电路得到阻抗值，以金黄色葡萄球菌肠毒素B标准品浓度为横坐 标，阻抗值的大小为纵坐标作图，得到金黄色葡萄球菌肠毒素B自组装免疫电极检测的标准 曲线。阻抗值的大小与金黄色葡萄球菌肠毒素B标准品的浓度分别在0.1～8ng/ml之间存在 良好的线性关系，线性方程分别为Y＝1262.2x+1540.8，相关系数分别为R²＝0.9932，最低检 测限为0.033ng/ml。

金黄色葡萄球菌肠毒素B的分析方法如下：电化学工作站CHI760在初幅0.05V，频率 为1～100kHz的条件下，在反应介质液为2.5mmolFe(CN)₆^3-/4-溶液中进行测量，采用EIS法， 并通过最佳等效电路计算，以工作电极经BSA封闭后的阻抗值作为空白交流阻抗值R_et(Ab)， 以此电极与含有不同浓度金黄色葡萄球菌肠毒素B标准品中反应后在同一电解液中所测阻抗 值为R_et(Ab-Ag)，求出在不同金黄色葡萄球菌肠毒素B标准品浓度中R_et的变化值ΔR_et：

ΔR_et＝R_et(Ab-Ag)-R_et(Ab)

R_et(Ab)：空白交流阻抗值；

R_et(Ab-Ag)：与金黄色葡萄球菌肠毒素B标准品反应后的电极电子传递电阻值；

ΔR_et：反应前后极电子传递电阻的变化值；

以电子传递电阻的变化值和金黄色葡萄球菌肠毒素B标准溶液浓度的关系作图，即得金 黄色葡萄球菌肠毒素B免疫传感器的检测标准曲线。

金黄色葡萄球菌肠毒素B的回收率：

将样品以PBS(PH＝7.4)稀释至一定浓度后，应用自组装免疫传感器对样品进行加标回 收测定。

本发明的方法具有下述有益效果：

(1)聚苯胺纳米金复合膜结构改善了纳米金离子的分散性，有效的阻止了金的聚合， 从而使其分散的更为均匀。

(2)聚苯胺纳米金复合膜结构有效的促进了电子的转移，进而有效的提高材料本身的 传导性，大大降低了检测限。

(3)自组装免疫传感器能够结合多种材料的优点，充分发挥抗原抗体特异性结合的优 势，极大的降低检测限。

附图说明

图1表示自组装免疫传感器的组装示意图。

具体实施方式

实施例1：免疫传感器的制备方法

步骤A：将250μL 4％的HAuCl₄溶解于100mL水中，待其沸腾，加入800μL 4％的柠檬 酸钠，反应8min后，依次加入0.2molL^-1的氢氧化钠溶液1200μL、0.1molL^-1的苯胺溶液 1000μL、0.1molL^-1的过硫酸钠溶液1500μL，搅拌条件下沸腾30min，停止加热，搅拌至室 温；

步骤B：将金电极(Φ＝2mm)置于Piranha溶液中浸泡15Min，依次用0.3，0.05μm的Al₂O₃抛光粉将电极表面抛成镜面，再用再用1∶1(体积比)的硝酸、无水乙醇、超纯水超声清洗5min， 氮气吹干，4℃备用；

步骤C：将步骤A得到的聚苯胺纳米金液体滴涂于步骤B中彻底清洁的金电极表面，室 温下静置，待修饰完全后，在修饰好的电极表面上滴加10ul 700ug/ml金黄色葡萄球菌肠毒素 B抗体，37℃孵育60min，以1％BSA-PBS37℃下封闭120Min，制得基于聚苯胺修饰纳米金自 组装免疫传感器。

实施例2：免疫传感器的制备方法

步骤A：将250μL 4％的HAuCl₄溶解于100mL水中，待其沸腾，加入800μL 4％的柠檬 酸钠，反应8min后，依次加入0.2molL^-1的氢氧化钠溶液1200μL、0.1molL^-1的苯胺溶液 1000μL、0.1molL^-1的过硫酸钠溶液1500μL，搅拌条件下沸腾30min，停止加热，搅拌至室 温；

步骤B：将金电极(Φ＝2mm)置于Piranha溶液中浸泡15Min，依次用0.3，0.05μm的Al₂O₃抛光粉将电极表面抛成镜面，再用再用1∶1(体积比)的硝酸、无水乙醇、超纯水超声清洗5min， 氮气吹干，4℃备用；

步骤C：将步骤A得到的聚苯胺纳米金液体滴涂于步骤B中彻底清洁的金电极表面，室 温下静置，待修饰完全后，在修饰好的电极表面上滴加10ul 200ug/ml金黄色葡萄球菌肠毒素 B抗体，37℃孵育20min，以1％BSA-PBS37℃下封闭20Min，制得基于聚苯胺修饰纳米金自 组装免疫传感器。

实施例3：免疫传感器的制备方法

步骤A：将250μL 4％的HAuCl₄溶解于100mL水中，待其沸腾，加入800μL 4％的柠檬 酸钠，反应8min后，依次加入0.2molL^-1的氢氧化钠溶液1200μL、0.1molL^-1的苯胺溶液 1000μL、0.1molL^-1的过硫酸钠溶液1500μL，搅拌条件下沸腾30min，停止加热，搅拌至室 温；

步骤B：将金电极(Φ＝2mm)置于Piranha溶液中浸泡15Min，依次用0.3，0.05μm的Al₂O₃抛光粉将电极表面抛成镜面，再用再用1∶1(体积比)的硝酸、无水乙醇、超纯水超声清洗5min， 氮气吹干，4℃备用；

步骤C：将步骤A得到的聚苯胺纳米金液体滴涂于步骤B中彻底清洁的金电极表面，室 温下静置，待修饰完全后，在修饰好的电极表面上滴加10ul 900ug/ml金黄色葡萄球菌肠毒素 B抗体，37℃孵育100min，以1％BSA-PBS37℃下封闭140Min，制得基于聚苯胺修饰纳米 金自组装免疫传感器。

实施例4：

取出已修饰完成的金黄色葡萄球菌肠毒素B免疫电极，依次滴加10μL不同浓度的金黄 色葡萄球菌肠毒素B标准品37℃孵育5～30min后，采用循环伏安法和交流阻抗法考察工作 电极界面的变化，并对电极表进行表征。

CV测试条件：电压0.2-0.6V，扫描速率0.1V/s；EIS测试条件：初幅0.05V， 频率为1～100kHz，静置时间2s。反应介质液为2.5mmolFe(CN)₆^3-/4-溶液(所有测试均在室 温下进行)。

所述的金黄色葡萄球菌肠毒素B标准品孵育时间为5～30min，优选地，所述的金黄色葡 萄球菌肠毒素B标准品孵育时间为25min，当孵育时间达到25min时，金黄色葡萄球菌肠毒 素B抗体能够充分与金黄色葡萄球菌肠毒素B标准品反应。

所述依次滴加的不同浓度的金黄色葡萄球菌肠毒素B标准品的浓度为0.1、0.5、1、2、3、 4、5、6、7、8ng/ml，模拟电路得到阻抗值，以金黄色葡萄球菌肠毒素B标准品浓度为横坐 标，阻抗值的大小为纵坐标作图，得到金黄色葡萄球菌肠毒素B自组装免疫电极检测的标准 曲线。阻抗值的大小与金黄色葡萄球菌肠毒素B标准品的浓度分别在0.1～8ng/ml之间存在 良好的线性关系，线性方程分别为Y＝1262.2x+1540.8，相关系数分别为R²＝0.9932，最低检 测限为0.033ng/ml。

金黄色葡萄球菌肠毒素B的分析方法如下：电化学工作站CHI760在初幅0.05V，频率 为1～100kHz的条件下，在反应介质液为2.5mmolFe(CN)₆^3-/4-溶液中进行测量，采用EIS法， 并通过最佳等效电路计算，以工作电极经BSA封闭后的阻抗值作为空白交流阻抗值R_et(Ab)， 以此电极与含有不同浓度金黄色葡萄球菌肠毒素B标准品中反应后在同一电解液中所测阻抗 值为R_et(Ab-Ag)，求出在不同金黄色葡萄球菌肠毒素B标准品浓度中R_et的变化值ΔR_et：

ΔR_et＝R_et(Ab-Ag)-R_et(Ab)

R_et(Ab)：空白交流阻抗值；

R_et(Ab-Ag)：与金黄色葡萄球菌肠毒素B标准品反应后的电极电子传递电阻值；

ΔR_et：反应前后极电子传递电阻的变化值；

以电子传递电阻的变化值和金黄色葡萄球菌肠毒素B标准溶液浓度的关系作图，即得金 黄色葡萄球菌肠毒素B免疫传感器的检测标准曲线。

金黄色葡萄球菌肠毒素B的回收率：

将样品以PBS(PH＝7.4)稀释至一定浓度后，应用自组装免疫传感器对样品进行加标回 收测定。

根据上述测定方法与分析方法得到脱脂乳粉在4ng/ml的加标浓度下的回收率为92％。

实施例5：

根据实施例4测定方法与分析方法得到脱脂乳在0.5ng/ml的加标浓度下的回收率为84％。

实施例6：

根据实施例4测定方法与分析方法得到鲜牛乳在4ng/ml的加标浓度下的回收率为111％。