包含羟基氯喹的用于抗癌治疗的局部投药用注射剂组合物

摘要

本发明涉及一种包含羟基氯喹的用于抗癌治疗的局部投药用注射剂组合物，根据本发明的抗癌剂组合物，相对于在生物体外经过四甲基偶氮唑蓝显色分析法的肉瘤180的IC

说明书

技术领域

本发明涉及一种包含羟基氯喹(hydroxychloroquine)的抗癌剂组 合物，更详细地涉及作为将羟基氯喹用作主成分的局部投药用注射剂 组合物，直接注射到癌细胞来取得抗癌效果的制剂。

背景技术

肿瘤是细胞无限增殖而妨碍正常细胞的功能的疾病，根据病理组 织学及临床学的判断标准来分离成恶性肿瘤和阳性肿瘤，所谓的癌症 属于恶性肿瘤。

癌症目前占有韩国国内死亡原因第一位，全球上也独占死亡原因 的首位。癌症的发病原因或治疗方法尚未明确查清，迄今所开发的治 疗剂在临床上应用时存在致命的副作用、体现耐性、淋巴球及骨髓破 损等问题。因此，迫切需要开发出对于正常细胞不呈现活性，而只对 癌细胞呈现细胞毒性的新型抗癌剂。

目前，在人体内所发生的癌症大约有270多种，据报告，用于研 究这些癌症的细胞株有肉瘤(Sarcoma-180)、黑素瘤(melanoma)、腺 瘤(adenoma)、腺癌(adeno-carcinoma)、艾氏腹水瘤(Ehrlich ascites  tumor)及沃克癌(Walker carcinoma)等。据研究报道，其中，肉瘤-180 是来源于白色雄性老鼠的腋窝癌的肉瘤化的肿瘤，使其继代演变为腹 水癌而维持起来，以便能够相互容易地体现实体型和腹水型，移植时 没有种属特异性。

另一方面，羟基氯喹(hydroxychloroquine)目前应用于类风湿性 关节炎、盘状红斑狼疮、系统性红斑狼疮及光敏性皮肤病的治疗剂， 还应用于疟疾的治疗和预防，近来已报告关于肾损伤抑制及安全神经 胶质瘤的研究等。

在韩国专利授权第10-0390332号中已公开抗癌剂复合组合物，该 组合物通过将作为抗疟疾剂而常用的羟基氯喹、氯喹及伯氨喹等与作 为抗癌剂的阿霉素及顺铂等合并投用，来降低抗癌剂的最小有效浓度 (IC₅₀)，并能抑制因抗癌剂而导致的癌细胞的耐药性。其中，羟基氯 喹等的抗疟疾剂用作通过抑制抗癌剂的耐性来提高抗癌效果的辅助 剂，根据基于经口及非经口等抗癌剂的投药途径的全身性投药来呈现 效果。

即，迄今尚未报告羟基氯喹具有抗癌效果的研究结果，因此，也 查不到用作抗癌剂的主成分的例子。

发明内容

技术问题

本发明为了将羟基氯喹用作局部投药用抗癌剂，提供一种局部投 药用抗癌剂组合物，本发明将尤其对正常细胞不呈现活性，而只对癌 细胞呈现细胞毒性的抗癌剂组合物直接注射或注入到癌细胞。

解决问题的手段

为了实现上述目的，本发明提供一种包含羟基氯喹 (hydroxychloroquine)或其盐的用于抗癌治疗的局部投药用注射剂组 合物。

优选地，本发明的抗癌剂组合物能够直接注射或注入到癌细胞， 还包含利多卡因等局部麻醉剂和/或核黄素等抗氧化剂。

本发明通过向癌细胞直接注射或注入将羟基氯喹用作主成分的组 合物的局部投药来发挥抗癌效果。将含有羟基氯喹的局部投药用组合 物直接投用在患处来使局部组织硬化，从而将会阻断代谢。癌细胞相 比正常细胞代谢快速，因此如果通过羟基氯喹来阻断代谢，组织则会 惰性化，最终引发组织的坏死。

在本发明的组合物中，羟基氯喹的含量优选为5～25％(w/v)，更 优选为20～25％(w/v)。如果羟基氯喹的含量低于5％(w/v)，则难以 期待治疗效果，如果高于25％(w/v)，则会引发癌细胞周边的正常组 织的坏死也一同发生的副作用，因此并不优选。

在根据本发明的局部投药用注射剂组合物中，局部麻醉剂通过注 射方式直接投用到癌细胞时，以去除疼痛为目的而使用，优选地使用 1～2％(w/v)浓度的利多卡因。并且，抗氧化剂为了制剂稳定性而进 行调配，优选地使用0.1～0.5％(w/v)浓度的核黄素。

并且，鉴于羟基氯喹相对于水的溶解性，能够使用羟基氯喹的盐， 尤其是优选使用硫酸盐。

根据本发明的用于抗癌治疗的局部投药用注射剂组合物，能够通 过常用的注射剂制备方法来进行制备。

本发明的用于抗癌治疗的局部投药用注射剂组合物，优选地，直 接注射或注入到癌细胞，根据患者的状态，以3～4天为间隔，能够反 复投用几周，根据癌细胞的大小和发展状态，以1～2为间隔，反复投 用，由此能够抑制癌细胞的增殖及细胞代谢，来在短时间内使癌细胞 硬化而惰性化。

附图说明

图1是将通过四甲基偶氮唑蓝显色分析法(MTT assay)来获得的 影响肉瘤(sarcoma)180细胞株的生长的本发明组合物的效果与对照 药物进行比较而表示的图表。

图2是将给美国癌症研究所(ICR：Institute of Cancer  Researcch)老鼠的肉瘤(sarcoma)180细胞株的分化带来影响的本发 明组合物的效果与对照药物的效果(删除)进行比较而表示的图表。

图3是表示影响美国癌症研究所(ICR：Institute of Cancer  Researcch)老鼠的肉瘤(sarcoma)180细胞株实体癌的生长的本发明 组合物的效果的图表。

图4是表示诱发美国癌症研究所(ICR：Institute of Cancer  Researcch)老鼠的肉瘤180细胞株腹水癌后影响本发明组合物的寿命 延长的效果的图表。

具体实施方式

以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明。但是，这些实施 例只作为本发明的一个例子，并不说明本发明的范围仅限于此。

实验方法

(1)投药

在实验中使用的本发明的抗癌剂组合物制备成直接注射或注入到 癌细胞的局部投药用制剂。具体而言，在注射用生理盐水中添加20％ (w/v)浓度的羟基氯喹，作为溶解辅助剂添加占调配容量的10～20％ 的20％乙醇，在水浴箱中加热溶解之后，添加2％(w/v)浓度的利多 卡因及0.1％(w/v)浓度的核黄素来进行制备。

用作阳性对照药的顺铂(cisplatin)是从西格玛公司(USA)购买 使用的。

(2)癌细胞株

在本实施例中使用的癌细胞株为肉瘤(Sarcoma)180(KCLB 4066)，是由韩国细胞株库出售的。

作为针对细胞株的细胞培养基，使用添加有10％特级胎牛血清 (FBS：fetal bovine serum)的罗斯威尔公园纪念研究所(RPMI 1640) 培养基，在该培养基中添加链霉素(100μl/Ml)和青霉素(100μl/Ml)。

在37℃、5％CO2培养器中，对肉瘤(sarcoma)180细胞株进行 48小时继代培养之后将其用于实验。

为了进行动物实验，将肉瘤(sarcoma)180细胞株制备成以 2×10⁷cells/Ml浓度注入到ICR老鼠腹腔内，采取经过约两周后所获得的 腹水来反复清洗两次在2000rpm下离心分离的沉淀液之后，用0.4％蓝 色胰蛋白酶来染色而使其达到2×10⁷cells/Ml。

(3)实验动物

购买生后5周龄的ICR系实验用老鼠，使它适应一周之后用于实 验。动物的饲养条件为如下：室内温度22±2℃，相对湿度维持为50％， 以12小时为周期，调节照明来体现日夜。

效果试验例1.测定肉瘤(sarcoma)180中的细胞毒性

为了评价本发明的组合物带给细胞毒性的影响，使用了MTT assay。MTT assay是用于测定细胞的生存率的实验室试验法，可称为 标准比色分析法(standard colorimetric assay)。作为能够正确地测定 细胞的增殖和活细胞的方法的MTT assay是生命科学领域，尤其是肿 瘤生物学中必需的方法之一。为了检索用于开发新型抗癌剂的效能或 者查看以往开发的抗癌剂的灵敏度，在应用于实验动物等生体之前， 应该预先进行客观上证明药物在生体外抑制肿瘤细胞的生长的过程。

将以1×10⁵cells/Ml稀释的肉瘤(sarcoma)180细胞株添加在96- 孔板的各个板，在37℃、5％CO₂培养器(incubator)中，对菌株进行 24小时培养。经过24小时培养之后，将本发明组合物的浓度从1.0μl 至0μl稀释成总共8种浓度，然后添加到各个孔中，通过相同的方法 稀释顺铂之后添加到孔中。

之后，在37℃、5％CO₂培养器(incubator)中，重新进行24小 时培养，并添加50μl的2mg/Ml MTT(四甲基偶氮唑蓝)试剂之后， 在37℃的培养器中放置4小时。

利用离心分离器来去除上清液，往各个孔分别添加200μl的二甲 基亚砜(DMSO)，使得MTT染色沉淀物溶解之后，在540nm波长中， 用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测仪来测定OD₅₄₀值。

将50％抑制浓度(IC₅₀)定义为使生存率达到50％的药物的浓度， 并将IC₅₀值用作抗癌效果的指标。

图1是将通过四甲基偶氮唑蓝显色分析法(MTT assay)来获得的 影响肉瘤(sarcoma)180细胞株的生长的本发明组合物的效果与对照 药物进行比较而表示的图表。

如图1所示，以2×10⁷cell/Ml的浓度接种肉瘤(sarcoma)180细胞 株悬浮液之后，与作为对照药物的顺铂比较抗癌能力的结果表明，顺 铂的IC₅₀值为0.1μg/Ml，本发明组合物的IC₅₀值为0.01μl以下。

即，本发明组合物相对于在生物体外经过四甲基偶氮唑蓝显色分 析法(MTT assay)的肉瘤(sarcoma)180的IC₅₀值，呈现相比顺铂低 10倍左右的值，由此被判断为具有优良的细胞毒性效果。

效果试验例2.癌细胞分化抑制效果

为了观察本发明组合物在ICR老鼠中呈现的抗癌能力，接种肉瘤 (sarcoma)180之后，评价了带给肉瘤(sarcoma)180的分化的影响。

按照下表1，将适合于饲养设施的动物分为总共6个组(G1～G6)， 然后给每个组分配12只的动物而使用。下表1表示实验组设定及投药 浓度。

表1

将以2×10⁷cell/Ml的浓度制备的肉瘤(sarcoma)180细胞悬浮液， 通过皮下注射方式，移植到除了正常组之外的所有组的一侧腹股沟区 来诱发实体癌。将本发明组合物分别设定为低容量(16.6μl/体重kg)、 中间容量(83.3μl/体重kg)及高容量(166.6μl/体重kg)，诱发腹水 癌之后，立刻以三天为间隔，投药6周，同时评价带给癌细胞株的培 植及分化的影响，并与顺铂进行比较。

通过实验结束日检尸来测定肉瘤(sarcoma)180稳定生长的动物 的数目，同样的实验进行两次之后取下平均值而定抗癌指标。

图2是将给ICR老鼠的肉瘤(sarcoma)180细胞株的分化带来影 响的本发明组合物的效果与对照药物进行比较而表示的图表。其中，L 表示本发明组合物的低容量，M表示中间容量，H表示高容量，cis表 示顺铂，N和C分别表示正常组和对照组。

如图2所示，试验结束后，通过检尸来确认腹股沟区的癌细胞有 无的结果表明，本发明组合物的低容量组在9.5只中发现了肿瘤，而中 间容量组及高容量组分别在7.5只中发现了肿瘤，作为对照药物的顺 铂，在4.5只中观察到了肿瘤细胞。

即，根据本发明的组合物，虽然针对癌细胞分化的抑制效果相比 对照组有所增加，但未取得与顺铂同等以上的效果。如上所述，之所 以本发明组合物在生物体内和体外呈现的有效性不同，是因为受到羟 基氯喹在常温下不溶解而导致的药物的限制性扩散距离的影响。

效果试验例3.针对实体癌的抗癌效果

为了观察本发明组合物在ICR老鼠中呈现的抗癌能力，通过接种 肉瘤(sarcoma)180来诱发实体癌之后，评价了带给肉瘤(sarcoma) 180的坏死的影响。

按照下表2，将适合于饲养设施的动物分为总共4个组(G1～G4)， 然后给每个组分配10只的动物而使用。下表2表示实验组设定及投药 浓度。

表2

将以2×10⁷cell/Ml的浓度制备的肉瘤(sarcoma)180细胞悬浮液， 通过皮下注射方式，移植到所有组的一侧腹股沟区来诱发实体癌。将 本发明组合物分别设定为表2的浓度，移植癌细胞株，经过一周后， 以每周两次、三天为间隔，投药6周，同时观察了诱发程度。

按照抗癌指标进行了通过实验结束日检尸的肉眼观察，并测定了 肿瘤的平均重量。

图3是表示影响ICR老鼠的肉瘤(sarcoma)180细胞株实体癌的 生长的本发明组合物的效果的图表。其中，G1表示对照组，G2表示将 本发明组合物(20％)以83μl/体重kg的量投用的情况，G3表示以166 μl/体重kg的量投用本发明组合物(20％)的情况以及G4表示以415 μl/体重kg的量投用本发明组合物(20％)的情况。

通过实验结果，就未投药的对照组而言，平均肿瘤细胞的重量为 4.81±1.69g，相反，在本发明组合物(20％)投药组中，就G2组而言， 平均肿瘤细胞的重量为4.16±1.68g，G3组的平均肿瘤细胞的重量为 3.92±1.00g，G4组的平均肿瘤细胞的重量为3.31±0.72g，由此可知实 体癌的重量以容量依赖性方式减少。

效果试验例4.观察针对腹水癌的抗癌效果

评价了本发明组合物在通过肉瘤(sarcoma)180细胞株移植而诱 发腹水癌的老鼠中呈现的抗癌效果及带给寿命延长的影响。

按照下表3，将适合于饲养设施的动物分为总共3个组(G1～G3)， 然后给每个组分配10只的动物而使用。下表3表示实验组设定及投药 浓度。

表3

将以2×10⁷cell/Ml的浓度制备的肉瘤(sarcoma)180细胞悬浮液， 接种在所有组的腹腔内，来诱发腹水癌。将本发明组合物分别设定为 表3的浓度，诱发腹水癌之后，以3天为间隔，投药6周，同时观察 动物死亡趋势，并与顺铂进行比较。

图4是表示诱发ICR老鼠的肉瘤(sarcoma)180细胞株腹水癌后 影响本发明组合物的寿命延长的效果的图表。其中，G1表示对照组， G2表示以166μl/体重kg的量投用本发明组合物的情况，G3表示以 830μl/体重kg的量投用本发明组合物的情况。

截止到作为实验结束日的第42天为止，察看基于腹水癌的死亡 率，就对照组而言，试验开始后，第9天开始出现动物死亡，第21天 共死了一半左右，第42天只剩下一只，但是这只动物将被判断为未诱 发腹水癌或者诱发程度甚微的动物。在G2组中，死亡进展相比对照组 稍微延迟，即第13天开始出现动物死亡，第26天共死了一半左右， 但试验结束日当天为止生存了3只。相反，在G3组中，投药当天所有 动物全部死亡。即，这说明了本发明组合物有助于针对腹水癌的寿命 延长。

产业上的可利用性

根据本发明的包含羟基氯喹的局部投药用注射剂组合物，相对于 在生物体外经过四甲基偶氮唑蓝显色分析法(MTT assay)的肉瘤 (sarcoma)180的IC₅₀值，呈现相比顺铂低10倍左右的值，由此具有 优良的细胞毒性效果，并且，在生物体内不仅针对因肉瘤(sarcoma) 80而诱发的实体癌呈现容量依赖性效果，而且针对因肉瘤(sarcoma) 80而诱发的腹水癌呈现延长寿命的效果。